Em formação

Por que grandes quantidades de DNA são necessárias para análise?


Eu sei que o PCR é usado para criar grandes quantidades de cópias de genes e que é um avanço científico, mas quero entender por quê. Por que precisamos de grandes quantidades de DNA para poder analisá-lo, para utilizá-lo. Uma única molécula de DNA não é suficiente?


Em primeiro lugar, uma amostra de DNA obtida de uma célula ou qualquer outra coisa nunca irá conter apenas a sequência de DNA que você deseja, mas em vez disso conterá todo o DNA genômico, plasmídeos, sequências de RNA e outros enfeites. Usando o PCR, você pode multiplicar seletivamente a quantidade da sequência de DNA desejada, enquanto as sequências indesejadas não são copiadas. Mantenha a PCR em andamento por tempo suficiente e a quantidade de DNA indesejável versus a sequência de DNA desejada se tornará insignificante. Nesse ponto, você pode fazer qualquer experimento que quiser com sua amostra de DNA e estar razoavelmente certo de que qualquer resultado obtido é causado inteiramente por sua sequência de DNA de interesse.

Em segundo lugar, mesmo se você pudesse isolar uma única molécula de DNA, o que faria com ela? Você não poderia determinar seu comprimento por eletroforese em gel, pois uma única molécula de DNA não faria uma banda visível e construí-la em um plasmídeo provavelmente falhará, pois você terá apenas 1 chance. Você provavelmente nem seria capaz de dizer que tem uma molécula de DNA, pois as máquinas em seu laboratório diário não são sensíveis o suficiente para detectar uma única molécula de DNA.

Em terceiro lugar, ter uma grande quantidade de DNA permite realizar diferentes experimentos com a mesma amostra. A maioria dos métodos de análise de DNA que conheço são destrutivos, pois o DNA usado não pode ser reutilizado para outro experimento, portanto, uma quantidade grande o suficiente de DNA para realizar todos os experimentos planejados sem ter que obter uma nova amostra (e introduzir todos os tipos de problemas potenciais) é útil.

Portanto, em resumo, o PCR nos permite filtrar a sequência de DNA desejada de uma amostra, realizar análises significativas nessa sequência e nos permite usar uma amostra para vários experimentos. Pode haver ainda mais vantagens para o PCR do que eu perdi, mas essas foram as que me vieram à mente.


Muitos dos métodos usados ​​para visualizar a presença de DNA, como a eletroforese em gel, baseiam-se na análise visual, seja por olho humano ou por máquina. Para isso, é necessária uma quantidade significativa de DNA além do que pode ser extraído diretamente de uma fonte específica. Essa necessidade é agravada pelo fato de que o DNA é normalmente dividido em fragmentos para análise.

Role na parte inferior deste link para ver um exemplo de gel. https://en.wikipedia.org/wiki/Gel_electrophoresis


RFLP e os aplicativos de análise de DNA

O Polimorfismo do Comprimento do Fragmento de Restrição (RFLP) é um método molecular de análise genética que permite que os indivíduos sejam identificados com base em padrões únicos de corte com enzimas de restrição em regiões específicas do DNA.

Também conhecida como Análise RFLP, a técnica tira proveito dos polimorfismos nos códigos genéticos de cada pessoa. Embora todos os membros de uma espécie tenham essencialmente a mesma composição genética, essas pequenas diferenças são responsáveis ​​por variações no fenótipo, como aparência ou metabolismo, entre os indivíduos.


Por que grandes quantidades de DNA são necessárias para análise? - Biologia

Figura 1. Friedrich Miescher (1844–1895) descobriu os ácidos nucléicos.

Nossa compreensão atual do DNA começou com a descoberta dos ácidos nucléicos, seguida pelo desenvolvimento do modelo de dupla hélice. Na década de 1860, Friedrich Miescher (Figura 1), um médico de profissão, isolou produtos químicos ricos em fosfato dos glóbulos brancos (leucócitos). Ele nomeou esses produtos químicos (que eventualmente seriam conhecidos como DNA) nucleína porque eles foram isolados do núcleo das células.

Para ver Miescher conduzindo um experimento passo a passo, clique nesta revisão de como ele descobriu o papel-chave do DNA e das proteínas no núcleo.

Meio século depois, em 1928, o bacteriologista britânico Frederick Griffith relatou a primeira demonstração de transformação bacteriana - um processo no qual o DNA externo é absorvido por uma célula, mudando assim sua morfologia e fisiologia. Griffith conduziu seus experimentos com Streptococcus pneumoniae, uma bactéria que causa pneumonia. Griffith trabalhou com duas cepas dessa bactéria chamadas áspera (R) e lisa (S). (Os dois tipos de células foram chamados de "ásperas" e "lisas" após o aparecimento de suas colônias cultivadas em uma placa de ágar nutriente.)

A cepa R não é patogênica (não causa doenças). A cepa S é patogênica (causadora de doenças) e possui uma cápsula fora de sua parede celular. A cápsula permite que a célula escape das respostas imunológicas do camundongo hospedeiro.

Quando Griffith injetou a cepa viva S em camundongos, eles morreram de pneumonia. Em contraste, quando Griffith injetou a cepa R viva em camundongos, eles sobreviveram. Em outro experimento, quando ele injetou camundongos com a cepa S morta pelo calor, eles também sobreviveram. Este experimento mostrou que a cápsula por si só não era a causa da morte. Em um terceiro conjunto de experimentos, uma mistura de cepa R viva e cepa S morta pelo calor foi injetada em camundongos e - para sua surpresa - os camundongos morreram. Ao isolar as bactérias vivas do camundongo morto, apenas a cepa S de bactérias foi recuperada. Quando esta cepa S isolada foi injetada em camundongos frescos, os camundongos morreram. Griffith concluiu que algo havia passado da cepa S morta pelo calor para a cepa R viva e a transformou na cepa S patogênica. Ele chamou isso de princípio transformador (Figura 2). Esses experimentos são agora conhecidos como experimentos de transformação de Griffith & # 8217s.

Figura 2. Duas cepas de S. pneumoniae foram usados ​​nos experimentos de transformação de Griffith. A cepa R não é patogênica. A cepa S é patogênica e causa a morte. Quando Griffith injetou em um camundongo a cepa S morta pelo calor e uma cepa R viva, o camundongo morreu. A cepa S foi recuperada do camundongo morto. Assim, Griffith concluiu que algo havia passado da cepa S morta pelo calor para a cepa R, transformando a cepa R em S no processo. (crédito & # 8220 mouse vivo & # 8221: modificação do trabalho por NIH crédito & # 8220 mouse morto & # 8221: modificação do trabalho por Sarah Marriage)

Os cientistas Oswald Avery, Colin MacLeod e Maclyn McCarty (1944) estavam interessados ​​em explorar mais esse princípio de transformação. Eles isolaram a cepa S dos camundongos mortos e isolaram as proteínas e os ácidos nucléicos (RNA e DNA), pois eram possíveis candidatos à molécula da hereditariedade. Eles usaram enzimas que degradaram especificamente cada componente e então usaram cada mistura separadamente para transformar a cepa R. Eles descobriram que, quando o DNA era degradado, a mistura resultante não era mais capaz de transformar a bactéria, enquanto todas as outras combinações eram capazes de transformar a bactéria. Isso os levou a concluir que o DNA era o princípio transformador.

Cientistas forenses e análise de DNA

Cientistas forenses usaram evidências de análise de DNA pela primeira vez para resolver um caso de imigração. A história começou com um adolescente voltando de Gana para Londres para ficar com sua mãe. As autoridades de imigração do aeroporto suspeitavam dele, pensando que ele estava viajando com um passaporte falso. Depois de muita persuasão, ele foi autorizado a ir morar com sua mãe, mas as autoridades de imigração não desistiram do caso contra ele. Todos os tipos de provas, incluindo fotografias, foram fornecidos às autoridades, mas mesmo assim os procedimentos de deportação foram iniciados. Na mesma época, o Dr. Alec Jeffreys, da Leicester University, no Reino Unido, inventou uma técnica conhecida como impressão digital de DNA. As autoridades de imigração procuraram o Dr. Jeffreys para obter ajuda. Ele pegou amostras de DNA da mãe e de três filhos, bem como de uma mãe não aparentada, e comparou as amostras com o DNA do menino. Como o pai biológico não estava na foto, o DNA dos três filhos foi comparado com o DNA do menino. Ele encontrou uma correspondência no DNA do menino para a mãe e seus três irmãos. Ele concluiu que o menino era realmente filho da mãe.

Cientistas forenses analisam muitos itens, incluindo documentos, caligrafia, armas de fogo e amostras biológicas. Eles analisam o conteúdo de DNA do cabelo, sêmen, saliva e sangue e o comparam com um banco de dados de perfis de DNA de criminosos conhecidos. A análise inclui isolamento, sequenciamento e análise de sequência de DNA. Os cientistas forenses devem comparecer às audiências do tribunal para apresentar suas descobertas. Eles geralmente são empregados em laboratórios criminais de agências governamentais municipais e estaduais. Os geneticistas que fazem experiências com técnicas de DNA também trabalham para organizações científicas e de pesquisa, indústrias farmacêuticas e laboratórios de faculdades e universidades. Os alunos que desejam seguir a carreira de cientista forense devem ter pelo menos um diploma de bacharel em química, biologia ou física e, de preferência, alguma experiência de trabalho em laboratório.

Embora os experimentos de Avery, McCarty e McLeod tivessem demonstrado que o DNA era o componente informativo transferido durante a transformação, o DNA ainda era considerado uma molécula muito simples para transportar informações biológicas. As proteínas, com seus 20 aminoácidos diferentes, eram consideradas candidatas mais prováveis. O experimento decisivo, conduzido por Martha Chase e Alfred Hershey em 1952, forneceu evidências confirmatórias de que o DNA era de fato o material genético e não as proteínas. Chase e Hershey estavam estudando um bacteriófago - um vírus que infecta bactérias. Os vírus normalmente têm uma estrutura simples: um revestimento de proteína, chamado de capsídeo, e um núcleo de ácido nucleico que contém o material genético (DNA ou RNA). O bacteriófago infecta a célula bacteriana hospedeira ligando-se à sua superfície e, em seguida, injeta seus ácidos nucléicos dentro da célula. O DNA do fago faz várias cópias de si mesmo usando a maquinaria do hospedeiro e, eventualmente, a célula hospedeira explode, liberando um grande número de bacteriófagos. Hershey e Chase selecionaram elementos radioativos que distinguiriam especificamente a proteína do DNA nas células infectadas. Eles rotularam um lote de fago com enxofre radioativo, 35 S, para rotular o revestimento de proteína. Outro lote de fago foi marcado com fósforo radioativo, 32 P. Como o fósforo é encontrado no DNA, mas não na proteína, o DNA e não a proteína seria marcado com fósforo radioativo. Da mesma forma, o enxofre está ausente do DNA, mas presente em vários aminoácidos, como metionina e cisteína.

Cada lote de fago foi permitido infectar as células separadamente. Após a infecção, a suspensão bacteriana do fago foi colocada em um liquidificador, o que fez com que o revestimento do fago se desprendesse da célula hospedeira. As células expostas por tempo suficiente para que a infecção ocorresse foram então examinadas para ver qual das duas moléculas radioativas havia entrado na célula. O fago e a suspensão bacteriana foram centrifugados em uma centrífuga. As células bacterianas mais pesadas se estabeleceram e formaram uma pelota, enquanto as partículas mais leves do fago permaneceram no sobrenadante. No tubo que continha o fago marcado com 35 S, o sobrenadante continha o fago marcado radioativamente, enquanto nenhuma radioatividade foi detectada no sedimento. No tubo que continha o fago marcado com 32 P, a radioatividade foi detectada no pellet que continha as células bacterianas mais pesadas, e nenhuma radioatividade foi detectada no sobrenadante. Hershey e Chase concluíram que foi o DNA do fago que foi injetado na célula e carregou informações para produzir mais partículas de fago, fornecendo evidências de que o DNA era o material genético e não as proteínas (Figura 3).

Figura 3. Em experimentos de Hershey e Chase & # 8217s, as bactérias foram infectadas com fago marcado radioactivamente com 35S, que marca a proteína, ou 32P, que marca o DNA. Apenas 32P entrou nas células bacterianas, indicando que o DNA é o material genético.

Por volta da mesma época, o bioquímico austríaco Erwin Chargaff examinou o conteúdo do DNA em diferentes espécies e descobriu que as quantidades de adenina, timina, guanina e citosina não foram encontradas em quantidades iguais e que as concentrações relativas das quatro bases de nucleotídeos variaram entre as espécies às espécies, mas não dentro de tecidos do mesmo indivíduo ou entre indivíduos da mesma espécie. Ele também descobriu algo inesperado: que a quantidade de adenina era igual à quantidade de timina e a quantidade de citosina era igual à quantidade de guanina (ou seja, A = T e G = C). Espécies diferentes tinham quantidades iguais de purinas (A + G) e pirimidinas (T + C), mas diferentes razões de A + T para G + C. Essas observações ficaram conhecidas como Regras de Chargaff . As descobertas de Chargaff & # 8217s provaram ser extremamente úteis quando Watson e Crick estavam se preparando para propor seu modelo de dupla hélice de DNA! Depois de ler as últimas páginas, você pode ver como a ciência se baseia em descobertas anteriores, às vezes em um processo lento e trabalhoso.

Pergunta Prática

Os experimentos de Hershey e Chase ajudaram a confirmar que o DNA era o material hereditário com base na descoberta de que:

  1. fagos radioativos foram encontrados no sedimento
  2. células radioativas foram encontradas no sobrenadante
  3. enxofre radioativo foi encontrado dentro da célula
  4. fósforo radioativo foi encontrado na célula

Em Resumo: A História do DNA

O DNA foi isolado pela primeira vez dos glóbulos brancos por Friedrich Miescher, que o chamou de nucleína porque foi isolado dos núcleos. Experimentos de Frederick Griffith & # 8217s com cepas de Streptococcus pneumoniae forneceu a primeira dica de que o DNA pode ser o princípio transformador. Avery, MacLeod e McCarty provaram que o DNA é necessário para a transformação de bactérias. Experimentos posteriores de Hershey e Chase usando o bacteriófago T2 provaram que o DNA é o material genético. Chargaff descobriu que a proporção de A = T e C = G, e que o conteúdo percentual de A, T, G e C é diferente para espécies diferentes.


Quando um se torna dois: separando o DNA para uma análise de nanoporos mais precisa

Uma nova ferramenta de software desenvolvida por pesquisadores do Earlham Institute ajudará os bioinformáticos a melhorar a qualidade e a precisão de seus dados biológicos e a evitar montagens incorretas. A ferramenta rápida, leve e fácil de usar visualiza conjuntos de genomas e alinhamentos de genes a partir das tecnologias de sequenciamento de última geração.

Chamada de Alvis, a nova ferramenta de visualização examina mapeamentos entre dados de sequência de DNA e bancos de dados de genoma de referência. Isso permite que os bioinformáticos analisem mais facilmente seus dados gerados a partir de tarefas e formatos genômicos comuns, produzindo imagens vetoriais prontas e eficientes.

O primeiro autor e cientista pós-doutorado do Earlham Institute, Dr. Samuel Martin do Leggett Group, disse: "Normalmente, as ferramentas de alinhamento geram arquivos de texto simples contendo listas de dados de alinhamento. Isso é ótimo para análise de computador e para ser incorporado em um pipeline, mas pode ser difícil de interpretar por humanos.

"A visualização dos dados de alinhamento pode nos ajudar a entender o problema em questão. Como uma nova tecnologia, vários novos formatos de alinhamento foram implementados por novas ferramentas que são específicas para a tecnologia de sequenciamento de nanopore.

"Descobrimos que as ferramentas de visualização existentes não eram capazes de interpretar esses formatos. Alvis pode ser usado com todos os formatos de alinhamento comuns e é facilmente extensível para formatos futuros."

Um recurso importante da nova ferramenta de linha de comando é sua capacidade única de destacar automaticamente sequências quiméricas - elos fracos na cadeia de DNA. É aqui que duas sequências - de partes diferentes de um genoma ou de espécies diferentes - são ligadas por engano para formar uma, afetando a precisão dos dados.

As sequências de quimera podem ser problemáticas para bioinformáticos ao identificar DNA específico. A formação da quimera pode acontecer fisicamente às moléculas de DNA durante a preparação da biblioteca de sequenciamento, durante o processo de sequenciamento em algumas plataformas e por ferramentas de montagem ao tentar juntar um genoma.

Durante o desenvolvimento da ferramenta, a equipe comparou conjuntos de genoma com e sem o uso de detecção de quimera Alvis. A imagem vetorial produzida mostra um exemplo de saída, em que a ferramenta intuitiva rastreia todas as leituras que reconhece como quimeras.

"Embora as sequências quiméricas não constituam uma grande proporção das amostras, elas podem ter um efeito significativo, por isso temos que ter cuidado para não identificá-las durante a análise", disse o Dr. Martin.

"No exemplo do diagrama de Alvis de dados quimera, cada retângulo na página representa uma leitura e os blocos coloridos dentro deles representam alinhamentos. A maioria das quimeras são fáceis de ver porque seus alinhamentos são de cores diferentes, o que significa que mapeiam para genomas diferentes. Outros são mais sutil porque ambos os alinhamentos são para o mesmo genoma, mas em regiões diferentes. "

A ferramenta Alvis pode apontar a visualização de apenas sequências quiméricas para inspeção posterior e produzir dados numéricos que descrevem as quimeras. Isso demonstra que, aplicando a ferramenta e, em seguida, dividindo bioinformaticamente as quimeras, a qualidade dos conjuntos é significativamente melhorada.

Acessado mais de 600 vezes desde que foi disponibilizado no início de março deste ano, o Dr. Martin, acrescenta: "Esperamos que Alvis continue a ser útil para outros pesquisadores que trabalham com, por exemplo, sequenciamento de nanoporos, melhorando a compreensão de seus dados visualizando alinhamentos , ''.

"Os alinhamentos são tão fundamentais para a bioinformática que podem ser úteis para qualquer pessoa que trabalhe com dados de sequenciamento de leitura longa, bem como alinhamentos gerados por dados de sequenciamento de plataformas de leitura curta. Os diagramas gerados por Alvis podem ser facilmente exportados para uso direto em publicações , já demonstrado em nosso estudo. "


Para que é utilizado o PCR?

Uma vez amplificado, o DNA produzido por PCR pode ser usado em diversos procedimentos laboratoriais. Por exemplo, a maioria das técnicas de mapeamento no Projeto Genoma Humano (HGP) dependia de PCR.

A PCR também é valiosa em uma série de técnicas laboratoriais e clínicas, incluindo impressões digitais de DNA, detecção de bactérias ou vírus (particularmente AIDS) e diagnóstico de doenças genéticas.

Uma vez amplificado, o DNA produzido por PCR pode ser usado em diversos procedimentos laboratoriais. Por exemplo, a maioria das técnicas de mapeamento no Projeto Genoma Humano (HGP) dependia de PCR.

A PCR também é valiosa em uma série de técnicas laboratoriais e clínicas, incluindo impressões digitais de DNA, detecção de bactérias ou vírus (particularmente AIDS) e diagnóstico de doenças genéticas.


Quem descobriu a estrutura do DNA?

A estrutura de dupla hélice do DNA foi descoberta pela primeira vez em 1953 por James Watson (um biólogo americano), Francis Crick (um físico inglês) e Rosalind Franklin (um químico inglês). Embora apenas Watson e Crick tenham recebido o crédito pela descoberta da dupla hélice, acredita-se que eles fizeram sua descoberta com a ajuda dos dados de Franklin. Franklin era especialista em uma técnica de imagem chamada cristalografia de raios X, que ela usou para produzir a primeira imagem da forma helicoidal do DNA.

Watson e Crick receberam o Prêmio Nobel por seu trabalho em 1962. Apesar de sua contribuição para a descoberta, Franklin não recebeu o prêmio, tendo morrido de câncer quatro anos antes.


Perguntas preliminares

Discuta o seguinte entre vocês. Esteja pronto para compartilhar suas idéias com o resto da classe.

  1. A ampicilina é um derivado do antibiótico penicilina. Ele interrompe a formação da parede celular nas células bacterianas, o que as mata. No entanto, nosso plasmídeo recombinante contém um gene que fornece resistência a antibióticos ao produzir uma proteína que decompõe a ampicilina. Por que incluímos ampicilina no meio de teste?
  2. O que acontecerá se as células transformadas não crescerem na presença do indutor químico?
  3. No experimento, você adicionará os grupos de células experimentais e de controle a diferentes combinações de mídia. O que você prevê para cada condição? Preencha tabela 1 indicando se você prevê crescimento ou nenhum crescimento e, se houver crescimento, haverá crescimento mínimo ou muito crescimento.

Leia os procedimentos abaixo e descreva as etapas, usando palavras e um fluxograma em seu caderno de laboratório.


Como o DNA está organizado na célula

O DNA é uma molécula funcional que deve ser replicada quando uma célula está pronta para se dividir e deve ser “lido” para produzir as moléculas, como as proteínas, para realizar as funções da célula. Por esse motivo, o DNA é protegido e embalado de maneiras muito específicas. Além disso, as moléculas de DNA podem ser muito longas. Esticadas de ponta a ponta, as moléculas de DNA em uma única célula humana chegariam a um comprimento de cerca de 2 metros. Assim, o DNA de uma célula deve ser empacotado de uma forma muito ordenada para se ajustar e funcionar dentro de uma estrutura (a célula) que não é visível a olho nu. Os cromossomos dos procariontes são muito mais simples do que os dos eucariotos em muitas de suas características (Figura 9.6). A maioria dos procariotos contém um único cromossomo circular que é encontrado em uma área do citoplasma chamada nucleóide.

Figura 9.6 Um eucarioto contém um núcleo bem definido, enquanto nos procariontes, o cromossomo fica no citoplasma em uma área chamada nucleóide.

O tamanho do genoma em um dos procariontes mais bem estudados, Escherichia coli, é 4,6 milhões de pares de bases, o que se estenderia por uma distância de cerca de 1,6 mm se esticado. Então, como isso se encaixa dentro de uma pequena célula bacteriana? O DNA é torcido além da dupla hélice no que é conhecido como superenrolamento. Sabe-se que algumas proteínas estão envolvidas no superenrolamento de outras proteínas e enzimas ajudam a manter a estrutura superenrolada.

Os eucariotos, cujos cromossomos consistem em uma molécula linear de DNA, empregam um tipo diferente de estratégia de empacotamento para encaixar seu DNA dentro do núcleo. No nível mais básico, o DNA envolve proteínas conhecidas como histonas para formar estruturas chamadas nucleossomos. O DNA é enrolado firmemente em torno do núcleo da histona. Esse nucleossomo está ligado ao próximo por uma pequena fita de DNA livre de histonas. Isso também é conhecido como a estrutura de "contas em um fio", os nucleossomos são as "contas" e os comprimentos curtos de DNA entre eles são o "fio". Os nucleossomos, com seu DNA enrolado em torno deles, empilham-se compactamente uns sobre os outros para formar uma fibra de 30 nm de largura. Esta fibra é posteriormente enrolada em uma estrutura mais espessa e compacta. No estágio de metáfase da mitose, quando os cromossomos estão alinhados no centro da célula, os cromossomos estão mais compactados. Eles têm aproximadamente 700 nm de largura e são encontrados em associação com proteínas-esqueleto.

Na interfase, a fase do ciclo celular entre as mitoses na qual os cromossomos são descondensados, os cromossomos eucarióticos têm duas regiões distintas que podem ser distinguidas por coloração. Há uma região bem embalada que fica escura e uma região menos densa. As regiões de coloração escura geralmente contêm genes que não são ativos e são encontrados nas regiões do centrômero e telômeros. As regiões com coloração leve geralmente contêm genes que são ativos, com DNA empacotado em torno dos nucleossomos, mas não compactado posteriormente.

Figura 9.7 Estas figuras ilustram a compactação do cromossomo eucariótico.


Engenharia genética em plantas

Por causa de sua importância econômica, as plantas há muito tempo são objeto de análises genéticas com o objetivo de desenvolver variedades melhoradas. A tecnologia do DNA recombinante introduziu uma nova dimensão a esse esforço porque as modificações do genoma possibilitadas por essa tecnologia são quase ilimitadas. A reprodução não se limita mais à seleção de variantes dentro de uma determinada espécie. O DNA agora pode ser introduzido a partir de outras espécies de plantas, animais ou mesmo bactérias.

Plasmídeo Ti. & # X02003 & # x02003

Os únicos vetores usados ​​rotineiramente para produzir plantas transgênicas são derivados de uma bactéria do solo chamada Agrobacterium tumefaciens. Esta bactéria causa o que é conhecido como doença da galha da coroa, em que a planta infectada produz crescimentos descontrolados (tumores ou galhas), normalmente na base (coroa) da planta. A chave para a produção do tumor é um grande plasmídeo de DNA circular (200 kb) & # x02014 o plasmídeo Ti (indutor de tumor). Quando a bactéria infecta uma célula vegetal, uma parte do plasmídeo Ti & # x02014 uma região chamada T-DNA & # x02014 é transferida e inserida, aparentemente mais ou menos ao acaso, no genoma da planta hospedeira (Figura 13-14 ) As funções necessárias para esta transferência estão fora do T-DNA no plasmídeo Ti. O próprio T-DNA carrega várias funções interessantes, incluindo a produção do tumor e a síntese de compostos chamados opina. Opinas são realmente sintetizadas para a planta hospedeira sob a direção do T-DNA. A bactéria então usa opina para seus próprios fins, invocando genes que utilizam opina no plasmídeo Ti. Dois opines importantes são a nopalina e a octopina, dois plasmídeos Ti separados os produzem. A estrutura do Ti é mostrada na Figura 13-15.

Figura 13-14

No processo de causar a doença da galha em coroa, a bactéria A. tumefaciens insere uma parte de seu plasmídeo Ti & # x02014 uma região chamada T-DNA & # x02014 em um cromossomo da planta hospedeira.

Figura 13-15

Representação simplificada das principais regiões do plasmídeo Ti de A. tumefaciens. O T-DNA, quando inserido no DNA cromossômico da planta hospedeira, direciona a síntese da nopalina, que é então utilizada pela bactéria para seus próprios fins. T-DNA (mais.)

O comportamento natural do plasmídeo Ti o torna bem adequado para o papel de um vetor de planta. Se o DNA de interesse pudesse ser unido ao T-DNA, todo o pacote seria inserido em um estado estável no cromossomo de uma planta. Este sistema foi feito para funcionar essencialmente desta forma, mas com algumas modificações necessárias. Vamos examinar um protocolo.

Os plasmídeos Ti são muito grandes para serem facilmente manipulados e não podem ser facilmente reduzidos, porque contêm poucos locais de restrição exclusivos. Consequentemente, um vetor intermediário menor recebe inicialmente a inserção de interesse e os vários outros genes e segmentos necessários para recombinação, replicação e resistência a antibióticos. Quando projetado com os elementos de gene desejados, este vetor intermediário pode então ser inserido no plasmídeo Ti, formando um plasmídeo cointegrado que pode ser introduzido em uma célula vegetal por transformação. A Figura 13-16a mostra um método de criação do cointegrado. O plasmídeo Ti que receberá o vetor intermediário é primeiro atenuado, isto é, tem toda a região direita de seu T-DNA, incluindo genes de tumor e genes de síntese de nopalina, deletados, tornando-o incapaz de formação de tumor & # x02014 a & # x0201 incômodo & # x0201d aspecto da função T-DNA. Ele retém a borda esquerda de seu T-DNA, que será usado como o local de cruzamento para a incorporação do vetor intermediário. O vetor intermediário teve um segmento de clonagem conveniente unido, contendo uma variedade de locais de restrição únicos. O gene de interesse foi inserido neste local na Figura 13-16. Também unido ao vetor está um gene bacteriano selecionável (spc R) para resistência à espectinomicina, um gene bacteriano de resistência à canamicina (kan R), projetado para expressão em plantas e dois segmentos de T-DNA. Um segmento carrega o gene de síntese de nopalina (ns) mais a sequência da borda direita do T-DNA. O segundo segmento de T-DNA vem próximo à borda esquerda e fornece uma seção para recombinação com uma parte homóloga da região esquerda, que foi retida no plasmídeo Ti desarmado. Depois que os vetores intermediários foram introduzidos em Agrobacterium células contendo os plasmídeos Ti desarmados (por conjugação com E. coli), os plasmídeos recombinantes (cointegrados) podem ser selecionados por plaqueamento em espectinomicina. As colônias bacterianas selecionadas conterão apenas o plasmídeo Ti, porque o vetor intermediário é incapaz de replicação em Agrobacterium.

Figura 13-16

(a) Para produzir plantas transgênicas, um vetor intermediário de tamanho administrável é usado para clonar o segmento de interesse. No método mostrado aqui, o vetor intermediário é então recombinado com um plasmídeo Ti atenuado (& # x0201cdisarmed & # x0201d) para gerar (mais.)

Como mostra a Figura 13-16b, após a seleção com espectinomicina para os cointegrados, bactérias contendo o plasmídeo duplo recombinante, ou cointegrante, são então usadas para infectar segmentos cortados de tecido vegetal, tais como discos de folhas perfurados. Se ocorrer infecção bacteriana em células vegetais, qualquer material genético entre as sequências de borda esquerda e direita do T-DNA pode ser inserido nos cromossomos da planta. Se os discos das folhas forem colocados em um meio contendo canamicina, as únicas células vegetais que irão sofrer divisão celular são aquelas que adquiriram o kan Gene R da transferência de T-DNA. O crescimento dessas células resulta em um aglomerado, ou calo, que é uma indicação de que a transformação ocorreu. Esses calos podem ser induzidos a formar brotos e raízes, momento em que são transferidos para o solo onde se desenvolvem em plantas transgênicas (Figura 13-16b). Freqüentemente, apenas uma inserção de T-DNA é detectável em tais plantas, onde se segrega na meiose como um alelo mendeliano regular (Figura 13-17). A inserção pode ser detectada por uma sonda de T-DNA em uma hibridização Southern ou pode ser verificada pela detecção da nopalina química no tecido transgênico.

Figura 13-17

O T-DNA e qualquer DNA contido nele são inseridos em um cromossomo de planta na planta transgênica e então transmitidos em um padrão de herança Mendeliano.

Expressão de DNA clonado

O DNA clonado no T-DNA pode ser qualquer DNA que o investigador deseja inserir na planta em questão. Um DNA estranho particularmente notável que foi inserido com o uso de T-DNA é o gene para a enzima luciferase, que é isolada de vagalumes. A enzima catalisa a reação de uma substância química chamada luciferina com ATP nesse processo, a luz é emitida, o que explica por que os vagalumes brilham no escuro. Uma planta de tabaco transgênica que expressa o gene da luciferase também brilha no escuro quando regada com uma solução de luciferina (veja a fotografia no início deste capítulo). Essa manipulação pode parecer uma tentativa de desenvolver tecnologia para fazer árvores de Natal que não precisam de luz, mas na verdade o gene da luciferase é útil como um repórter para monitorar a função de qualquer gene durante o desenvolvimento. Em outras palavras, as sequências promotoras a montante de qualquer gene de interesse podem ser fundidas ao gene da luciferase e colocadas em uma planta por T-DNA. Então, o gene da luciferase seguirá o mesmo padrão de desenvolvimento do gene regulado normalmente, mas o gene da luciferase anunciará sua atividade de forma proeminente, brilhando em vários momentos ou em vários tecidos, dependendo da sequência regulatória.

Outros genes usados ​​como repórteres em plantas são os bacterianos GUS (& # x003b2-glucuronidase) gene, que transforma o composto X-Gluc em azul, e a bactéria laca (& # x003b2-galactosidase) gene, que transforma X-Gal em azul. As células nas quais esses repórteres são expressos ficam azuis, e esse azul pode ser facilmente visto a olho nu ou ao microscópio.

As plantas transgênicas que carregam qualquer um de uma variedade de genes estranhos estão em uso atualmente, e muitos mais estão em desenvolvimento. Não apenas as qualidades das próprias plantas estão sendo manipuladas, mas, como os microrganismos, as plantas também estão sendo usadas como & # x0201cfábricas & # x0201d convenientes para produzir proteínas codificadas por genes estranhos.


ESBOÇO DA PRÁTICA

Primeira Sessão Prática

Cada grupo de alunos recebe uma amostra de um plasmídeo com um único sítio EcoRI e que tem cerca de 3 kbp. Usamos pUC118 para os dados mostrados aqui. Eles são informados da concentração aproximada do plasmídeo e do A260 para DNA de fita dupla. Depois de calcular uma diluição apropriada, eles preparam uma alíquota de 1 ml, que é usada para obter A260 e A280 leituras. Eles agora calculam a concentração real de DNA de sua amostra e fazem uma série de diluições que darão quantidades conhecidas de DNA por 10 μl de tampão TE de 1 μg até 1 ng. Alíquotas de dez microlitros das diluições são misturadas com 2 μl de corante de carregamento e as amostras misturadas foram carregadas nos poços de um gel de agarose. Após a eletroforese, os géis são corados com brometo de etídio, visualizados sob luz ultravioleta e a imagem gravada para devolução aos alunos para interpretação.

Segunda Sessão Prática

Nesta sessão, os alunos recebem amostras do plasmídeo usado na primeira sessão e amostras de DNA circular de fita dupla (RFI) e circular de fita simples (SS +) do bacteriófago M13.

Cada grupo de alunos trata o DNA circular covalentemente fechado (ccc, RFI) e o circular de fita simples (SS +) do bacteriófago M13 com DNA Topoisomerase I e com a endonuclease de restrição EcoRI. O DNA de plasmídeo (pUC118) também é tratado com EcoRI e com DNA Topoisomerase I. Após a digestão, as várias formas de DNA de M13 e pUC118 são separadas por eletroforese em gel de agarose na ausência de brometo de etídio. Os géis são corados após eletroforese e visualizados e registrados como na primeira sessão.


O futuro da análise de DNA

As primeiras técnicas de análise de DNA exigiam grandes quantidades de DNA de alta qualidade. No entanto, procedimentos mais novos podem produzir resultados de DNA com amostras muito menores e de qualidade inferior e em um período de tempo muito mais curto. Techniques have also been developed to extract usable DNA from difficult-to-access or contaminated sources.

DNA analysis is still not fool-proof and there are instances when it doesn’t live up to expectations. Usually, DNA analysis provides insights or evidence, but it doesn’t always provide definitive answers. The interpretation of DNA results is still largely dependent on experts, but home DNA testing means that the information contained in your DNA is becoming more accessible and affordable all the time.

Dmitri Synogatch
Joseph Kim

You guys did FANTASTIC ! This really helped me understand more about this topic. you guys may not get a lot of credits but I would like to say thank you for your effort to give such information for average joes like us.

How can I start a DNA test lab in India?

Please let me know the procedure to start a DNA testing lab, the equipments required and the licensing authority.

Sonja jurisic

I am enquiring re my cousin who did DNA test. He got a large procentage for Balkan and Greece. Prior to Slavic move to Balkan, there were Ilyrian tribes in the area and others. What period does Balkan and Greek refers to, prior to Slavic move or after? Obrigado
Sonja Jurisic

Mark Hicks

DNA has changed humanity to it’s extinction. It’s how they are thinning the heard.

Alexander abary

My basic knowledge of DNA analysis, after reading your monologue, is now comprehensive, understandably complete, that I can utilize in years to come. One crazy question: Can you tell a living creature to be half human and half animal belonging to the same species? Just my curiosity.