Em formação

Quais são os fatores limitantes para o comprimento do íntron?


Para prever genes de um genoma sequenciado, você precisa definir um comprimento máximo do intron. Quanto tempo os íntrons podem ficar nos animais? Existe algum limite?


Acho que os valores acima (500-750 kb) estão errados. http://www.bioinfo.de/isb/2004040032/ mostra que a maioria dos íntrons tem menos de cerca de 10 kb (e a experiência pessoal em Drosophila confirma que - eu raramente visto um intron maior do que cerca de 5 kb). Existem alguns muito grandes, mas como é quase impossível detectar a reação de splicing, especialmente se eles forem muito grandes, não está claro se eles são emendados como um íntron BIG ou em vez disso são emendados recursivamente (em pequenos passos, como em http : //www.genetics.org/content/170/2/661.full.pdf+html). Acho que é seguro dizer que não sabemos quanto tempo os maiores íntrons podem ter.


Se você examinar o genoma humano, ~ 99% dos íntrons estão abaixo de 500 kb. Eu presumiria que um limite entre 250 kb - 500 kb é razoável para a previsão do gene. Você pode predizer incorretamente a estrutura adequada de um pequeno número de genes que têm esses íntrons muito grandes, mas esse deve ser um número pequeno. Além disso, os alinhadores de sequência mais populares tendem a definir um limite de comprimento do íntron entre 500 kb e 750 kb.

Lembre-se de que você pode aumentar o número de íntrons falsos positivos detectados se definir esse limite como alto. Portanto, pode valer a pena tentar algumas configurações e avaliar os resultados.

EDITAR:

Meu palpite é que íntrons maiores são restritos em mamíferos por duas razões

  1. Eles são mais difíceis de serem extirpados adequadamente pelo spliceossomo. O spliceosome pode ter montagem reduzida nos locais de emenda 5 '/ 3' adequados e no local do ponto de ramificação. Também há uma chance maior de que haja sites de splice criptográficos / chamariz dentro do intron.
  2. Eles aumentam o tempo que leva para transcrever o gene

Padrões e taxas de divergência de íntron entre humanos e chimpanzés

Os íntrons, que constituem a maior fração dos genes eucarióticos e que foram considerados sequências neutras, são cada vez mais reconhecidos como tendo funções importantes. Vários estudos investigaram os níveis de restrição evolutiva ao longo dos íntrons e entre classes de íntrons de diferentes comprimentos e localizações dentro dos genes. No entanto, até agora, esses estudos produziram resultados contraditórios.

Resultados

Apresentamos a primeira análise da divergência intrônica entre humanos e chimpanzés, na qual as diferenças no número de substituições por sítio intrônico (Keu) pode ser interpretado como a pegada de diferentes intensidades e direções das pressões da seleção natural. Nossos principais achados são os seguintes: houve uma forte correlação positiva entre o comprimento do íntron e a divergência, havia uma forte correlação negativa entre o comprimento do íntron e o conteúdo de GC e as taxas de divergência variam ao longo dos íntrons e dependendo de sua posição ordinal dentro dos genes (por exemplo, primeiros íntrons são mais ricos em GC, mais longos e mais divergentes, e a divergência é menor nas extremidades 3 'e 5' de todos os tipos de íntrons).

Conclusão

Mostramos que a maior divergência dos primeiros íntrons está relacionada ao seu maior tamanho. Além disso, a divergência mais baixa de íntrons curtos sugere que eles podem abrigar uma proporção relativamente maior de elementos reguladores do que íntrons longos. Além disso, nossos resultados são consistentes com a presença de sequências funcionalmente relevantes perto das extremidades 5 'e 3' dos íntrons. Finalmente, nossas descobertas sugerem que outras partes dos íntrons também podem estar sob restrições seletivas.


Íntrons móveis: ribozimas com bagagem

Um grupo de elementos genéticos móveis compreende os íntrons do grupo I e II. Essas sequências interrompem genes codificadores de proteínas e genes estruturais de RNA em todos os domínios da vida e podem ser consideradas parasitas moleculares. Quando o gene é transcrito em RNA, a sequência de íntron atua como uma ribozima (um RNA com atividade enzimática), que remove a sequência de íntron do transcrito de RNA primário, limitando assim o custo fenotípico associado à inserção do elemento em um gene hospedeiro e promovendo sua manutenção no genoma. No caso dos íntrons dos grupos I e II, a relação hospedeiro-parasita é enriquecida pelo fato de que os próprios íntrons foram invadidos por elementos parasitas menores - genes que codificam atividades promotoras de mobilidade que permitem que o elemento DNA se mova dentro e entre os genomas [10]. Assim, existem pelo menos dois níveis de parasitismo para íntrons móveis: o íntron no gene do hospedeiro que ele interrompe e o gene invasor no íntron. Coletivamente, o íntron e sua proteína de mobilidade codificada (muitas vezes chamada de proteína codificada por íntron, IEP) colaboram para formar um elemento móvel composto que utiliza a replicação do DNA do hospedeiro, recombinação e vias de reparo para se espalhar [11], enquanto a atividade da ribozima garante que não interrompe a função dos genes nos quais está inserido. Conseqüentemente, tornou-se evidente que há um grau extraordinário de coevolução entre os IEPs, os íntrons que os abrigam e o organismo hospedeiro. Esta revisão destaca vários estudos recentes que investigam a interação entre os íntrons de auto-processamento em genomas bacterianos e fágicos, seus genes e seus hospedeiros bacterianos e fágicos.

Introns do grupo I

Os íntrons do grupo I comumente habitam os genomas bacterianos, organelares, bacteriófagos e virais, e os genes do RNA ribossômico (rDNA) de eucariotos, e produzem um RNA de auto-processamento [12]. Os íntrons do grupo II têm distribuição semelhante, exceto pelo fato de não serem encontrados em genes nucleares eucarióticos. Os íntrons do grupo I e do grupo II mostram pouca conservação da sequência primária, embora seus RNAs adotem, cada um, estruturas secundárias e terciárias características necessárias para a atividade da ribozima [13, 14] (Figura 1a, b). Além disso, os íntrons podem tolerar a inserção de grandes quantidades de sequência em loops terminais da estrutura secundária da ribozima com pouco ou nenhum efeito no splicing, fornecendo pontos de 'ocultação' convenientes para genes parasitas.

Modelos de íntrons do grupo I e do grupo II e seus mecanismos de 'homing'. (a, b) Representações esquemáticas de (a) estruturas secundárias de íntrons do grupo I e (b) grupo II [13, 37]. Em ambos os casos, as estruturas secundárias são representadas por linhas sólidas indicando estruturas de haste-loop conservadas, denominadas P1 a P10 para os íntrons do grupo I e DI a DVI para os íntrons do grupo II. As posições dos ORFs e outras inserções são representadas por linhas vermelhas sólidas. O asterisco (*) próximo ao domínio II dos íntrons do grupo II indica previsões bioinformáticas dos locais de início da ORF, mas estes permanecem não caracterizados. As linhas cinza tracejadas indicam regiões de união de nucelotídeos desemparelhados, com setas indicando uma orientação 5'-3 '. Os exons 5 'e 3' são indicados por retângulos cinza. (c) Homing de um intron do grupo I. Nesta via de mobilidade baseada em DNA, o doador de íntron (D) expressa a endonuclease de íntron (símbolo vermelho da enzima) (etapa 1). Após a clivagem da sequência receptora do íntron alélico (R) no local de origem (etapa 2), o doador e o receptor se envolvem em reparo de quebra de fita dupla (DSB) para gerar dois alelos contendo o íntron. (d) Retrohoming do íntron do Grupo II por meio de um intermediário de RNA. O doador de íntron (D), neste caso, é o intron lariat RNA spliced ​​(linha vermelha tracejada), enquanto o receptor (R) pode ser DNA de fita dupla (dsDNA) ou DNA de fita simples (ssDNA), como em uma replicação garfo. Um complexo de ribonucleoproteína entre o RNA e o IEP catalisa um splicing reverso (etapa 1). Na via de dsDNA, o IEP então cliva a segunda fita para gerar o iniciador para a síntese de cDNA pelo IEP, enquanto na via de ssDNA um fragmento de Okazaki na forquilha de replicação (linha cinza sólida) atua como um iniciador (etapa 2). A síntese da segunda fita de cDNA seguida de reparo completa as reações de retromobilidade (etapa 3).

Muitos íntrons do grupo I se movem por um mecanismo de transposição baseado em DNA conhecido como 'homing'. Esses íntrons abrigam genes que codificam as chamadas endonucleases homing, endonucleases de DNA específicas de sítio, mas tolerantes à sequência, que introduzem quebras de fita dupla (DSBs) em alelos cognatos que não têm o íntron, iniciando a mobilidade do íntron por meio de um processo de reparo DSB [11] ( Figura 1c). O resultado de um evento de homing é o movimento unidirecional do intron e da estrutura de leitura aberta da endonuclease (ORF) para um alelo não ocupado, deixando uma cópia do intron em sua localização original (Figura 1c). Os íntrons do grupo I também podem abrigar outras 'bagagens'. Muitos íntrons do grupo I em genomas organelares codificam maturases - proteínas que ajudam a promover o splicing de íntrons por uma variedade de mecanismos [15, 16]. Algumas maturases também funcionam em trans para promover o splicing de outros íntrons do grupo I no mesmo genoma [17, 18]. Curiosamente, muitas maturases caracterizadas até agora são endonucleases homing degeneradas ou bifuncionais da classe LAGLIDADG - assim denominadas por seu motivo de sequência conservada - que adquiriram uma atividade chaperona de RNA independente de sua atividade de endonuclease de DNA [19, 20]. Os íntrons do grupo I também podem abrigar ORFs não relacionados à mobilidade ou splicing [21, 22], como exemplificado pelo caso surpreendente de um íntron de aproximadamente 18 quilobases de comprimento inserido na mitocôndria ND5 gene do cogumelo coral Discosoma que codifica 15 genes mitocondriais na alça P8 do íntron [23, 24]. Curiosamente, esses 15 genes incluem os genes de rRNA de subunidades pequenas e grandes e os cox1 gene, que é interrompido por outro intron do grupo I de auto-processamento.

Alguns íntrons bacterianos do grupo I foram invadidos por elementos móveis diferentes daqueles que codificam endonucleases homing. Notáveis ​​entre estes são os elementos quiméricos de sequência de inserção / íntron (IStrons) de Clostridium que contém um IS605Elemento semelhante ao inserido na extremidade 3 'do íntron [25]. Não se sabe, no entanto, se o elemento quimérico intron / IS é mobilizado pelo IS605 máquinas. Curiosamente, outro arranjo de intron clostridial do grupo I incomum foi recentemente encontrado por uma pesquisa bioinformática por riboswitches [26], elementos estruturais de RNA que controlam a expressão gênica por meio de estruturas secundárias alternativas em resposta à ligação de metabólitos secundários. Neste caso, o riboswitch / íntron em tandem encontra-se na região a montante de um gene de fator de virulência putativo, e a detecção de di-guanosil-5'-monofosfato cíclico pelo riboswitch controla a escolha da junção de splice 3 'pelo intron para modular a expressão do fator de virulência.

Enquanto muitas ORFs embutidas nos íntrons do grupo I estão inteiramente localizadas em regiões de loop, um número surpreendente de ORFs se estende além de loops periféricos para contribuir com nucleotídeos para regiões mais distantes do intron que formam os elementos estruturais necessários para o splicing [27]. A extensão da contribuição da sequência ORF para os elementos estruturais da ribozima varia dependendo do arranjo intron-ORF particular. Por exemplo, no bem estudado bacteriófago T4 td intron, a extremidade 3 'de uma ORF chamada I-TevI ​​(que codifica uma endonuclease homing do tipo GIY-YIG, novamente nomeada para um motivo de sequência conservada) contribui com 20 nucleotídeos que fazem parte das estruturas P6a, P6.0 e P7 que são essenciais para o splicing do intron [28] (Figura 2a). Em outros casos, a extensão da sobreposição é maior, envolvendo a extremidade 5 ', bem como a extremidade 3' da ORF da endonuclease (Tabela 1). Deve-se notar, no entanto, que a extensão da sobreposição observada é baseada em previsões de ORFs de endonuclease, e é possível que muitos casos de sobreposição extensa resultem da identificação bioinformática incorreta das extremidades 5 'e 3' dos genes da endonuclease. Apesar disso, a presença de uma endonuclease ORF dentro de uma molécula de RNA altamente estruturada apresenta uma série de questões evolutivas e funcionais fascinantes. Especificamente, como os íntrons móveis compostos evoluíram e quais são as consequências funcionais da tradução de ORFs de endonuclease de dentro de tais moléculas de RNA altamente estruturadas?

Sobreposição do I-TevI ​​ORF com o núcleo td seqüência de intron. (uma) Estrutura secundária da parte relevante do td intron do fago T4 [27], rotulado como na Figura 1. O I-TevI ​​ORF está localizado no loop P6 (linha azul contínua), mas se estende para o núcleo td , conforme indicado pelos últimos 20 nucleotídeos (de cor vermelha) da ORF I-TevI, que contribuem para P6a e P7. Curtas linhas vermelhas ao lado desses nucleotídeos indicam códons correspondentes aos cinco aminoácidos carboxi-terminais de I-TevI ​​(F241 a A245). O hairpin de RNA que sequestra o sítio de ligação ao ribossomo I-TevI ​​(RBS) é indicado na alça P6 [55, 59]. (b) Estrutura de cocristal do domínio de ligação de DNA I-TevI ​​130C com substrato de DNA sem íntron [47], modificado de PDB 1T2T usando PyMol. Os aminoácidos correspondentes à região de sobreposição com o td a sequência do íntron é mostrada como bastões vermelhos, com o restante da proteína I-TevI ​​colorido de azul. Os backbones da fita de DNA são amarelos com as bases verdes. Observe que a alanina carboxi-terminal (A245) não estava presente na estrutura I-TevI. O íon zinco coordenado pelo dedo de zinco I-TevI ​​é mostrado como uma esfera azul.

Introns do grupo II

Perguntas semelhantes podem ser feitas em relação aos íntrons do grupo II, que são encontrados em nichos semelhantes aos íntrons do grupo I, mas não em genomas nucleares [14]. Todos os íntrons do grupo II têm uma estrutura de ribozima comum que consiste em seis domínios helicoidais (Figura 1b) [29, 30]. Seus IEPs promotores de mobilidade são normalmente codificados no domínio IV, e os íntrons se movem por meio de um mecanismo baseado em RNA conhecido como 'retrohoming'. Ao contrário de suas contrapartes intron do grupo I, os IEPs do grupo II são proteínas multifuncionais contendo maturase (X), transcriptase reversa (RT) e funções de ligação ao DNA (D), além da atividade da endonuclease (En) do DNA. A atividade da maturase facilita o splicing do íntron ao estabilizar a conformação do RNA cataliticamente ativo, enquanto as funções RT, D e En auxiliam nas vias de mobilidade baseadas no RNA. Nesse tipo de movimento, o RNA do intron splicado invade o DNA de fita simples ou dupla ((Figura 1d). Assim como retrohoming para locais alélicos, os íntrons do grupo II podem transpor para locais não alélicos [11, 14] .

Os íntrons do grupo II também podem ser invadidos por elementos que codificam proteínas diferentes dos IEPs multifuncionais. Esses elementos incluem, mas não estão limitados a, simples inserções de ORF da endonuclease LAGLIDADG no domínio III [31, 32]. Outro arranjo produz os chamados gêmeostrons, nos quais um íntron do grupo II foi inserido em outro intron do grupo II, como no caso do psb locus em Euglena Gracilis DNA do cloroplasto e os íntrons TelI na cianobactéria Thermosynechococcus elongatus [33–35]. Enquanto algumas inserções "dividem" funcionalmente o íntron do grupo II e interferem com o splicing do íntron, outras, como alguns íntrons organelares eucarióticos, permitem trans-splicing [36].

Estudos cristalográficos recentes sobre a estrutura da ribozima do Oceanobacillus iheyensis O íntron Oi5γ do grupo II revelou que o empilhamento coaxial do domínio IV com seu domínio III vizinho projeta o domínio IV para longe do núcleo da ribozima, provavelmente evitando interações não produtivas da sequência de codificação IEP com o núcleo da ribozima [37]. Da mesma forma, o posicionamento dos domínios II e III longe da ribozima sugere que eles podem acomodar sequência adicional [29, 38]. Embora os domínios II, III e IV possam aumentar a eficiência do splicing, eles não são estritamente necessários para a catálise, tornando-os locais hospitaleiros para elementos invasivos. Em bactérias, os IEPs são codificados inteiramente dentro de alças de seus íntrons do grupo II do hospedeiro e possuem características regulatórias, como promotores e sítios de ligação ao ribossomo, que são distintos daqueles que controlam a expressão do gene hospedeiro no qual o íntron reside [39]. Em contraste, em genomas organelares, as ORFs embutidas nos íntrons do grupo II são reguladas por promotores nos exons a montante [40, 41]. Assim, as ORFs do íntron são inicialmente traduzidas como proteínas de fusão com o exon 5 'e requerem processamento proteolítico subsequente [40, 41].


MATERIAIS E MÉTODOS

Cultura de células

A linha de células monocíticas humanas THP-1 foi adquirida na American Cell Type Collection (Manassas, VA, EUA) e mantida a 37 ° C em um CO2 incubadora (5%) em meio RPMI-1640 suplementado com FBS 10%, HEPES 10 mM, piruvato de sódio 1 mM (todos HyClone, Logan, UT, EUA) e β-ME 50 uM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Para atingir toxicidade e consistência mínimas do procedimento de transfecção transitória, nenhum antibiótico ou agente de diferenciação / estimulador foi adicionado ao meio celular. Para garantir a consistência do fenótipo da cultura de células, as células adquiridas foram expandidas por 2 semanas e congeladas em várias alíquotas de 2 × 10 6 células / ml, que foram expandidas posteriormente, uma de cada vez, por 2-3 semanas e, em seguida, usadas por todos os experimentos.

Transfecções, mutagênese dirigida ao local, RT-PCR e Western blotting

Todos foram realizados como descrito anteriormente [10] amplicons foram quantificados usando o software Image J v. 1.42 (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA).

Ensaio de mudança de mobilidade de RNA

As sondas de RNA uniformemente rotuladas compreendendo as bases 4-77 e as bases 57-120 do exon 5 do TF humano (sondas 1 e 2, respectivamente) foram sintetizadas conforme descrito anteriormente [10]. Extratos nucleares de células THP-1 foram preparados no dia do experimento, conforme Andrews e Faller [12], e as concentrações de proteínas foram determinadas usando o ensaio de proteína Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Géis band-shift de RNA foram preparados e executados conforme descrito anteriormente [10]. Após cada execução, os géis de deslocamento de banda foram secos e, a seguir, expostos a uma quantificação de fosfocromia de complexos de proteína-RNA foi realizada usando o gerador de imagens de modo variável Typhoon TRIO e o software ImageQuant TL v. 2005 (GE Healthcare, Waukesha, WI, EUA).


Limites físicos do tamanho da célula para a divisão celular embrionária em Caenorhabditis elegans

Akatsuki Kimura

Os embriões iniciais são um bom modelo para estudar a relação entre o tamanho das células e a organização intracelular. Os blastômeros podem apresentar vários tamanhos durante a divisão celular embrionária, uma vez que as células se dividem sem crescimento celular durante esta fase. Além disso, as células embrionárias são geralmente grandes, o que torna essas células modelos úteis para observação microscópica. Portanto, transparente Caenorhabditis elegans embriões representam um modelo ideal para investigar essas relações [68-71]. Aqui, eu argumento, com base em estudos anteriores em C. elegans e outros sistemas, o tamanho da célula pode ser limitado pelas propriedades físicas da célula. Para proliferar, a célula precisa se dividir e, para uma divisão celular fiel, a maquinaria molecular, como o fuso mitótico, deve ser construída na posição certa e com o tamanho correto. Isso pode não ser realizado em células extremamente grandes ou pequenas devido às propriedades físicas das macromoléculas, como microtúbulos e cromossomos.

O posicionamento do fuso mitótico no centro da célula é crítico para a divisão celular simétrica, pois define a origem da segregação da cromátide irmã e a posição do plano de divisão celular [72]. O centrossoma é o principal centro organizador do citoesqueleto dos microtúbulos e, nas células animais, frequentemente inclui os pólos do fuso mitótico. Os centrossomos têm a capacidade de se posicionar no centro da célula [73], permitindo que o fuso mitótico também se posicione no centro da célula [74, 75] (Figura 2). Este posicionamento central do centrossoma é realizado por meio da função do citoesqueleto do microtúbulo [76, 77]. Vários mecanismos foram propostos para descrever como os microtúbulos trazem centrossomas para o centro da célula, incluindo empurrar o córtex celular e puxar por proteínas motoras [74, 77-88]. Os mecanismos que mediam a centralização do centrossoma podem diferir entre as espécies, especialmente entre as espécies com diferentes tamanhos de células [83]. Estudos recentes têm apoiado a ideia de que a força de tração citoplasmática é a principal força motriz para a centralização do centrossoma em células animais [75, 78, 81, 86, 89]. É importante ressaltar que para todos os mecanismos propostos, a centralização dependente de microtúbulos do centrossoma deve ser facilitada por microtúbulos, que crescem a partir do centrossoma e se estendem por todo o citoplasma para encontrar o centro geométrico da região [87, 88].

Microtúbulos em C. elegans. Uma imagem de microtúbulos em uma célula embrionária - microtúbulos astrais do fuso alcançam o córtex celular.

Se a célula for muito grande em comparação com o comprimento dos microtúbulos, o centrossoma não se posicionará no centro da célula (Figura 3a, painéis do meio). Uma vez que os microtúbulos crescem e encolhem de maneira estocástica conhecida como instabilidade dinâmica [90], o comprimento médio dos microtúbulos (n av) é definido pelas velocidades de crescimento (v +) e encolhendo (v -), a frequência de mudança de crescimento para encolhimento (f +-) e vice versa (f -+), Como n av ≈ (v -v +)/(v -f +- - v +f -+) [91]. De acordo com esta equação, os comprimentos médios são estimados como estando na faixa de mícrons com base em parâmetros de instabilidade dinâmica medidos experimentalmente em vitro [92] e na Vivo [93], o que é consistente com o observado na Vivo comprimentos de microtúbulos [91, 94]. Curiosamente, esse comprimento é comparável ao tamanho das células animais comuns, sugerindo que a escala de comprimento de um microtúbulo está relacionada ao tamanho da célula. Portanto, o comprimento dos microtúbulos pode definir o limite superior do tamanho da célula. Esta ideia foi apoiada pelo encurtamento experimental do comprimento dos microtúbulos. Quando as células foram tratadas com drogas de despolimerização de microtúbulos ou knockdown parcial de moléculas de polimerização de microtúbulos, os centrossomas não atingiram o centro da célula e o plano de divisão celular foi posicionado de maneira assimétrica [76, 95, 96]. Curiosamente, estudos demonstraram que os centrossomas podem encontrar o centro da célula em células extremamente grandes, como embriões de rã recém-fertilizados [97] (veja a contribuição do Dr. Frankel neste artigo do Fórum, abaixo). Em embriões grandes, um grande microtúbulo aster que se expande por toda a célula é formado e centraliza o centrossoma em direção ao centro da célula, possivelmente devido às forças citoplasmáticas de tração [89]. Em um em vitro experimento de centralização usando câmaras microfabricadas, foi demonstrado que o alongamento eficiente dos microtúbulos para alcançar os limites da câmara foi crítico para o posicionamento robusto do aster do microtúbulo no centro da câmara [88]. Esses estudos apoiam coletivamente a ideia de que o raio da célula não pode exceder o comprimento máximo dos microtúbulos para a proliferação celular.

Possíveis cenários em que a centralização do centrossoma (a) e o alongamento do fuso (b) definem o limite superior e inferior do tamanho da célula. (uma) Se a célula exceder o limite superior de tamanho, o centrossoma e, conseqüentemente, o fuso mitótico, não pode se posicionar no centro da célula, levando a uma divisão celular não simétrica (painéis do meio versus painéis da esquerda). Se a célula cair abaixo do limite inferior, o centrossoma pode não se posicionar de maneira estável no centro da célula devido ao excesso de forças elásticas dos microtúbulos (painéis direitos versus painéis esquerdos). (b) Se a célula exceder o limite superior, os microtúbulos astrais não alcançam o córtex celular, podendo levar a um alongamento insuficiente do fuso. Se a célula cair abaixo do limite inferior, pode não haver espaço suficiente para a segregação cromossômica precisa em comparação com o tamanho dos cromossomos da célula.

Como são definidos os limites inferiores do tamanho da célula? O centrossoma pode não centrar corretamente se a célula for muito pequena em comparação com o comprimento dos microtúbulos. Por causa das propriedades elásticas dos microtúbulos, microtúbulos curtos geram fortes forças de impulsão quando as pontas em crescimento encontram obstáculos como o córtex celular. Devido às reações dessas forças de pressão, o centrossoma será submetido a fortes forças de vários microtúbulos, que podem desestabilizar o posicionamento do centrossoma (Figura 3a, painéis da direita). Esta ideia é baseada em um elegante em vitro experimento de centralização usando câmaras microfabricadas combinadas com análises teóricas [79, 98, 99]. Este experimento foi realizado em uma câmara de tamanho de célula (um quadrado com cerca de 20 μm de um lado), mas o comprimento dos microtúbulos era longo devido à falta de encolhimento de muitos microtúbulos atingindo os limites da câmara, exercendo forças de pressão contra as paredes da câmara . Nessas condições, os asteres dos microtúbulos se afastaram do centro da câmara [79] ou falharam em se reposicionar no centro da célula após a realocação [99]. Este movimento descentralizado foi restaurado promovendo o encolhimento dos microtúbulos [99]. O encurtamento do comprimento médio do microtúbulo, promovendo o encolhimento, resultou em menos microtúbulos atingindo o córtex, gerando menos força de empuxo e posicionando de forma estável o aster no centro geométrico [99]. Este experimento indicou que, em células pequenas onde muitos microtúbulos curtos (e, portanto, rígidos) atingem o córtex celular, o centrossoma não pode se posicionar de maneira estável no centro da célula.

Além das propriedades físicas dos microtúbulos, como comprimento e rigidez, outras propriedades também podem definir os limites do tamanho das células. O alongamento do fuso mitótico durante a anáfase é conhecido por depender do tamanho da célula, quanto maior a célula, mais longo e mais rápido o fuso se alonga. Até o momento, essa tendência só foi demonstrada no C. elegans embrião [68, 69] no entanto, pode representar uma tendência geral em outras células. Se um fuso se alonga apenas por uma curta distância em células pequenas, a separação das cromátides irmãs pode não ser suficiente para segregá-las completamente. No fermento Saccharomyces cerevisiae, os cromossomos alongados artificialmente tornam-se mais condensados ​​na anáfase para garantir a segregação completa das cromátides [100]. Esta observação implica indiretamente que o fuso deve se alongar a uma certa distância para segregar os cromossomos com um certo tamanho [101]. Dentro de um determinado tamanho do genoma, deve haver um limite inferior para o tamanho dos cromossomos condensados, o que pode definir ainda mais o limite inferior do alongamento do fuso mitótico, definindo assim o tamanho da célula (Figura 3b, painéis da direita).

O alongamento do fuso mitótico também pode definir o limite superior do tamanho da célula. Uma vez que o alongamento é parcialmente impulsionado pela retirada de microtúbulos astrais do córtex celular [102, 103], se os microtúbulos astrais não alcançam o córtex celular em células grandes, o alongamento do fuso é prejudicado, podendo causar segregação cromossômica insuficiente (Figura 3b, meio painéis). Que eu saiba, não houve nenhuma evidência experimental para apoiar essa ideia até agora. No entanto, quando a força de tração cortical foi prejudicada em C. elegans embriões, fomos capazes de encurtar o alongamento do fuso, embora não completamente [69]. Os cromossomos parecem gerenciar a segregação sob essas condições. A identificação dos genes responsáveis ​​pelo alongamento remanescente pode nos permitir testar se o comprometimento da interação entre os microtúbulos astrais e o córtex celular leva a defeitos na segregação cromossômica.

Neste texto, discuti uma visão básica e simplificada da relação entre o tamanho da célula e as propriedades materiais das macromoléculas que constituem a maquinaria mitótica. Como a biologia sempre tem que lidar com a diversidade, uma célula individual pode ter seu próprio mecanismo exclusivo para definir o tamanho da célula e realizar a divisão celular. No entanto, a diversidade no tamanho das células entre as espécies é muito menor do que no tamanho do corpo, sugerindo restrições comuns para a maioria dos tipos de células. Acredito que a compreensão dessas restrições comuns revelará o princípio básico de design da arquitetura de células.


RESULTADOS

Seleção e classificação de genes

Genes contendo intron foram identificados usando S. cerevisiae banco de dados (Dwight et al., 2002), Ares Lab Yeast Intron Database (Spingola et al., 1999), e o Munich Information Center for Protein Sequences Comprehensive Yeast Genome Database (Guldener et al., 2005). Além disso, também adicionamos nove íntrons descobertos recentemente (Juneau et al., 2007) que não foram anotados nessas bases de dados. Os genes contendo introns foram agrupados por função em 10 classes (citoesqueleto, metabolismo do RNA, segregação cromossômica e meiose, metabolismo, mitocôndria, dobramento e degradação de proteínas, transcrição e tradução, retículo endoplasmático e Golgi, proteínas ribossômicas e genes não caracterizados) de acordo com Classificação MIPS CYGD (Comprehensive Yeast Genome Database) (Guldener et al., 2005). Para este primeiro estudo, evitamos classes contendo muitos genes com múltiplas funções celulares (por exemplo, transcrição e tradução) ou alta concentração de genes sensíveis ao splicing previsto (por exemplo, genes de proteínas ribossômicas). Em vez disso, selecionamos seis vias metabólicas agrupando 87 genes com funções de manutenção bem definidas (Tabela 1) como representantes de genes contendo íntrons em leveduras (Figura 1). Nesse conjunto, um terço dos genes são essenciais: três contêm dois íntrons e dois são combinados alternativamente. Os tamanhos dos íntrons alvo variam de 56 a 1002 nt e a maioria é encontrada dentro de uma ORF, exceto para 7, que estavam localizados na região 5 ′ não traduzida (5 ′ UTR).

Tabela 1. Caminhos e categorias de genes contendo íntrons estudados neste artigo

Sublinhado, genes essenciais em negrito, íntron sobreposto a outro ORF. Se o gene contém mais de um íntron, o número de íntrons é escrito entre parênteses e AS indica emendado alternativamente.

Figura 1. Pipeline para a deleção e análise funcional de íntrons de levedura. Todos os genes contendo intrões conhecidos foram identificados a partir de bases de dados públicas (Dwight et al., 2002 Guldener et al., 2005 Spingola et al., 1999) e classificado em 10 vias usando a ontologia genética (Guldener et al., 2005). Os íntrons foram deletados individualmente em cepas separadas ou removidos sequencialmente de uma única cepa para criar uma cepa de levedura com múltiplas deleções de íntrons. O efeito das deleções de íntron no crescimento foi medido em rich media e as cepas com defeitos de crescimento foram identificadas. Todas as cepas de deleção de íntron foram submetidas a uma bateria de 21 ensaios fenotípicos diferentes em meio líquido e as células com deleção múltipla foram testadas para adequação.

A exclusão eficiente de íntrons de levedura requer a expressão da endonuclease I-SceI

A estratégia geral usada para avaliar a função do íntron é descrita na Figura 1, e o método usado para excluir o intron é descrito na Figura Suplementar S1A. Deleções de íntrons foram obtidas usando um método padrão de duas etapas (pop-in / pop-out) (Boeke et al., 1987). Para aumentar a frequência de pop-outs sem perder deleções direcionadas, incluímos nos fragmentos inseridos um local de clivagem para a enzima de quebra de fita dupla I-SceI (Fairhead e Dujon, 1993) a montante do URA3 gene (Figura S1A). A quebra de fita dupla foi introduzida pela expressão de uma cópia nascida do plasmídeo de I-SceI antes da seleção para pop-outs em meio contendo 5-FOA (Figura S1A). Usando este método, deletamos 96 íntrons em 87 genes (Tabela 1). Todas as remoções de íntrons foram conduzidas em células diplóides e verificadas por amplificações de PCR (dados não mostrados). As células com as deleções de íntron corretas foram esporuladas e as células haplóides foram testadas quanto ao crescimento (Figura S1B).

A maioria dos íntrons pode ser removida com pouco impacto no crescimento em condições normais

O efeito das deleções de íntron na viabilidade celular foi primeiro avaliado pelo monitoramento do crescimento em rich media (para uma visão geral, consulte a Figura 1). Nenhuma das deleções afetou o crescimento da cepa diplóide heterozigótica na mídia rica, exceto a exclusão do íntron do YRA1 gene (data not shown), whereas 9 of the 99 intron deletions tested slowed or inhibited growth of haploid cells on rich media (Figure 1). The growth defects were caused by intron deletions in four genes containing a total of nine introns, three of which related to RNA metabolism (MTR2, YRA1, e TAD3) and one that was implicated in chromosome segregation and meiosis (BUD25 Figures 2 and 3 and Figure S2).

Figure 2. Deletion of the alternatively spliced MTR2 gene introns is lethal. (A) Tetrad dissection of cells carrying different intron deletions in MTR2 gene. Left, schematic representation of the gene structure and the position of introns in relation to the translation start codon right, tetrad dissection on rich media. The intron length in nucleotides is indicated above each intron. (B) MTR2 gene carrying deletion in the first or fifth intron support growth when expressed from a heterologous promoter. Empty plasmid (pACTpr) or plasmids expressing mtr2Δ1i, mtr2Δ2i, mtr2Δ3i, mtr2Δ4i, mtr2Δ5i, ou mtr2Δ6i alleles from ATO 1 promoter were transformed in a diploid strain carrying deletion of the MTR2 gene. After these strains were sporulated, the tetrads were dissected and tested for growth. The pictures shown were taken after 3 d of incubation at 30°C.

Figure 3. Splicing of YRA1 e TAD3 is required for growth in a promoter-dependent manner. (A) Diploid yeast strains heterozygous for the deletion of the YRA1 gene were transformed with a plasmid expressing the native YRA1 (pYRA1pr-YRA1) or YRA1-deleted intron (pYRA1pr-yra1Δi) mRNA from the native YRA1 promoter (top panel), or plasmid expressing the YRA1 (pACT1pr-YRA1) or YRA1-deleted intron (pACT1pr-yra1Δi) mRNA from ATO 1 promoter (bottom panel). After sporulation the tetrads were dissected on YPD plates and pictures were taken after 4 d of incubation at 23°C. (B) Diploid yeast strains heterozygous for the deletion of TAD3 introns (tad3Δ2i top panel) or heterozygous for the complete deletion of the TAD3 gene (bottom panel) were transformed with empty plasmid (pACT1pr-empty) or plasmid expressing intronless TAD3 mRNA from ATO 1 promoter (pACT1pr-TAD3Δ2i). Tetrad dissections were carried as described above, and pictures were taken after 3 d of incubation at 30°C. In some cases spores did not grow because of the loss of pACT1pr-YRA1, pACT1pr-yra1Δi, or pACT1pr-TAD3Δ2i when grown on rich media. The left panels illustrate the structure and position of YRA1 e TAD3 genes.

Six intron deletions causing growth defects were found in the alternatively spliced MTR2 gene (Kadowaki et al., 1994 Santos-Rosa et al., 1998) implicated in the regulation of mRNA transport. The gene harbors six overlapping introns in the 5′ UTR that could produce six isoforms (Davis et al., 2000). Evidence for the use of five of the six possible splice site combinations had been provided by the sequencing of cloned RT-PCR products (Davis et al., 2000). As shown in Figure 2A, the deletion of introns 1 and 5 slows growth, whereas the deletion of introns 2, 3, 4, and 6 are lethal. Growth defects were also observed upon the deletion of introns from the constitutively spliced genes YRA1 e TAD3, which carry one or two introns, respectively (Figure 3). Consistent with previous studies (Preker et al., 2002 Rodriguez-Navarro et al., 2002), deleting the intron of the mRNA transport gene YRA1 rendered cells temperature sensitive (Figure 3A and data not shown). On the other hand, although deleting any single intron of TAD3, which encodes a tRNA specific adenosine deaminase, did not inhibit cell growth, the deletion of both introns was lethal (Figure 3B). Deleting the introns of TAD3 (tad3Δ2i) removes 15 nucleotides of a dubious ORF (YLR317W) residing on the opposite strand of the introns. However, expressing the entire YLR317W gene from a plasmid did not restore growth, and point mutations disrupting the YLR317W reading frame had no effect on growth (data not shown). Thus, at least one TAD3 intron is essential for growth. In contrast to the intron deletions in RNA metabolism genes, the growth defect associated with the chromosome segregation and meiosis BUD25 gene was found to be intron-independent and was caused by the disruption of an overlapping gene (Figure S2).

MTR2, YRA1, and TAD3 Introns Are Required for Growth in a Promoter-dependent Manner

To understand why deleting introns from MTR2, YRA1, e TAD3 genes inhibits growth, we ectopically expressed intronless versions of these genes from native or heterologous promoters and monitored their ability to support cell growth. Expressão de MTR2 versions carrying deletions in any of its six introns from a plasmid under the control of its native promoter failed to restore growth to cells lacking the MTR2 gene (data not shown). In contrast, transforming mtr2Δ cells with plasmid-expressing MTR2 genes lacking the first or the fifth intron from the ATO 1 promoter restored normal growth, whereas transformation of other MTR2 variants did not (Figure 2B). We conclude that the alternatively spliced introns of MTR2 contribute differently to cell growth probably by differentially modulating gene expression.

Gostar MTR2, YRA1 codes for an essential protein required for the nuclear export of mRNA (Sträßer and Hurt, 2000). However, unlike MTR2, YRA1 contains only one constitutively spliced intron, the deletion of which was previously shown to render cells temperature-sensitive (Zenklusen et al., 2001 Preker et al., 2002 Rodriguez-Navarro et al., 2002 Preker and Guthrie, 2006 Dong et al., 2007). We tested the ability of an intronless copy of YRA1 expressed from a panel of different promoters. Only the ATO 1 promoter supported normal growth (Figure 3A). This result indicates that splicing is not required for YRA1 expression and suggests that the intron is used to set optimal expression from the native YRA1 promotor. Similarly, expression of an intronless version of TAD3 de ATO 1 promoter restored the growth defects caused by expressing tad3Δ2i from its native promoter (Figure 3B). Thus, genes of most yeast metabolic pathways do not require splicing for normal function with the exception of a few genes implicated in RNA metabolism.

The Deletion of Several Yeast Introns Alters Growth under Special Conditions

Because most intron deletions were tolerated under normal growth conditions, we examined their impact when cells were exposed to stress. All intron-deleted strains growing normally on rich media were tested for growth in different media containing seven different carbon sources and 13 drugs affecting different metabolic activities (Table S1 and Figure S3). As shown in Figure 4A, 48 of 90 mutant strains grew slower or faster than the wild-type strain by 20% or more in at least one growth condition. However, only four deletions (HNT1, SAE3, GLC7, e HOP2) reduced growth in two different conditions and only one (VMA9-1) reduced growth in three conditions. In most cases, the growth defect was observed in conditions related to the known or predicted function of the mutated gene. For example, a growth phenotype was observed in the presence of camptothecin, cyclosporine, and MMS, which affect chromatin organization, transcription, and DNA repair (Chlebowicz and Jachymczyk, 1979 Hemenway and Heitman, 1996 Halas et al., 1997 Capranico et al., 2007) after deleting introns from certain genes involved in DNA synthesis, transcription, and mitochondrial integrity. On the other hand, sensitivity to staurosporine, which affects cell wall integrity, was observed when deleting introns from genes affecting meiosis and chromosome segregation (Chai et al., 2002). However, intron features (e.g., size or position) or gene ontology classification did not correlate with drug sensitivity (Figure S4). Notably, the percentage of intron deletions affecting growth under stress was not equally distributed among the different classes of genes. Almost all the intron deletions in genes included in RNA metabolism, meiosis, and general metabolism affected growth at least in one condition, whereas only a minority of the genes in other pathways had an effect on growth (Figure 4B). Differences between pathways are not related to the percentage of essential and nonessential genes in each pathway or the number of genes per pathway (Figures 4B and S4). We conclude that although introns may be largely dispensable for basic cellular functions, they play an important role in attuning growth to various conditions.

Figure 4. Phenotypic analysis of different intron deletion strains. (A) Heatmap of the maximum growth rate (μm) of intron-deleted strains in 21 growth conditions. The μm of each mutated strain has been measured and compared with the μm of the wild-type strain growing under the same condition. The heatmap was generated using mutant strains with a growth rate that differs from that of the wild-type strain by 20% or more. Right, the gene names left, the metabolic pathway of each gene and its requirement for growth. Genes related to cytoskeleton, RNA metabolism, chromosome segregation and meiosis, metabolism, mitochondria, and protein folding and degradation are shown in red, green, blue, light blue, pink, and yellow, respectively. The drugs or carbon sources used in the growth assays are shown on the bottom. The arrow indicates growth in glucose, which is used as normal growth conditions. Dark blue, blue, and light blue indicate cells growing faster, similar, or slower than wild-type cells, respectively. (B) Histogram showing the percentage of essential (light gray) and nonessential (dark gray) genes that reduce cell growth within a given pathway when introns are deleted (left panel). The percentages of essential (light gray) and nonessential (dark gray) genes that induce growth are shown on the right. Note that certain intron-deleted genes can provoke a reduction of cell growth in a condition and an induction in another.

Introns Are Not Required for Cytoskeleton Generation and Maintenance

If yeast introns are generally dispensable for basic functions, it may be possible to relieve an entire pathway from splicing with little effect on growth. To test this hypothesis, we cumulatively deleted introns from all genes of the cytoskeleton pathway and monitored the effect on cell growth and function. The cytoskeleton pathway was selected because it contains genes with well-established housekeeping functions and tools are available to examine the expression of associated proteins and follow the impact on related molecular functions. In yeast, there are 15 cytoskeleton related genes containing 16 introns (Table 1). About half of the genes are essential for function and one contains two introns. To remove multiple introns in a single strain, each intron deletion was introduced individually, and the resulting haploid strains were mated to generate cumulative mutations in sets of four as illustrated in Figure S1B. Once haploid cells containing four intronless genes were obtained (Δ4i), they were backcrossed three times with wild-type cells to remove or dilute deleterious mutations in the mutant cells. Clean cells were mated to obtain homozygous diploid strains carrying all four deletions and the process was repeated until all introns in the cytoskeleton pathway were deleted (Figure S1B).

We tested the effect of deleting 4 (Δ4i), 8 (Δ8i), 12 (Δ12i), and 16 (Δ16i) introns of cytoskeleton-related genes on growth under different conditions (Figure 5 and Figure S5). All strains grew on rich media, and none of the multiple-deletion strains displayed a phenotype not observed with strains carrying single deletion (Figure 5A and Figure S5). This indicates that eliminating introns from an entire metabolic pathway can be tolerated. However, intron contribution might only be revealed when cells are in competition for limited resources. Therefore, we monitored the capacity of the different single and multiple mutant strains to compete with wild-type cells for growth in the same culture. The distribution of the mutant and wild-type cells were counted in the beginning of the experiment and after 50 generations. As shown in Figure 5B, three individual intron deletions reduced the cell fitness by 10–20%, whereas 10 single intron deletions increased fitness by 10–20%. In general, the fitness of cells carrying multiple deletions reflected the largest effect conferred by an individual intron deletion, and no multiple deletion-specific effects were observed. Strikingly, deleting all introns from the cytoskeleton-related genes conferred a slight net growth advantage over wild-type cells (Figure 5B). We also considered the possibility that intron deletions may affect gene expression without visible effects on phenotype. For this reason, we assessed the expression level of intron-containing cytoskeleton-related mRNAs and monitored the protein level of selected genes. As shown in Figures 5C and Figure S6, intron deletions did not significantly change the expression levels of the intronless genes even in cells with reduced fitness (e.g., MOB1, ARP9, ou YSC84) In addition, no changes in the cell division or microtubule formation and functions were observed by microscopic evaluation (Figure S7). We conclude that the deletion of individual introns of cytoskeleton-related genes does not alter their gene expression and that freeing at least one metabolic pathway from splicing in yeast confers a growth advantage in a competitive environment.

Figure 5. Phenotypic analysis and expression profiling of yeast strain carrying multiple intron deletions in genes associated with cytoskeleton. (A) Maximum growth rate of different strains carrying multiple intron deletions in cytoskeleton-related genes was obtained and plotted relative to that of a wild-type strain. Growth conditions inducing the greatest variance between the wild-type and mutant strains are shown (X axis). The data are an average of at least three different experiments. Strain carrying intron deletions in ATO 1, ARP2, SAC6, e TUB1 genes (Δ4i) is indicated with white bars. Light gray bars, the strain carrying Δ4i deletions plus additional ones in COF1, GIM5, CIN2, e ARP9 genes (Δ8i) gray bars, Δ12i strain that carries Δ8i deletion plus deletions in TUB3, PFY1, DYN2_1 e MOB1 genes dark gray bars, Δ16i that carries the Δ12i deletions plus additional one in MOB2, LSB3, YSC84 e DYN2_2 genes. (B) Competitive growth assay of wild type and intron-deletion strains in rich media (fitness test). Mixed cultures were started by adding equal quantities of cells from wild-type (ade2Δ) and intron deletion strains (Δi ADE2) in YPD containing 100 μg/ml adenine to avoid the accumulation of the red pigmentation of ade2 mutantes. The mixed cultures were grown at 30°C and diluted each day until 50 generations (± 2) were reached. At generation 0 and 50, the number of mutant (white) and wild-type (red) cells was counted by plating 300 cells (±44) on SC plates containing a low concentration of adenine (20 μg/ml), and the initial and final percentages of each strain was calculated. The initial percentages were set to 50:50 (black line), and the final percentages shown in the graph were relative to this ratio. Dark gray bars, the percentage of wild-type cells light gray bars, the percentage of cells carrying intron deletion. Competitive growth assays were performed with two wild-type strains that have different background (ADE2, white bar and ade2Δ) as negative control and also with wild-type and yra1Δeu, wild-type and mtr2Δ1i, and wild-type and mtr2Δ5i strains as positive controls. The strains are indicated on the X-axis. n = 3 for the individual experiments, except for the multiple intron deletion strains, where the data represent six different experiments. (C) Expression profiling of cytoskeleton related mRNAs before and after intron deletions. The abundance of each mRNA associated with the cytoskeleton was determined in wild-type cells, cells carrying a single deletion in the gene analyzed (light gray bars), or cells carrying multiple deletions in all cytoskeleton related genes (gray bars). The RNA was quantified using Northern blot, normalized using internal controls, and plotted relative to the expression of the wild-type mRNA. The data represent average values for RNA obtained from two different cultures grown independently in duplicates.


Resultados

Relative Distribution of Splicing Factors and hsp Genes in Unstressed Cells

We investigated the relative distribution of SC35 splicing factor and sites of hsp70 or hsp90α genes in normal human fibroblasts. Our rationale for selection of the hsp90α and hsp70 genes was based on three criteria: (a) both genes are transcribed at a low basal rate in cells at normal growth temperatures (b) the transcription rates of both genes are induced to high levels upon exposure to heat shock and other stresses and (c) the hsp90α gene contains 10 introns whereas the hsp70 gene is intronless. The relative distribution of hsp70 or hsp90α transcription sites and SC35 splicing factor was analyzed by using a procedure combining immunofluorescence for the detection of splicing factors and FISH for the detection of hsp nuclear transcripts (Jolly et al., 1997a).

We have demonstrated previously that hsp70 and hsp90α gene expression is induced by heat shock and other stresses (Watowich and Morimoto, 1988 Abravaya et al., 1991 Shi et al., 1998 for review see Morimoto et al., 1996). At 37°C, hsp90α transcripts are constitutively detected whereas hsp70 mRNAs were undetectable (Fig. 1 a, lane a). This corresponded, by transcriptional run-on analysis, to a very low basal rate of hsp90α gene transcription at 37°C while hsp70 gene transcription was repressed (Fig. 1 b, lane a). Within the nucleus of diploid fibroblasts, hsp transcripts detected by FISH appear as two foci (Fig. 2). Because hsp90α transcription rate is low, the foci detected by FISH may correspond partially to nascent transcripts which are retained at the site of transcription, as has been shown for hsp70 transcripts (Jolly et al., 1998). Codetection of the transcripts and the corresponding gene by FISH showed a complete overlap of the two hybridization signals at the level of light microscopy (data not shown). For the hsp70 gene whose constitutive expression is too low (Fig. 1), we chose to detect the gene itself by FISH.

In control cells, SC35 speckles were associated with 30% of the hsp90α transcription sites, averaging over 200 transcription sites (Fig. 2 a and Table I). In contrast, only 10% of the signals corresponding to the hsp70 gene were associated with SC35 speckles (Fig. 2 b). No differences in the size or intensity of associated versus nonassociated transcription sites were observed. Nuclear speckles were found by quantitative digital imaging analyses to occupy 5–17% of the nuclear volume (Huang and Spector, 1991 Carter et al., 1993) whereas hsp transcripts occupy <1% of the nuclear volume. The low percentage of association between SC35 speckles and hsp70 transcription sites consequently reflects random distribution, whereas the 30% association with hsp90α transcription sites is significant and likely reflects the higher basal transcription rate of the hsp90α gene.

Relative Distribution of SC35 Speckles and hsp Genes in Heat-shocked Cells

To address whether the distribution of SC35 speckles and hsp genes is a reflection of introns or of the transcription rate, we exposed the cells to a heat shock at 42°C or 45°C, conditions which result in a dramatic elevation of heat shock gene transcription (Watowich and Morimoto, 1988 Abravaya et al., 1991 Shi et al., 1998 for review see Morimoto et al., 1996). The analysis of hsp90α and hsp70 gene transcription rates, by nuclear run-on analysis, revealed that both genes were induced strongly following a 42°C or 45°C heat shock (5- and 12-fold induction for the hsp90α gene, and 14- and 35-fold induction for the hsp70 gene at 42°C and 45°C, respectively) (Fig. 1 b). Quantification of the mRNA levels by RT-PCR revealed a 11.4-fold (42°C) and 29.7-fold (45°C) induction of hsp70 mRNA levels (Fig. 1 a, lanes b and c) and a 1.5-fold (42°C) and 2.5-fold (45°C) (Fig. 1 a, lanes b and c) induction of hsp90α mRNA. As expected, the fold-induction of hsp90α transcripts determined by measuring mRNA levels was lower than for hsp70 due to the higher basal levels of hsp90α transcripts in control cells.

hsp70 or hsp90α transcripts were detected together with the SC35 splicing factors in heat-shocked cells. As shown in Fig. 3, 92% of hsp90α transcription sites were observed to be adjacent to SC35 speckles in the 42°C treated cells (Fig. 3 a) and 94% in the 45°C treated cells (Fig. 3 c). Likewise, 92% and 93% of the chromosomal sites of hsp70 transcription were associated with a SC35 speckle in cells exposed to 42°C (Fig. 3 b) and to 45°C (Fig. 3 d), respectively. Identical results were obtained in cells exposed at 42°C or 45°C for only 10 min (data not shown), attesting that the association of splicing factors with transcribing genes is a very rapid process, directly correlated to the transcriptional activity of the gene and not due to major rearrangements of the nuclear architecture as a consequence of heat shock.

The high degree of spatial coincidence between SC35 speckles and sites of hsp gene transcription following activation of the heat shock response reveals that a key feature of recruitment of SC35 splicing factors relates to the dynamics of transcription. A similar spatial association of the heat-activated hsp90β gene with the speckles has been reported previously (Lampel et al., 1997). Our results demonstrate, however, that the splicing factors do not distinguish between intron-containing and intronless genes. Activated hsp genes were not found to be preferentially associated with larger speckles as has been observed for fibronectin transcripts (Xing et al., 1993, 1995), perhaps reflecting a gene specificity in the pattern of association with the speckles.

To what extent do our observations reflect features of SC35 which are not general to splicing complexes? To ensure that our results were not limited to the SC35 splicing factor or due to the fact that the anti-SC35 antibody only recognizes a phosphoepitope of the protein, we performed the same experiments on control and heat-shocked cells with the Y12 antibody to detect snRNPs (Lerner et al., 1981) (Fig. 4) or with an anti-U2B′′antibody (Mattaj et al., 1986) (data not shown). The results obtained for both antibodies revealed the association of both hsp70 (Fig. 4) and hsp90α transcription sites (data not shown) with the speckles only in cells exposed to 42°C.

Other Stresses Also Induce a Tight Association of Active hsp Genes with SC35 Speckles

To exclude that the redistribution of splicing factors following heat shock was due solely to the effects of elevated temperatures on nuclear organization, heat shock gene transcription was activated by exposure to azetidine or cadmium (Mosser et al., 1988 Williams and Morimoto, 1990). Both treatments resulted in an increase in hsp70 and hsp90α mRNA levels comparable to those induced by a 42°C heat shock (i.e., a 10.9- and 12.1-fold increase in hsp70 mRNA levels, and a 1.4- and 1.5-fold increase in hsp90α mRNA levels in azetidine- and cadmium-treated cells, respectively) (Fig. 1 a, lanes d and e). This was corroborated by transcriptional run-on assay showing that both genes were actively induced in cadmium- and azetidine-treated cells (data not shown). As shown in Fig. 5, 94% and 95% of the hsp90α transcripts were associated with SC35 speckles in azetidine (Fig. 5 a) and cadmium-treated cells (Fig. 5 c), respectively. Similarly, 90% of the hsp70 transcription sites were associated with SC35 speckles in azetidine-treated cells (Fig. 5 b) and 93% in cadmium-treated cells (Fig. 5 d). These observations confirm and extend the results of the heat-induced association of hsp70 and hsp90α transcription sites with the speckles, and demonstrate that the dynamic relocalization of splicing factors is not caused by the thermal effects of heat shock but is primarily a reflection of the elevated rates of transcription of both gene loci.

Effect of Stress on the Transcription and Splicing Activities of the Cells

Human primary fibroblasts are relatively resistant to heat shock and display a very low percentage of cell death following a 1-h heat shock at 45°C (Jolly et al., 1997b). In addition, general features of nuclear morphology visualized by light microscopy do not appear to be altered by heat exposure (Jolly et al., 1997a). To address whether the different inducers of heat shock gene expression employed here caused a transcriptional arrest, we monitored general transcriptional activity by visualizing the sites of BrUTP incorporation into nascent transcripts (Wansink et al., 1993). As shown in Fig. 6, there was no detectable change in the transcriptional pattern in cells treated with either heat shock, cadmium, or azetidine when compared to control cells.

We next investigated the distribution of RNA Pol II for its presence within the speckles and to determine whether the various stress conditions influenced its distribution. Since substantial variations in Pol II distribution depending on the cell type and the specific antibody used have been reported (Thibodeau and Vincent, 1991 Jiménez-Garcia and Spector, 1993 Bregman et al., 1995 Blencowe et al., 1996 Mortillaro et al., 1996 Zeng et al., 1997 Patturajan et al., 1998), we used three characterized antibodies recognizing different epitopes on the RNA Pol II. As previously reported for other cell types, the POL3/3 antibody, which recognizes an epitope outside of the COOH-terminal domain (CTD) of Pol II and is independent of the phosphorylation state of the enzyme, shows a diffuse nucleoplasmic staining at 37°C (Fig. 7 a) (Krämer et al., 1980 Kontermann et al., 1995). In contrast, the CC-3 antibody, which recognizes a phosphoepitope in the CTD, stains a subpopulation of Pol II concentrated in speckles (Fig. 7 b) (Thibodeau and Vincent, 1991). The MARA3 antibody, which recognizes a phosphoepitope in the CTD different from CC-3, stains both a diffuse population and a subpopulation of the RNA Pol II concentrated in the speckles (Fig. 7 c) (Patturajan et al., 1998). As previously shown by others, these different patterns correspond to different subpopulations of RNA Pol II. In our human primary fibroblasts, at least two distinct hyperphosphorylated forms of RNA Pol II appear to concentrate in the speckles however, whether these subpopulations represent active forms of the enzyme is still unknown. None of these patterns were altered by a 42°C (Fig. 7, d–f) or 45°C heat shock (Fig. 7, g–i), or by cadmium and azetidine treatments (data not shown). These observations showed that in human fibroblasts at least a subpopulation of RNA Pol II was localized to the speckles and that the overall distribution of the enzyme was not affected dramatically by stress.

As RNA splicing is affected by heat shock in many organisms (for review see Jolly and Morimoto, 1999), we chose to examine whether the differential distribution of hsp genes relative to SC35 speckles during stress was a consequence of a potential stress-induced arrest in RNA splicing. In human cells, heat shock results in a redistribution of snRNPs from the speckles to a diffuse nucleoplasmic pattern (Spector et al., 1991). It has also been shown that extracts from HeLa cells heat-shocked at 43°C or higher temperatures are unable to form a functional spliceosome however, the putative factor(s) inactivated by heat remains unidentified (Shukla et al., 1990). To examine whether the association of hsp transcription sites with speckles was due to a heat-induced retention of unprocessed hsp transcripts at the sites of transcription, we analyzed the transcripts of the two intron-containing hsp90α and hsp90β genes from cells exposed to heat shock at 42°C or 45°C, cadmium, or azetidine by RT-PCR using primers surrounding an intron. As shown in Fig. 1 a, the hsp90α and hsp90β transcripts detected under all conditions corresponded only to the expected processed species with no detection of the predicted precursor species.


Fundo

A brief introduction on intron loss during evolution

Spliceosomal introns are sequences that interrupt nuclear genes and will be removed from the corresponding RNA transcripts by spliceosomes. They are found in all eukaryotic groups, but their density, i.e., the average number of introns per gene, varies dramatically among eukaryotes from 8.4 in humans to 0.0075 in the microsporidian Encepalitozoon cuniculi [1-4]. While the origin of spliceosomal introns remains under debate [4-7], accumulating evidence suggests that early eukaryotic ancestors had high intron density (perhaps up to several introns per gene) and that the diversity of intron density among eukaryotic genomes largely reflects varying degrees of intron loss [7-14]. However, the mechanism of the differential losses of introns across eukaryotes has not been thoroughly explored. A popular model for intron loss is homologous recombination between intronless cDNA and the corresponding genomic DNA [1,15-18]. In this model, reverse transcription proceeds from the 3' end to the 5' end of template mRNA and often terminates prematurely. A high frequency of cDNA fragments reverse-transcribed from the 3' end of corresponding mRNAs results in the preferential loss of introns at the 3' side of genes via recombination. This model is supported by observations that the introns in intron-poor genomes are biased toward the 5' end of genes [1,2,15,19]. It is generally assumed that the reverse transcriptases are provided by retrotransposons. Organisms with a low level of retrotransposon activity are expected to have low rates of intron loss in evolution [20]. Plasmodium species, which lack known transposable elements, have much lower rates of intron loss as compared with other eukaryotic lineages, such as plants, fungi, and nematodes [21]. However, the rates of intron loss in Plasmodium species are comparable with those in vertebrates [21], the genomes of which are abundant in retrotransposons [22,23]. Another hypothesis is that segregation of germ and soma during development makes germ line cells express a lower proportion of genes than somatic cells in lower eukaryotes genes that are expressed only in somatic cells are thus expected to be immune from mRNA-mediated intron losses [24]. By analyzing the whole-genome sequence alignments of human, mouse, rat, and dog, Coulombe-Huntington and Majewski [25] found that most of the intron-loss events occurred within housekeeping genes. However, housekeeping genes still have more introns than tissue-specific genes [26,27]. It seems that the hypothesis involving mRNA-mediated intron loss does not provide a sound explanation of the high density of introns in vertebrates.

The second model of intron loss is genomic deletion via unequal recombination between two copies of genomic DNA [28-30]. To my knowledge, this model provides little insight for the varying degrees of intron losses among eukaryotic genomes. In this study, I propose that the majority of spliceosomal introns in vertebrate genomes may be maintained by a selective force against intron loss: exon definition.

Exon definition places a length constraint on internal exons

Although most of the key components of spliceosomes are present in all eukaryotic organisms [31], there are two mechanisms of splicing-site recognition: exon definition and intron definition [32-35]. In exon definition, splicing machinery first searches for a pair of splicing sites in every exon. By contrast, in intron definition, the intron itself acts as the unit of recognition, and splicing machinery directly searches for two intronic splicing sites. The splicing machinery of exon definition imposes a length constraint on exons but does not affect intron size. By contrast, the splicing machinery of intron definition limits the size of introns, but not that of exons. Previous studies have shown that exon definition is the major splicing-site-recognition mechanism for vertebrate genes that consist of small exons separated by large introns, while intron definition is common in lower eukaryotes, where small introns are flanked by large exons [32-37]. Em vitro, expanding the small internal exons of vertebrate genes to 300 nt inhibits the assembly of spliceosomes [38]. De forma similar, na Vivo analysis of a gene with long introns showed that exon size turned out to be problematic when it was expanded to 432 nt, and exon skipping became predominant when the exon was expanded to 526 nt [39].


Visitors make themselves at home: core creep

Many lines of evidence suggest that both group I and group II introns were ancestrally ORF-less, only to be invaded multiple independent times to create composite mobile elements. Notably, ORFs are located at different positions within introns similar introns contain different ORFs and similar ORFs occur in divergent introns. Several hypotheses have been put forward to explain the origin and evolution of mobile introns [42-46], with each hypothesis relying on illegitimate recombination pathways to create a composite mobile intron consisting of intron and endonuclease ORF. These hypotheses do not, however, address the evolutionary and functional ramifications of the overlap of protein ORFs with key structural elements of their host introns. Also worth considering are the multiple selective pressures on ORFs that extend into the ribozyme core: the ORF sequence must evolve in such a way so as not to accumulate substitutions that adversely affect endonuclease activity (and hence affect the spread and retention of the intron in populations) while at the same time it must co-evolve with disparate regions of the intron to ensure that secondary structure elements necessary for splicing are maintained by compensatory base-pairing interactions.

We propose an alternative scenario for invasion of introns by ORFs in which ORF insertion into peripheral loops of the introns was favored, such that the ORF sequence did not overlap with core intron sequences, thus limiting any phenotypic cost associated with reduced intron splicing. This scenario also avoids the requirement that the invading ORF would have to contain exactly the same nucleotides as it was replacing in order to maintain the crucial base pairing required for intron folding. Instead, we argue that the current overlap of intron ORFs with core intron sequences occurred after invasion by a process we term 'core creep'. Essentially, this is an extension of the coding region by mutation of an existing termination codon into one specifying an amino acid, so that the ORF is extended until the next occurrence of an in-frame termination codon. For intron-encoded ORFs that underwent core creep, the next termination codon could lie within ribozyme core sequences, resulting in the overlap exhibited in many intron-ORF arrangements. Similarly, selection of an alternative initiation codon can account for the observation that the 5' ends of some endonuclease ORFs include intron core sequences.

Importantly, this hypothesis gives rise to a number of testable predictions. First, the length of the 5' or 3' extension should be variable for each independent case of endonuclease invasion, and the position of the initiation or termination codon should be influenced by the GC content of the intron because termination and initiation codons are slightly more AT rich than GC rich and the GC content of the intron will therefore influence the probability of mutation of a sense codon into a nonsense (stop) codon. The second prediction is that the sequence at the 5' or 3' ends of an endonuclease ORF that extends into the intron may not be essential for endonuclease function. In the case of I-TevI, the 20 nucleotides that extend into the td intron encode 6 amino acids on the carboxy-terminal end of I-TevI (out of a total 245 amino acids). In the crystal structure of the I-TevI DNA-binding domain bound to DNA representing either its homing target site or its target operator site, only one of the carboxy-terminal residues (Tyr242) makes a hydrogen bond to the phosphate backbone of the DNA substrate, clearly not providing any specificity to the interaction of I-TevI with its DNA substrate [47]. Bioinformatic searches with the I-TevI amino acid sequence also show that the carboxyl terminus is variable in length and composition (DRE, unpublished observations), implying that it is not critical for function.


CONCLUDING REMARKS

Evidence from biochemistry and comparative genomics strongly suggests that spliceosomal introns originated and proliferated during the origin of eukaryotes, in a process intimately linked to other evolutionary events of eukaryogenesis. The resulting portrait of the LECA spliceosomal system was comparable to that of intron-rich modern eukaryotic organisms, with myriad introns, complex splicing machinery, and coupling of splicing to other cellular processes. From that complex ancestor, intron–exon structures have been highly plastic throughout eukaryotic evolution, with cases of extreme divergence from their ancestors that shaped the genomic landscapes of eukaryotes probably like no other. Particularly remarkable are the multiple instances of recurrent evolution of multiple features, including massive intron loss, constraint of splicing signals, restriction of BP-3′ss distance, loss of polypyrimidine tract, and complete loss of U12 introns.


Assista o vídeo: Introns and Exons (Novembro 2021).