Em formação

Dobrar a concentração de cálcio extracelular hiperpolariza um neurônio. Porque?


Eu estava fazendo alguns cálculos retrospectivos para tentar responder a essa pergunta em termos mais matemáticos. Essencialmente, a questão afirma: Por que o aumento da concentração extracelular de potássio despolariza um neurônio, enquanto o aumento da concentração extracelular de cálcio hiperpolariza o neurônio?

Meu pensamento inicial era que há uma mudança no potencial de equilíbrio de cada íon. Trabalhando nisso, no entanto, percebi que estava errado em meu raciocínio; minha matemática provou que eu estava errado.

Dobrar a concentração de potássio extracelular torna o potencial de equilíbrio do potássio 17,8 mV mais positivo. Para o cálcio, aumenta a força motriz em 8,9 mV (com base na temperatura ambiente de 300 K). O que isso significa para mim é que ambos farão com que o potencial de repouso do neurônio se torne ligeiramente mais positivo, embora o cálcio menos.

Na verdade, isso é óbvio: adicionar mais íons positivos ao exterior da célula aumenta a força motriz desse íon e, supondo que haja qualquer condutância (embora pequena), haverá alguma despolarização do neurônio.

Isso me faz pensar que este não é um fenômeno explicado por um neurônio em repouso. Algum outro mecanismo é responsável pelo aumento do cálcio extracelular, causando a hiperpolarização do neurônio.

Meus possíveis palpites:

  • Se a concentração de cálcio for dobrada, a força motriz do cálcio aumenta, portanto, há mais influxo de cálcio e, portanto, a concentração interna de cálcio aumentará. Como a concentração de íons de cálcio no interior era anteriormente próxima de zero, agora essa concentração interna aumentará para um número significativo, hiperpolarizando assim o neurônio.

  • A concentração interna de cálcio aumenta ligeiramente, mas em vez de (ou talvez em conjunto com) diminuir o potencial de repouso diretamente, há mais ativação de canais de potássio ativados por cálcio, aumentando assim a condutância dos íons de potássio e, portanto, hiperpolarizando o neurônio.

Estou no caminho certo ou estou perdendo alguma coisa?


Este artigo e este artigo apóiam a segunda possibilidade que eu hipotetizei. Ou seja, um aumento na concentração externa de cálcio leva a um aumento na condutância do potássio.

Enquanto o aumento da concentração externa de potássio pode ser mostrado para despolarizar a célula, calculando o potencial de Nernst para o íon, o íon de cálcio tem um efeito não intuitivo. Isso significa que, se aumentarmos a concentração externa de íons de cálcio, inevitavelmente haverá um pequeno aumento na concentração interna de íons de cálcio no interior. Isso irá influenciar ligeiramente os íons de potássio ativados por cálcio para serem um pouco mais abertos. Aumentando assim a condutância do potássio. Isso significa que há uma corrente hiperpolarizante líquida que mantém a célula menos excitável.


A & ampP Ch.10

Origem: os micróglios aparecem no início do Desenvolvimento Embrionário e estão relacionados às células-tronco que produzem macrófagos e monócitos
A micróglia migra para o SNC à medida que o sistema nervoso se forma e aí ficam isolados

Localização: Forme o revestimento interno do canal central na medula espinhal e as cavidades (ventrículos) do cérebro e cubra os capilares especializados (plexos coróides) que são encontrados nos ventrículos

Contém numerosos sacos membranosos chamados vesículas sinápticas

Envolve transporte ativo de Na + e K +
A bomba de Na + / K + mantém uma maior concentração de Na + fora da célula e uma maior concentração de K + dentro da célula

O citoplasma dessas células nervosas contém um grande número de íons carregados negativamente (ânions), como fosfato, sulfato e proteínas

Eles não podem se difundir através das membranas celulares

Referido como diferença de potencial porque representa a energia elétrica armazenada que pode ser usada para fazer o trabalho

A diferença de potencial através da membrana celular é chamada de potencial de membrana e é medida em milivolts

A diferença potencial entre 2 pontos pode ser medida usando dois eletrodos conectados a um voltímetro

Eles têm a capacidade de responder a estímulos, como mudanças de temperatura, luz ou pressão e converter o estímulo em um impulso neural

Tais mudanças ou estímulos geralmente afetam o potencial de repouso em uma determinada região local da membrana celular

Apenas exemplo: Mudança de um potencial de repouso de -70mV para -62mV é despolarização

Apenas exemplo: a mudança de um potencial de repouso de -70mV para -90mV é hiperpolarização

O nível em que um Potencial de Ação é produzido, que é a base para o Impulso Nervoso
Alcançar o limite abre certos canais de íons bloqueados

A propagação dos potenciais de ação ao longo de um axônio é o impulso do nervo. Os potenciais de ação são propagados ao longo do comprimento do axônio como impulsos nervosos

Os axônios são capazes de potenciais de ação, mas o corpo celular e os dendritos NÃO são

Um potencial de ação na zona de gatilho causa uma corrente elétrica que estimula porções adjacentes da membrana do axônio, disparando outro potencial de ação
Despolarização / Repolarização

Despolarizando a membrana

O potencial de repouso torna-se mais positivo
-70mV a + 30 mV no pico do potencial de ação
A despolarização faz com que canais adjacentes de Na + dependentes de voltagem se abram

2. Período Refratário Relativo
O próximo período é quando a membrana está restabelecendo seu potencial de repouso
Durante este período, a membrana só pode ser estimulada com um estímulo de alta intensidade

Aumento da concentração de K + no fluido extracelular:
* Reduz o gradiente de K + para deixar o potencial de limiar celular alcançado com estímulos de menor intensidade leva a neurônios excitáveis, talvez convulsões

Diminuição da concentração de K + no fluido extracelular:
* Os neurônios podem se tornar potenciais de ação hiperpolarizados não são gerados falta de impulsos leva à paralisia muscular

Resulta em uma difusão interna de íons de cálcio (Ca + 2) do fluido extracelular

Moléculas de neurotransmissores irão se difundir através da fenda sináptica

Reagir com moléculas receptoras específicas localizadas dentro ou na membrana do neurônio pós-sináptico

fazer com que os canais iônicos (canais quimicamente bloqueados) abram

Quanto mais Ca + 2 entra no botão sináptico, mais vesículas sinápticas são envolvidas e mais neurotransmissor é liberado

Normalmente, os efeitos de um neurotransmissor duram apenas alguns milissegundos antes de serem encerrados por um dos seguintes mecanismos: decomposição, recaptação ou difusão

2. Recaptação de neurotransmissores
Alguns neurotransmissores são removidos da sinapse por recaptação no terminal pré-sinpático, onde são armazenados ou destruídos por enzimas


Músculo Vascular Cerebral

TRPV4

Os canais TRPV4 facilitam o influxo de cálcio no músculo vascular, mas, surpreendentemente, medeiam a vasodilatação [3]. A ativação dos canais TRPV4 induz a liberação de cálcio induzida por cálcio na forma de faíscas de cálcio dos estoques do retículo sarcoplasmático, mediando assim as respostas ao ácido 11,12-epoxyeicosatrienoico (11,12-EET). As faíscas de cálcio ativam os canais BK causando hiperpolarização do músculo vascular e dilatação.

Outro papel descrito para TRPV4 é a modulação da vasoconstrição induzida por angiotensina II (Ang II). No músculo vascular isolado, a ativação dependente de Ang II de receptores do tipo angiotensina aumentou a atividade do centelhador TRPV4. Em vasos cerebrais intactos, a constrição induzida por Ang II foi compensada pela atividade do TRPV4. Como nas células isoladas, o cálcio dependente de TRPV4 estimula os canais BK ativados para modular a vasoconstrição induzida por Ang II.


Materiais e métodos

Tratamento de animais e tecidos

Os experimentos foram conduzidos em ratos encapuzados Long Evans de acordo com a legislação nacional e regulamentos ARVO. Os animais foram criados em laboratório. As injeções intraoculares em recém-nascidos anestesiados com éter foram realizadas conforme descrito anteriormente (Galli-Resta et al., 2002). As concentrações intraoculares foram determinadas assumindo um volume vítreo de 10 μl em P1, conforme estimado anteriormente (Galli-Resta et al., 2002). A bromodeoxiuridina (BrdU), que é incorporada durante a síntese de DNA (Gratzner, 1982), foi injetada intraperitonealmente (ip 50 mg / kg de peso corporal) a cada 6 horas começando imediatamente antes do tratamento, a fim de marcar todas as células que entram na fase S após o tratamento . A fase S na retina é de 12-18 horas neste estágio (Alexiades e Cepko, 1996). Os animais foram sacrificados por decapitação. A dissecção, fixação, montagem plana retiniana ou corte e imunocitoquímica foram realizados conforme descrito anteriormente (Galli-Resta e Ensini, 1996).

Para controlar a eficácia da apirase na redução dos níveis de e-ATP in vivo, coletamos 5 μl de amostras de fluido da câmara posterior do olho, raciocinando que as alterações nos níveis de ATP neste fluido seriam paralelas às da retina adjacente. Ratos P4 foram anestesiados com avertina (10 ml / kg de peso corporal, i.p.3,3% de tri-bromo-etanol, 2% de álcool amílico terciário em solução salina) 3 horas após a apirase ou injeção intra-ocular de veículo. A ponta (30-50 μm) de uma micropipeta de vidro conectada a uma seringa Hamilton de 25 μl com um pistão micro-dirigido foi inserida na câmara posterior do olho. As amostras foram coletadas sob um microscópio de dissecação para verificar a falta de sangue ou opacidade, e ensaiadas em um luminômetro (Perkin Elmer) para medir os níveis de ATP pelo ensaio luciferina-luciferase. Animais tratados com apirase mostraram uma redução de 50 vezes dos níveis de e-ATP em relação aos controles [2 ± 1 µM de veículo injetado (n= 5 animais), apirase 40 ± 50 nM injetada (n= 5 animais), P& lt0.05, Student's t-teste]. É importante ressaltar que essas concentrações são inferiores às encontradas na retina, onde o e-ATP endógeno atinge concentrações locais em torno de 0,1 mM (Newman, 2001). No entanto, uma vez que não se difunde muito (aproximadamente 50 µm) e é rapidamente degradado (Newman, 2001), sua concentração final, uma vez diluída no humor vítreo, é muito menor.

Rotulagem por arma genética de retinas explantadas

A imagem de neurônios vivos foi realizada em retinas explantadas de ratos neonatais. As idades foram distribuídas uniformemente entre P2 e P8. As retinas foram rapidamente dissecadas em líquido cefalorraquidiano artificial recém-feito (Stacy e Wong, 2003), achatadas em filtros de nitrocelulose Millipore de 13 mm e colocadas em placas de Petri contendo líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) em uma câmara de incubação oxigenada e umidificada em temperatura ambiente (25- 28 ° C). Células individuais foram marcadas com dextranos conjugados com fluorescência entregues ao atirar partículas de tungstênio de 1,3 μm revestidas com corante na retina usando uma arma de gene Bio-Rad (Kettunen et al., 2002). As células colinérgicas foram identificadas por seu posicionamento laminar na retina, sua morfologia de explosão estelar e seu arranjo dendrítico planar, que já são reconhecíveis no início da vida (Stacy e Wong, 2003 Wong e Collin, 1989). Além disso, realizamos um estudo morfológico combinando a transfecção de YFP para marcar células colinérgicas individuais e imunohistoquímica para colina acetiltransferase (ChAT) para ajudar a identificar as células colinérgicas em retinas de rato P2-P13 (dados não publicados). A marcação por arma de gene com dextranos fluorescentes produziu uma média de três a quatro neurônios colinérgicos marcados a cada 10 retinas, de acordo com a frequência relativamente baixa desses neurônios (Jeon et al., 1998).

Imagem celular em retinas isoladas

As retinas foram analisadas a partir de 1-2 horas após a marcação. As imagens das células foram obtidas com um microscópio de fluorescência Zeiss Axioplan equipado com uma câmera CCD preto e branco (Chroma1600 DTA, Pisa, Itália). As retinas foram colocadas na platina do microscópio dentro de uma pequena câmara de observação contendo 4 ml de ACFS constantemente oxigenado e freqüentemente substituído, mantido em temperatura ambiente.

As retinas foram rapidamente rastreadas para células colinérgicas marcadas usando uma objetiva de imersão em água Olympus 40 × (NA 0,80), mantendo a luz de excitação em 10-20% de sua intensidade máxima. Duas imagens foram obtidas para cada célula, com foco na árvore dendrítica (exposição de 3 segundos) e, em seguida, no soma (exposição de 0,5 segundos). Após o tratamento, foram feitas imagens dos dendritos e soma das células previamente registradas. Pontos de referência dentro da câmara de observação foram registrados para identificar células específicas em observações subsequentes por meio de suas coordenadas. Para limitar a exposição à luz, as células tratadas e de controle só foram fotografadas antes e 30 minutos após o tratamento, a menos que especificado de outra forma. Em alguns experimentos, as células foram transfectadas com YFP e resultados semelhantes foram obtidos com dextranos (não mostrado).

A permeabilidade da membrana foi avaliada pela adição de iodeto de propídio (PI 1,5μM, por 1 minuto) ao ACSF. A exposição da fospatidilserina no folheto da membrana externa foi avaliada com Cy3-anexina V (3 μg / ml, por 20 minutos). As imagens foram adquiridas com a configuração do filtro FITC (488 nm) para Oregon-Green-488-dextran, com a configuração do filtro TRITC (568 nm) para PI, Cy-3-anexina V e Alexa-Fluo-568-dextran. Quinacrine (1 μM) foi incubado por 10-20 minutos em temperatura ambiente e fotografado usando um microscópio confocal Leica TCNS, mantendo o laser em potência mínima (5-10%). Uma vez que a quinacrina branqueia facilmente, um máximo de duas células foram escaneadas por retina, definindo a profundidade de varredura para cada célula sob o filtro TRITC (exibindo a marcação de dextrana), então escaneando com o filtro FITC (quinacrina) e, finalmente, com o filtro TRITC.

Aquisição e análise de dados

As matrizes de células colinérgicas foram amostradas usando um microscópio confocal Leica TCNS. Quatro amostras de 400 × 400 μm 2 de ambas as matrizes de células colinérgicas foram coletadas em cada retina de montagem inteira em meio à excentricidade ao longo de quatro eixos perpendiculares. A densidade das células colinérgicas não varia com a excentricidade nessas idades (Galli-Resta et al., 2002). O mesmo se provou verdadeiro em uma análise dedicada dos casos tratados (oito amostras por retina tomadas em duas excentricidades diferentes ao longo de quatro eixos perpendiculares, duas retinas por tratamento não mostradas). Como em cada caso a objetiva foi posicionada no meio do caminho entre a papila e a margem retiniana, sem exame prévio da distribuição das células, cada amostragem foi imparcial. Os campos amostrados e as imagens da retina foram examinados usando um analisador de imagens (Imaging Ontario, Canadá) para determinar a densidade celular, o posicionamento celular e a área retinal. As contagens de células e coordenadas foram obtidas alimentando cada campo de amostra para o sistema de imagens e usando um contador automático de células com base no limite de intensidade e critérios de exclusão de tamanho para eliminar o ruído. O número total de células foi estimado multiplicando a densidade celular média e a área retinal. Para investigar a morte entre os neurônios colinérgicos, os campos amostrados foram selecionados para fragmentos celulares que retêm imunorreatividade para ChAT. Detritos ChAT-positivos (ChAT +) dentro de 15 μm um do outro foram contados como uma única ocorrência. As células picnóticas no GCL foram contadas em quatro amostras (250 × 250 μm 2) por retina, após coloração com iodeto de propídio. Para amostrar células não colinérgicas na camada de células ganglionares (GCL), retinas de montagem inteira foram imunocoradas para ChAT (FITC: verde) e, em seguida, marcadas com PI (TRITC). Toda a espessura do GCL foi digitalizada com um microscópio confocal sob a configuração de filtro FITC + TRITC, tomando oito amostras (250 × 250 μm 2) por retina em duas excentricidades regularmente espaçadas ao longo de quatro eixos perpendiculares. Todas as células PI que não foram marcadas para ChAT foram então contadas usando Metamorph. Células horizontais (tau-imunorreativas), dopaminérgicas amacrinas [células da camada nuclear interna (INL) imunorreativas para tirosina hidroxilase (TH)] e células AII amácrinas (Desativado 1 imunorreativo) também foram contadas: células horizontais foram amostradas em quatro (400 × 400 μm 2) amostras. As células TH foram amostradas em oito amostras regularmente espaçadas (400 × 400 μm 2), limitadas à retina dorsotemporal, onde essas células são restritas no início da vida (Wu e Cepko, 1993). As células AII foram amostradas em quatro meio-excentricidade (250 × 250 μm 2) campos ao longo de quatro eixos perpendiculares.

Gráficos, histogramas de frequência e análises estatísticas foram feitos usando Origin 7.0 (Microcal). Programas personalizados foram usados ​​para calcular a autocorrelação, o perfil de recuperação de densidade (DRP) e a frequência de células mais próximas de 15μm de um de seus vizinhos. O DRP e o raio de exclusão (ER) são calculados como segue. Os círculos concêntricos são traçados a distâncias constantes (aqui 2,5 μm) um do outro na autocorrelação, e um histograma (DPR) é obtido da densidade das contagens de autocorrelação nos anéis delimitados por dois círculos consecutivos. Os valores de DRP são muito baixos perto do centro da autocorrelação (refletindo o orifício central), e então aumentam para uma densidade constante final nas caixas longe da origem. O ER é obtido como o raio do primeiro círculo (FC) onde o histograma atinge ou excede sua densidade final média menos uma correção que pesa as contagens de autocorrelação encontradas nos anulares contidos em FC. Essa correção é calculada como a densidade das contagens dentro do círculo FC dividida pelo valor médio do platô de DRP alcançado longe da origem e multiplicada pelo tamanho do compartimento do histograma (Rodieck, 1991). Para avaliar a frequência de pares de células com uma distância intercelular abaixo de 15 μm, os dados de retinas tratadas com apirase e ATP oxidado (oATP) foram agrupados. A frequência dos pares de células foi calculada como a porcentagem do número total de pares de células no campo. Em um campo com n células existem n * (n-1) / 2 pares de células.

Reagentes

Dextranos conjugados fluorescentes (10 kDa, conjugados com Alexa Fluo 488 ou 568 ou Oregon Green 488) e anticorpos secundários conjugados fluorescentes eram da Molecular Probes, Eugene, OR. Suramine era de Calbiochem. Os anticorpos para colina acetiltransferase (ChAT) e tirosina hidroxilase (TH) eram da Chemicon. O anticorpo monoclonal BrdU era da Roche. O P2X7policlonal foi descrito anteriormente (Ferrari et al., 1997), o policlonal A8 para a Ilhota 1/2 foi um gentil presente de T. Jessell, o anticorpo para Disabled 1 foi um gentil presente de B. Howell. Todos os outros produtos químicos eram da Sigma.


Endereço atual: Departamento de Patologia, Escola de Medicina da Universidade de Stanford, Stanford, CA, EUA

Afiliações

Departamento de Farmacologia e Biologia Química, Escola de Medicina da Emory University, Atlanta, GA, EUA

Riley E.Perszyk, Sharon A. Swanger, Chris Shelley, Alpa Khatri, Jing Zhang, Phuong Le, Hongjie Yuan e Stephen F. Traynelis

Virginia Tech Carilion Research Institute, Roanoke, VA, EUA

Departamento de Medicina Interna, Escola de Medicina Virginia Tech Carilion, Roanoke, VA, EUA

Departamento de Ciências Biomédicas e Patobiologia, Escola de Medicina Veterinária de Virginia-Maryland, Virginia Tech, Blacksburg, VA, EUA

Departamento de Biologia, University of the South, Sewanee, TN, EUA

Departamento de Química, Emory University, Atlanta, GA, EUA

Gabriela Fernandez-Cuervo, Matthew P. Epplin, Ethel Garnier-Amblard, Pavan Kumar Reddy Gangireddy, David S. Menaldino, Dennis C. Liotta e Lanny S. Liebeskind

Departamento de Fisiologia, Emory University, Atlanta, GA, EUA

Departamento de Biologia Celular, Emory University, Atlanta, GA, EUA

Pernille Bülow e Gary J. Bassell

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Contribuições

Os autores contribuíram da seguinte forma: conceituação (SFT, REP e SAS) curadoria de dados e análise formal (REP, SAS, CS, AK, GF-C., HY e SFT) aquisição de financiamento (SAS, SFT, HY, DCL e GJB) investigação (REP, SAS, CS, AK, JZ, PL, EG-A., GF-C., MPE, DSM e PB) desenvolvimento ou desenho de metodologia (REP, SAS, SFT, EG-A., GF -C., MPE, GJB, DSM, DCL e LSL) administração de projetos (REP, SFT e SAS) fornecimento de reagentes, materiais e ferramentas de análise (PKRG, EG-A., GF-C., PB, GJB, MPE, Supervisão (SFT, LSL, DCL e GJB) dos softwares DSM, DCL e LSL (REP e SFT) verificação (REP, SAS, CS, AK, GF-C., MPE e DSM) e visualização e escrita (todos os autores).

Autor correspondente


Métodos

Materiais

O meio de cultura incluindo DMEM e soro fetal bovino foram adquiridos da Gibco Life Technology Invitrogen (Grand Island, NY, EUA). Oligo-fectamina, MEMI, fluo-4 AM, isoftalato de benzofurano de ligação de sódio (SBFI) AM, grânulo de agarose G, anticorpo TFR, anticorpo β-actina, anticorpo GFAP, anticorpo DMT1 e cadeias duplex DMT1 siRNA eram da Thermo Fisher Scientific ( Waltham, MA EUA) cadeias duplex de siRNA de TFR, NCX1-3, Cav-3 e Dab2, anticorpo NCX2, anticorpo Na + / K + -ATPase alfa1 / 2 e os anticorpos secundários foram adquiridos na Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA , EUA). O anticorpo NCX1, o anticorpo NCX3 e apo-transferrina de camundongo nativo (apo-TF, isto é, sem ferro) eram da Abcam (Cambridge, MA, EUA). Soro de burro, xestospongin C (Xe-C), nifedipina, sulfato ferroso heptahidratado (FeSO4), a sulforodamina 101 (SR101) e o citrato de amônio férrico foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Ryanodine e KB-R7943 foram adquiridos na Calbiochem (La Jolla, CA, EUA). A coloração do anticorpo secundário com Cy-2/3 anti-rato de burro ou anti-coelho era da Jackson Immuno-Research (West Grove, PA, EUA). O anticorpo primário da histona H3 foi adquirido na EarthOx (Millbrae, CA, EUA).

Animais

Os camundongos C57BL / 6, FVB / N-Tg (GFAP-eGFP) 14Mes / J e B6.Cg-Tg (Thy1-YFP) camundongos transgênicos HJrs / J foram todos adquiridos no Laboratório Jackson (Bar Harbor, ME, EUA) . Os animais foram criados em condições de alojamento padrão (ciclo claro / escuro de 22 ± 1 ° C de 12/12 h), com água e comida disponíveis. AD Libitum. Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Guia do Instituto Nacional de Saúde dos EUA para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Publicação NIH nº 8023) e sua revisão de 1978, e todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Institucional de Animais da China Medical University, No. [2019] 059.

Cultura primária de astrócitos

Astrócitos foram cultivados a partir de camundongos recém-nascidos 71,72. Em suma, os hemisférios cerebrais foram isolados, dissociados e filtrados. Astrócitos isolados foram cultivados em Meio Essencial Mínimo de Dulbecco (DMEM) com glicose 7,5 mM suplementado com soro fetal bovino a 10%. Os astrócitos foram incubados a 37 ° C em uma atmosfera umidificada de CO2/ ar (5: 95%). As culturas são altamente enriquecidas em astrócitos, a pureza é & gt95% conforme avaliado pela coloração GFAP 73.

Tratamento de ferro

Para a preparação da solução de Fe 3+ -TF, citrato de amônio férrico e apo-TF de camundongo foram incubados a uma proporção de 2: 1 em meio de cultura sem soro por 1 h a 37 ° C 74,75. A mesma concentração de apo-TF no mesmo volume de meio de cultura, mas sem Fe 3+, foi utilizada para os tratamentos controle. Para a solução Fe 2+, FeSO4 foi recentemente dissociado em meio de cultura sem soro a 37 ° C e usado imediatamente, o mesmo volume de meio de cultura sem soro foi usado como controle para o grupo Fe 2+.

RNA interferente

Os astrócitos cultivados foram incubados em DMEM sem soro por 12 horas antes da transfecção 73,76,77. Uma solução de transfecção contendo 2 μl de oligo-fectamina (Promega, Madison, WI, EUA), 40 μl de MEMI e 2,5 μl de siRNA (DMT1, TFR, NCX1-3, Cav-3 ou Dab2) foi adicionado ao meio de cultura em cada bem por 8 h. Nas culturas de controle negativo para siRNA, foi adicionada solução de transfecção sem siRNA. Depois disso, DMEM com três vezes de soro foi adicionado às culturas. Estas cadeias duplex de siRNA foram adquiridas de Santa Cruz Biotechnology (CA, EUA).

Preparação de caveolae de membrana

A homogeneização celular e a preparação de caveolae a partir de astrócitos foi feita 78,79. Em resumo, os astrócitos cultivados em primários foram coletados e homogeneizados em SET (0,315 M de sacarose, 20 mM de Tris-HCl e 1 mM de EDTA, pH 7,4) e centrifugados por 1 h a 1.000 × g. Os peletes foram re-solubilizados em SET e colocados em Percoll (30% em SET) seguido de centrifugação a 1.000 × g. Os peletes foram re-homogeneizados e re-estratificados em três soluções de gradiente de densidade de sacarose (80%, 30% e 5%) com ultra-centrifugação a 175.000 × g. Finalmente, os caveolae purificados foram coletados e ressuspensos em SET.

Co-imunoprecipitação

Usamos tecnologias de co-imunoprecipitação e Western blotting subsequente para verificar o nível de conjunção entre NCXs e DMT1 76. Após homogeneização, o teor de proteína foi determinado pelo método de Bradford 80 usando albumina de soro bovino como padrão. Para imunoprecipitação de NCX1-3, lisados ​​de células inteiras (500 μg) foram incubados com 20 μg de anticorpo anti-NCX1, anti-NCX2 ou anti-NCX3 durante a noite a 4 ° C. Em seguida, 200 μl de pasta de grânulos de agarose-G de proteína lavada foram adicionados e a mistura foi incubada por mais 2 horas a 4 ° C. As contas de agarose foram lavadas três vezes com solução tampão de fosfato fria (PBS) e coletadas por centrifugação pulsada (5 s em uma microcentrífuga a 14.000 × g), o sobrenadante foi drenado e as contas foram fervidas por 5 min. Em seguida, o sobrenadante foi coletado por centrifugação pulsada e todos os imunoprecipitados foram submetidos a eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio (SDS) -poliacrilamida (PAGE) a 10%.

Extração de citoplasma e proteína do núcleo

A fração subcelular foi analisada usando o Kit de extração de proteína (P0028, Beyotime, Shanghai, China) 81, de acordo com o protocolo do fabricante. Para outros ensaios de western blotting, as extrações de proteínas citoplasmáticas e nucleicas foram mantidas abaixo de -20 ° C.

Western blotting

Para quantificar as expressões de DMT1, TFR, NCX1-3, Cav-3 ou Dab2, as amostras contendo 100 μg de proteína foram adicionadas aos géis de placa. Após a transferência para membranas de PVDF, as amostras foram bloqueadas por leite em pó desnatado a 10% por 1 h, e as membranas foram incubadas durante a noite com os anticorpos primários, específicos para DMT1 em uma diluição de 1: 300, TFR em uma diluição de 1: 200, NCX1 a uma diluição de 1: 100, NCX2 a uma diluição de 1: 200, NCX3 a uma diluição de 1: 150, Cav-3 a uma diluição de 1: 200, Dab2 a uma diluição de 1: 100, Histona H3 a uma diluição de 1: 500 ou β -actina em uma diluição de 1: 1000. Após a lavagem, a ligação específica foi detectada por anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano. As imagens foram analisadas com um Sistema de Análise de Imagens em Gel de Eletroforese (MF-ChemiBIS 3.2, DNR Bio-Imaging Systems, Israel). A densidade de banda foi medida com o software Window AlphaEase TM FC de 32 bits 72,82.

Monitoramento de [Ca 2+]eu

Para [Ca 2+]eu monitoramento e imagem em astrócitos cultivados 83,84, após o pré-tratamento com ou sem inibidores ou cadeias duplex de siRNA, os astrócitos cultivados principalmente foram carregados com 5 μM de fluo-4-AM, (Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA)) , por 30 min. Os sinais de Fluo-4 foram visualizados por microscopia fluorescente (Olympus IX71, Japão). As leituras de todas as células positivas para fluo-4 em um campo de visão medido em cada cultura foram incluídas nas estatísticas, a intensidade de fluorescência do fluo-4 foi normalizada para a intensidade da linha de base antes da estimulação. As medições foram repetidas em 10 culturas diferentes. Astrócitos cultivados também foram corados com marcador específico sulforhodamina 101 (SR101) na diluição de 1: 2000.

Imagem de Ca 2+ in vivo com dois fótons

Camundongos transgênicos FVB / N-Tg adultos (GFAP-eGFP) 14Mes / J (10-12 semanas de idade) foram anestesiados com cetamina (80 mg / kg, i.p.) e xilazina (10 mg / kg, i.p.). A temperatura corporal foi monitorada usando uma sonda retal, e os camundongos foram mantidos a 37 ° C por uma manta de aquecimento. Uma placa de metal customizada foi colada ao crânio com cimento acrílico dentário e uma janela craniana foi preparada sobre o hemisfério direito a 2,5 mm lateral e 2 mm posterior ao bregma. As células corticais somato-sensoriais foram carregadas com o indicador de Ca 2+ Rhod-2 AM (50 μM, 1 h). A janela transcraniana foi superfundida com LCR artificial. Depois que um registro de linha de base estável foi obtido, Fe 2+ (100 μM) ou Fe 3+ -TF (100 μM) foi adicionado por 1 min. Os filtros passa-banda (Chroma) foram de 540 nm / 40 nm para eGFP e 850 nm / 70 nm para sinais de rod-2. Imagens de lapso de tempo de sinalização astrocítica de Ca 2+ foram gravadas a cada 5 s usando FluoView com uma configuração customizada de varredura a laser de dois fótons (Nikon AR1, Japão) 84,85.

Medições intracelulares de Na +

Para monitorar Na + ionizado intracelular ([Na +]eu) em astrócitos cultivados, astrócitos cultivados primários foram carregados com 10 μM de indicador sensível a Na + SBFI-AM por 30 min em meio sem soro, com subsequente 1 h de washout. SBFI foi alternadamente excitado em 340 nm e 380 nm, e a emissão foi monitorada em 500 nm. Os sinais SBFI foram medidos por microscopia fluorescente (Olympus IX71, Japão) e expressos como uma razão (R ​​= F340/ F380) 52 .

Imunofluorescência

O tecido cerebral foi fixado por imersão em paraformaldeído a 4% e cortado em fatias de 100 μm 72,82. As células cultivadas foram fixadas com metanol 100% a -20 ° C. Fatias de cérebro ou células foram permeabilizadas por incubação por 1 h com soro de burro. Anticorpos primários contra DMT1 ou TFR foram usados ​​na diluição de 1: 100, contra proteína glial fibrilar ácida (GFAP) foi usada na diluição de 1: 200. E os núcleos foram corados com marcador 4 ', 6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI) na diluição de 1: 1000. Os anticorpos primários foram incubados durante a noite a 4 ° C e, em seguida, anticorpo secundário conjugado de burro anti-camundongo ou anti-coelho Cy-2/3 por 2 h em temperatura ambiente. As imagens foram capturadas usando um microscópio de varredura confocal (DMi8, Leica, Wetzlar, Germany).

Ensaios ELISA

Os astrócitos foram incubados a 37 ° C em um meio de cultura livre de soro fresco após o tratamento com Fe 2+ / Fe 3+ ou inibidores, os astrócitos foram coletados e centrifugados a 10.000 × g por 10 min para remover células flutuantes e / ou detritos celulares a 4 ° C. Para testar a atividade de NKA, um kit ELISA comercial (abx255202 Abbexa, Cambridge, UK) foi usado e operado como os protocolos, a sensibilidade é de 0,19 ng / mL, a densidade óptica (DO) foi medida a 450 nm e o valor de DO foi normalizado pelo grupo de controle. Para testar o InsP3 concentração 86, o sobrenadante foi coletado e a concentração de InsP3 testado usando um kit ELISA comercial (E-EL-0059c Elabscience Biotechnology, Wuhan, China).

Classificação de células neurais por meio de classificador de células ativadas por fluorescência (FACS) e PCR quantitativo (qPCR)

Para medir o mRNA para TFR e DMT1, astrócitos que expressam o marcador fluorescente GFP (camundongos GFAP-GFP) e neurônios que expressam o marcador fluorescente YFP (camundongos Thy1-YFP) foram usados, também extraímos os tecidos dos hemisférios cerebrais de camundongos do tipo selvagem. As células de camundongos transgênicos foram utilizadas para classificação específica de astrócitos ou neurônios com FACS 85,87. O RNA das células selecionadas e do tecido cerebral foi extraído por Trizol. O RNA total foi transcrito reversamente e a amplificação por PCR foi realizada em um termociclador Robo-cycler 81,84. A quantidade relativa de transcritos foi avaliada usando diluições em série de cinco vezes do produto RT (200 ng). A quantidade de RNA foi normalizada para gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) e os valores são expressos como a razão TFR / GAPDH ou DMT1 / GAPDH.

Estatística e reprodutibilidade

Para a análise estatística, usamos a análise de variância unilateral (ANOVA) seguida por um teste de comparação múltipla post hoc de Tukey ou Dunnett para replicações desiguais usando o software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) e o software SPSS 24 ( International Business Machines Corp., NY, EUA). ANOVA unilateral para comparações incluindo mais de dois grupos teste t bicaudal não pareado para comparações de dois grupos. Todos os dados estatísticos no texto são apresentados como a média ± DP, o valor de significância foi estabelecido em p & lt 0,05.

Resumo do relatório

Mais informações sobre o desenho da pesquisa estão disponíveis no Nature Research Reporting Summary vinculado a este artigo.


Resultados

Os pontos CLN-5 são aumentados perto da superfície da microvasculatura cerebral em cérebros com DA

Uma vez que EVs CLN-5-positivos liberados por células endoteliais microvasculares cerebrais foram sugeridos como um mecanismo para a migração transendotelial de leucócitos durante a neuroinflamação (Paul et al., 2016), avaliamos a presença dessas estruturas CLN-5 + perto da microvasculatura no CNT , Cérebros humanos SAD e FAD. A coloração revelou um aumento significativo em CLN-5 microvascular em tecidos SAD e FAD em comparação com tecidos CNT (Figuras 1A, B e Figura Suplementar S1). Curiosamente, um abundante padrão de coloração microvascular pontilhada (pontas de setas pretas e inserções) foi observado no SAD e no FAD, enquanto as amostras de CNT mostraram uma reatividade CLN-5 sutil. Para caracterizar esse padrão, rotulamos a lâmina basal microvascular (UEA I +) e realizamos análise de imagem confocal restrita a essas estruturas. Apesar de um perfil de marcação CLN-5 amplo e difuso ao longo do tecido, observamos sinais fluorescentes particularmente intensos de manchas CLN-5 + dentro e ao redor dos microvasos em ambos os tecidos CNT e AD (Figuras 1C, C & # x2019). A análise de imagem revelou um aumento de dez vezes no número desses pontos CLN-5 + em amostras SAD em comparação com as amostras de CNT e cerca de um aumento de quatro vezes em comparação com as amostras de FAD (Figura 1D), enquanto o FAD não foi significativamente diferente do CNT.

Para avaliar se esses pontos CLN-5 + eram morfologicamente diferentes entre os grupos experimentais, comparamos seus volumes médios. No entanto, verificou-se que o volume médio dos pontos CLN-5 + nas três condições foi semelhante e variou de & # x223C0,017 a 0,022 & # x03BCm 3 (Figura 1E). Por último, uma vez que observamos pontos CLN-5 luminalmente (pontas de seta preenchidas em vermelho, Figuras 1C, C & # x2019), abluminalmente (pontas de seta preenchidas em branco) e em diferentes distâncias das superfícies dos microvasos (pontas de seta vazias), determinamos a porcentagem do total Pontos CLN-5 + presentes dentro da microvasculatura e a distribuição percentual dessas partículas através de uma faixa arbitrária de 5 & # x03BCm da superfície do microvaso abluminal (Figura 1F). Reconstruções 3D representativas dos microvasos e os pontos são mostrados na Figura 1G. Em ambos os tecidos CNT e AD, a maioria dos pontos CLN-5 + totais presentes perto dos microvasos correspondem a partículas luminais (& # x003E62% Figura 1F, painel esquerdo). Além disso, SAD mostrou 28% mais manchas CLN-5 + luminais do que CNT e 15% mais do que FAD. Em relação à distribuição abluminal de manchas CLN-5 +, o tecido SAD exibiu uma maior porcentagem de partículas apostadas diretamente na superfície do vaso (partículas presentes entre 0 a 1 & # x03BCm da superfície do vaso) em comparação com o tecido CNT (& # x003E99% em SAD vs. & # x223C86% em CNT) (Figura 1F, painel direito) o tecido SAD também continha uma distribuição ligeiramente mais ampla de manchas CLN-5 + ao longo de toda a distância avaliada. Embora a distribuição de manchas CLN-5 + em FAD seja semelhante à de SAD (& # x003E94% partículas próximas à superfície), a diferença em comparação com o grupo CNT não foi estatisticamente significativa. Juntos, nossos resultados mostraram que os pontos CLN-5 + estão associados à microvasculatura do cérebro e estão aumentados no TAS.

EVs são aumentados em pacientes com DA

Com base na descoberta de que os pontos CLN-5 + estavam aumentados na microvasculatura do cérebro com DA, isolamos EVs sistêmicos e descobrimos que CLN-5 e Flotilina-1 faziam parte da composição molecular desses EVs (Figura Suplementar S2A). Em seguida, para caracterizar EVs sistêmicos, comparamos a distribuição de tamanho e a concentração de EVs de CNT-, SAD- e FAD. Os histogramas NTA individuais são mostrados na Figura Suplementar S2B. Detectamos partículas com tamanhos de 50 a 700 nm, que correspondem aos tamanhos dos exossomos e MVs. Nenhuma diferença na concentração foi encontrada entre as amostras (Figura Suplementar S2C).Encontramos um aumento significativo no tamanho médio de SAD- (média = 173,4 nm) e FAD-EVs (média = 178,3 nm) em comparação com CNT-EVs (média = 143,8) (Figura 2A). D10 mostra o limite inferior de 10% das partículas medidas, D50 mostra metade das partículas medidas (50%) e D90 mostra o limite superior de 90% das partículas medidas. Não foi observada diferença em D10 e D50 entre as amostras (Figuras 2B, C). Em contraste, encontramos um aumento significativo no D90 no SAD- e FAD-EVs em comparação com os CNT-EVs (Figura 2D).

Figura 2. A concentração e o número de EVs estão aumentados no plasma de pacientes com DA. (UMA) Tamanho médio de EVs medido por NTA de pacientes CNT (preto), SAD (laranja) e FAD (vermelho). (B) D10, (C) D50, e (D) Parâmetros D90 obtidos por NTA. (E) Gráfico de contorno representativo de uma população EV de amostra de controle e grânulos de referência de tamanhos diferentes. (F) Concentração de EVs / mL medida por citometria de fluxo em toda a região e (G) nos diferentes intervalos de tamanho: MVs, 0,1 & # x20131 corpos apoptóticos, 1 & # x20136. Para (A & # x2013D), os dados representativos da CNT, n = 6 SAD, n = 5 FAD, n = 6. Para painéis (E & # x2013G), dados representativos da CNT, n = 6 SAD, n = 6 FAD, n = 6. Os dados são representados graficamente como médias e SEM. ANOVA unilateral, teste de comparação múltipla de Tukey e # x2019s. & # x002A indica p & # x003C 0,05 & # x002A & # x002A & # x002A indica p & # x003C 0,001.

Usando a citometria de fluxo, detectamos partículas com tamanho variando de 100 a 6.000 nm, que correspondiam aos tamanhos de MVs e corpos apoptóticos (ABs) (Figura 2E). Encontramos um aumento significativo na concentração de SAD- e FAD-EVs em comparação com CNT-EVs (Figura 2F). Além disso, usamos esferas de referência de tamanho para elucidar em qual intervalo de tamanho os EVs diferem. Os intervalos de tamanho foram: 0,1 & # x20131, 1 & # x20133 e 3 & # x20136 & # x03BCm. Encontramos um aumento significativo na concentração de EV apenas na região de 0,1 & # x20131 & # x03BCm, que corresponde a MVs (Figura 2G). Encontramos uma concentração mais baixa de MVs e ABs no LCR em comparação com o plasma (Figura Suplementar S2F), mas não encontramos uma diferença em CSF-EVs entre os diferentes grupos (Figura Suplementar S2G). Esses resultados sugerem que os EVs sistêmicos estão aumentados na DA.

Fenótipo diferencial de EVs sistêmicos em FAD e SAD

Para determinar o fenótipo de EVs sistêmicos, analisamos marcadores de células do sangue e do cérebro, mitocôndrias e exposição de PS usando citometria de fluxo (estratégia de passagem de acordo com aquela mostrada na Figura Suplementar S3). Como uma representação visual da porcentagem de eventos positivos e MFI, dois mapas de calor são mostrados com seis amostras por grupo (Figuras 3A, D). Apenas SAD mostrou um aumento da porcentagem de EVs positivos para marcadores de leucócitos (CD45 +), endoteliais (CD105 +) e eritrócitos (CD234a) (Figuras 3A, B) este aumento também foi visto no MFI para marcadores de leucócitos e eritrócitos e para mitocôndrias (DIOC6) em SAD-EVs em comparação com CNT-EVs (Figuras 3D, E). Curiosamente, apenas FAD teve uma porcentagem aumentada de EVs e MFI positivos para um marcador de plaquetas (CD41a +) (Figuras 3A, B, D, E). Além disso, SAD-EVs exibiram aumento de MFI para marcadores endoteliais e eritrocitários (Figuras 3D, E) e tiveram EVs que foram duplamente positivos para leucócitos e marcadores endoteliais (CD45 + / CD105 +) em comparação com FAD-EVs (Figura 3C). Além disso, AD-EVs exibiram uma tendência de ter um aumento da porcentagem de EVs positivos para mitocôndrias, astrócitos (AQ4) e marcadores semelhantes a neurônios (CD90) em comparação com EVs de controle. Esses resultados sugerem que SAD-EVs têm um fenótipo de leucócito endotelial e que FAD-EVs têm um fenótipo de plaquetas.

Figura 3. Fenótipo diferencial de SAD- e FAD-EVs. (UMA) Mapa de calor das porcentagens de EVs positivos para marcadores celulares (CD41, plaquetas CD45, leucócitos CD105, endotélio CD235a, eritrócitos AQ4, astrócitos CD90, anexina semelhante a neuronal, fosfatidilserina e DIOC6, mitocôndria) de cada amostra de CNT, FAD e SAD. (B) Comparação das porcentagens de EVs positivos para marcadores de células nos dados agrupados no painel (UMA). (C) Porcentagens de EVs duplo-positivos para marcadores (CD45, leucócito CD105, endotélio) em CNT, FAD e SAD. (D) Mapa de calor da MFI normalizada de marcadores de células (para média de dados de indivíduos CNT). (E) Comparação do MFI normalizado de marcadores de células para os dados agrupados no painel (C). Dados representativos da CNT, n = 6 SAD, n = 6 FAD, n = 6. Os dados são representados graficamente como médias e SEM. ANOVA unilateral, teste de comparação múltipla de Tukey e # x2019s. & # x002A indica p & # x003C 0,05 & # x002A & # x002A indica p & # x003C 0,01 & # x002A & # x002A & # x002A indica p & # x003C 0,001.

Quantidades diferenciais de composição de proteínas em SAD- e FAD-EVs

Para determinar a composição proteica dos EVs, usamos uma abordagem sem rótulo LC-MS e analisamos amostras de pacientes com CNT, FAD e SAD. Ao todo, foram identificadas 130 proteínas (FDR 0,1%, Tabela Suplementar S1) com uma abundância diferencial para cada amostra. O mapa de calor do perfil de proteína das 130 proteínas é mostrado (Figura 4A), onde cada cor representa o log2 (razão) da abundância média em diferentes amostras normalizadas para a média de CNT-EV. O agrupamento hierárquico foi gerado usando um algoritmo de união de vizinhos com uma medida de similaridade de distância euclidiana do log2 das proporções de proteína de cada amostra (para um grupo) ou de cada grupo (para vários grupos). A análise PLS-DA indicou um perfil de proteína para todos os grupos experimentais, que foram distinguidos por três fatores (Figura 4B e Tabela Suplementar S2). As proteínas SORD, SAA4, LBP, SERPINF1, PLPT, APOE, APOA2, IGKV1D-33 e IGKV1-33, C8A foram usadas para distinguir os grupos. Além disso, a análise PLS-DA indicou que o grupo controle estava localizado em um plano espacial diferencial do que os grupos FAD (Figura 4C) e SAD (Figura 4D). As proteínas das cadeias gama, alfa e beta do fibrinogênio (FGG, FGA, FGB), complemento C6, peroxirredoxina 2 (PRDX2), proteína de ligação da fosfatidiletanolamina 1 (PEBP1), carboxipeptidase N subunidade 2 (CPN2), fator derivado do epitélio pigmentar (SERPINF1 ), proteína de ligação de ácido graxo 1 (FABP1) e inibidor de serina protease 10 (SERPINA 10) foram usados ​​para distinguir o grupo SAD do grupo CNT (Figura 4C). Complemento C2 e C8A, SORD, PLPT, imunoglobulinas (IGKV1D-33, IGKV1-33, IGVH3-7 e IGVK1-8), LBP e APOA2 foram usados ​​para distinguir o grupo FAD do grupo CNT (Figura 4D). Além disso, a análise PLS-DA indicou que o FAD estava localizado em um plano espacial diferente do SAD (Figura 4D). Inibidor de inter-alfa-tripsina de cadeia pesada H3 (ITIH3), alfa-2-HS-glicoproteína (AHSG), trombospondina-1 (THBS1) PEBP1, proteína de matriz extracelular semelhante a fibulina contendo EGF (EFEMP1), imunoglobulina lambda como polipeptídeo 5 (IGLL5), plasmina (PLG), inibidor da protease C1 plasmática (SERPING1) e imunoglobulinas (IGKV1-17 IGLV1-51) também podem ser usados ​​para discriminar entre esses grupos (Figura 4E).

Figura 4. Composições de proteínas de SAD- e FAD-EVs. (UMA) Mapa de calor das alterações de dobra de proteína para cada amostra em comparação com a média de CNT-EVs. Ao todo, 130 proteínas foram consideradas usando uma alteração de 1,2 vezes e um FDR & # x2264 1%. (B) Análises multivariadas de CNT-, SAD- e FAD-EVs. PLS-DA foi usado para discriminar entre a abundância de proteína em CNT em comparação com SAD (C), CNT em comparação com FAD (D), e SAD em comparação com FAD (E). Para painéis (A & # x2013E), dados representativos da CNT, n = 5 SAD, n = 5 FAD, n = 5.

Usando bioinformática DAVID para termos GO funcionais, observamos proteínas de: & # x201CExtracelular Exosome, & # x201D & # x201CExtracellular Region, & # x201D & # x201CExtracellular Space, & # x201D & # x201CBloodisCroctor & # x201 Micropartícula Mediated-x201 , & # x201D & # x201CCativação do complemento, & # x201D e & # x201CAntigen Binding & # x201D (Figura 5A). Usando o PANTHER GO-Slim, os seguintes termos de função molecular do GO foram incluídos na análise: & # x201CBinding, & # x201D & # x201CCatividade catalítica, & # x201D e & # x201C Regulador da função molecular & # x201D foram as principais funções associadas às proteínas detectadas em EVs (Figura 5B). Além disso, os termos da classe de proteína GO, como & # x201CEnzyme modulator, & # x201D & # x201CDefense / Immunity Protein, & # x201D e & # x201CHydrolase, & # x201D e os termos da via GO & # x201CBlood Coagulation, & # x201Dlasogen & # x201 Activity Pathway, & # x201D e & # x201CInflammation Mediated by Chemokine and Cytokine Signaling Pathway & # x201D foram os principais componentes associados às proteínas detectadas em EVs (Figuras 5C, D).

Figura 5. Vias envolvidas na composição da proteína EV e abundância da composição diferencial da proteína em SAD- e FAD-EVs. (UMA) Anotação funcional baseada em DAVID, (B) Função Molecular, (C) Classe de proteína e (D) Via de sinalização baseada na anotação PANTHER GO-Slim de 130 proteínas analisadas em EVs. Gráfico de vulcão mostrando as proteínas que são reguladas positivamente ou reguladas negativamente em (E) SAD-EVs em comparação com CNT-EVs, (F) em FAD-EVs em comparação com CNT-EVs (G) e em SAD-EVs em comparação com FAD-EVs. Os nomes são mostrados para proteínas com uma alteração log2 vezes superior a 1. Para painéis (A & # x2013E), dados representativos da CNT, n = 5 SAD, n = 5 FAD, n = 5.

Os gráficos de vulcão mostram as proteínas expressas diferencialmente nas diferentes amostras. As proteínas são mostradas como uma alteração log2 vezes superior a 1 e com uma significância de p & # x003C 0,05 (Figuras 5E & # x2013G e Tabela Suplementar S2). SORD e PLTP (proteína de transferência de fosfolipídios) diminuíram em FAD em comparação com CNT. O complemento C6 diminuiu em SAD em comparação com CNT e SERPINF1, THBS1, AHSG e imunoglobulinas diminuíram em SAD em comparação com FAD. As imunoglobulinas foram aumentadas no FAD em comparação com CNT PEBP1 e complemento Fator D (CFD) foram aumentados em SAD em comparação com CNT e proteína de ligação de IgGFc (FGCBP), ITH3 e EFEMP1 foram aumentados em SAD em comparação com FAD. Juntos, nossos resultados sugerem uma composição proteica diferencial de EVs de SAD e FAD, que pode estar relacionada à cascata de coagulação, inflamação e metabolismo de lipídio-carboidrato.

AD-EVs cruzam as células da microvasculatura humana e induzem a ruptura endotelial e a hiper-reatividade dos astrócitos

Para avaliar se os EVs sistêmicos cruzam a microvasculatura e interagem com as células do parênquima cerebral, realizamos um ensaio de transcitose usando células humanas da microvasculatura hCMEC / D3. Mais de 70% dos CNT-, SAD- e FAD-EVs cruzam a microvasculatura (Figura 6A). Depois, monoculturas e co-culturas de células NVU foram tratadas com EVs. Embora a porcentagem de citotoxicidade induzida tenha sido semelhante entre SAD-EVs e FAD-EVs em monoculturas, apenas SAD-EVs induziram um aumento significativo na citotoxicidade de astrócitos e endotelial

Figura 6. AD-EVs cruzam a BBB e induzem disfunção endotelial e hiperatividade de astrócitos. (UMA) Porcentagem de transcitose de CNT-, SAD- e FAD-EVs por meio de células da microvasculatura do cérebro humano hCMEC / D3. (B) A citotoxicidade em monoculturas neuronais, astrocíticas e endoteliais, e (C) a citotoxicidade em coculturas endoteliais de astrócitos expressa como a porcentagem de LDH liberada das células 24 h após o tratamento com CNT-, SAD-, FAD-EVs. (D) Caracterização morfológica dos astrócitos: F-actina é mostrada em vermelho, o citoesqueleto GFAP é mostrado em verde e os núcleos são mostrados em azul. Ampliação 20 e # x00D7, barra de escala 100 e # x03BCm. Endotélio: a F-actina é mostrada em vermelho, a catenina p120 é mostrada em verde e os núcleos são mostrados em azul. Ampliação 20 e # x00D7, barra de escala 100 e # x03BCm. Mudança de dobra de GFAP (E) e catenina p120 (F) intensidade (MFI) em astrócitos e endotélio tratados com CNT-, SAD-, FAD-EVs, respectivamente. Mudança de dobra do tamanho da lacuna (G) e a porcentagem da área da lacuna (H) do endotélio tratado com CNT-, SAD-, FAD-EVs. Para painel (UMA), dados representativos da CNT, n = 3 SAD, n = 3 FAD, n = 3. Para painéis (B & # x2013H), dados representativos da CNT, n = 5 SAD, n = 5 FAD, n = 5. Os dados são representados graficamente como médias e SEM. ANOVA unilateral, teste de comparação múltipla de Tukey e # x2019s. & # x002A indica p & # x003C 0,05 & # x002A & # x002A indica p & # x003C 0,01 & # x002A & # x002A & # x002A indica p & # x003C 0,001.

(Figura 6B). Além disso, na cocultura endotélio-astrócito, apenas SAD-EVs causaram um aumento na citotoxicidade (Figura 6C).

Para avaliar o efeito celular induzido por EVs em coculturas, analisamos marcadores específicos de astrócitos e endoteliais (Figura 6D). Apesar de que ambos SAD- e FAD-EVs aumentaram o MFI da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) em astrócitos e a área de lacuna entre as células endoteliais (Figura 6E), apenas SAD-EVs diminuíram o MFI da proteína de junção aderente p120 catenina ( Figura 6F) e aumentou o tamanho das lacunas dentro do endotélio (Figuras 6G, H). Esses resultados mostram que ambos os tipos de AD-EVs cruzam a BBB e induzem a ruptura endotelial e hiper-reatividade dos astrócitos, enquanto esses efeitos são potencializados por SAD-EVs.

AD-EVs aumentam a neurotoxicidade e induzem a desregulação do cálcio em organoides do cérebro humano

Uma vez que AD-EVs induziu ativação e interrupção astrócito-endotelial, testamos o efeito dos EVs sistêmicos nos componentes neurogliais. Monoculturas e coculturas neuronais e astrocíticas foram tratadas com SAD- e FAD-EVs. Ambos os tipos de AD-EVs induziram citotoxicidade neuronal em monoculturas, no entanto, apenas SAD-EVs causaram aumento da liberação de LDH em coculturas neuronais astrocíticas (Figuras 6B, 7A). Esses efeitos foram relacionados à hiperatividade astrocítica, conforme mostrado por um aumento em GFAP, e área de ramos neuronais diminuída, conforme mostrado por uma diminuição na área de F-actina (Figuras 7B e # x2013D).

Figura 7. AD-EVs induzem neurotoxicidade, hiper-reatividade de astrócitos e desregulação de cálcio. (UMA) A citotoxicidade das coculturas de astrócitos-neurônios é expressa como a porcentagem de LDH liberada das células 24 h após o tratamento com CNT-, SAD-, FAD-EV. (B, C) Os dados de alteração de dobra foram calculados dividindo os valores pelo valor obtido a partir de células sem tratamento EV. (B) Mudança de dobramento da intensidade de GFAP (MFI) de astrócitos tratados com CNT-, SAD-, FAD-EVs. (C) Variação dobrada das porcentagens de F-actina por campo de neurônios tratados com CNT-, SAD-, FAD-EVs. (D) A caracterização morfológica mostra o seguinte: Astrócitos: F-actina é mostrada em vermelho, o citoesqueleto GFAP é mostrado em verde e os núcleos são mostrados em azul. Ampliação 20 e # x00D7, barra de escala 100 e # x03BCm. Neurônios: a F-actina é mostrada em vermelho e os núcleos foram corados com Hoechst (azul). Ampliação 20 e # x00D7, barra de escala 100 e # x03BCm. (E) A citotoxicidade dos organóides humanos é expressa como a porcentagem de LDH liberada das células 48 h após o tratamento com CNT-, SAD-, FAD-EV. (F) Organóides corticais humanos tratados com CNT-, SAD-, FAD-EVs por 48 h foram incubados com Fluo4 (cálcio citoplasmático) e foram fotografados a cada 20 s por um total de 30 min (15 min para medir a atividade de linha de base e 15 min após a adição de 200 & # x03BCM glutamato). O & # x0394F/Fo A razão de fluorescência foi quantificada em cinco campos. Para painel (A & # x2013F), dados representativos da CNT, n = 5 SAD, n = 5 FAD, n = 5. No painel (E), dados representativos da CNT, n = 6 SAD, n = 5 FAD, n = 6. No painel (F), os dados representam um pool de EVs da CNT, n = 3 SAD, n = 3 FAD, n = 3. Os dados são representados graficamente como médias e SEM. ANOVA unilateral, teste de comparação múltipla de Tukey e # x2019s. & # x002A indica p & # x003C 0,05 & # x002A & # x002A indica p & # x003C 0,01.

Para entender melhor a implicação de EVs sistêmicos em um modelo de cultura 3D, tratamos organóides do cérebro cortical humano com 90 dias de idade. Curiosamente, ambos SAD- e FAD-EVs causaram citotoxicidade aumentada (Figura 7E). Além disso, como um experimento funcional, medimos a regulação do cálcio (& # x0394F/F0) após estimulação com EVs. Registramos o sinal de cálcio basal e as mudanças no sinal após a adição de glutamato. Curiosamente, uma análise de campo inteiro da mudança de cálcio (& # x0394F/F0) mostrou que EVs reduziu a resposta de cálcio após a adição de glutamato, mas esta redução foi mais drástica em resposta a ambos FAD- e SAD-EVs (Figura 7F). Os dados sugerem que ambos os tipos de AD-EVs induzem citotoxicidade e prejudicam a dinâmica do cálcio após a exposição ao glutamato em organóides corticais humanos.


Resultados

A permeabilidade do cálcio do receptor & # x003b19 & # x003b110 nicotínico é determinada pela subunidade & # x003b19

A injeção de Xenopus laevis oócitos com cRNAs que codificam as diferentes subunidades do nAChR resultam na expressão de canais funcionais na membrana celular. O tamanho considerável dos oócitos (& # x0223c1 mm), juntamente com o alto nível de expressão da proteína heteróloga, permite medir correntes que resultam de aberturas de canais em resposta à aplicação de agonista, usando a técnica de pinça de voltagem de dois eletrodos. Com o objetivo de determinar se o acúmulo de alterações de aminoácidos dentro da subunidade & # x003b110 (Franchini e Elgoyhen 2006) resultou em uma contribuição preferencial desta subunidade para a alta permeabilidade ao cálcio relatada de mamíferos & # x003b19 & # x003b110 nAChRs (Lipovsek et al . 2012), primeiro estudamos a contribuição relativa de cada subunidade para essa propriedade. Analisamos as respostas de receptores homoméricos (compostos apenas de subunidades idênticas) expressas heterologamente em Xenopus oócitos. Para avaliar Ca 2+ & # x0fb02ux através de nAChRs recombinantes, estudamos a contribuição do euClCa às respostas evocadas pela acetilcolina (Ach). euClCa é um canal Cl & # x02212 dependente de Ca 2+ presente em Xenopus oócitos, que tem alta sensibilidade ao Ca 2+ e é um detector ideal da entrada de cálcio no oócito (Barish 1983 Miledi et al. 1989). Receptores com alta permeabilidade ao Ca 2+, como & # x003b17 (Seguela et al. 1993) e rato & # x003b19 & # x003b110 (Elgoyhen et al. 2001) nAChRs, têm uma contribuição proeminente de euClCa às respostas evocadas por ACh, em comparação com uma contribuição modesta em nAChRs com menor permeabilidade de Ca 2+, como & # x003b14 & # x003b22 e frango & # x003b19 & # x003b110 (Lipovsek et al. 2012).Isso pode ser evidenciado pela incubação dos oócitos com o quelante rápido de Ca 2+ permeante de membrana 1,2-bis (2-aminofenoxi) etano-N,N,N& # x02032,N& # x02032-ácido tetraacético-éster acetoximetílico (BAPTA-AM), que elimina o componente Cl & # x02212 da corrente total medida. A Figura 1 mostra respostas representativas para 100 & # x003bcM ACh, em um potencial de retenção de membrana (Vsegurar) de & # x0221270 mV, antes e após uma incubação de 3 h com BAPTA-AM. Respostas anteriormente relatadas de nAChRs heteroméricos & # x003b19 & # x003b110 (Lipovsek et al. 2012) são incluídas para fins de comparação (fig. 1 UMA) As correntes evocadas por ACh foram marcadamente reduzidas em amplitude após o tratamento com BAPTA-AM no caso de rato & # x003b19 & # x003b110 (resposta após BAPTA: 14,8 & # x000b1 3,1% da resposta inicial, n = 12), mas permaneceu inalterado no caso de frango & # x003b19 & # x003b110 nAChRs (100,3 & # x000b1 14,1%, n = 6, fig. 1 UMA e tabela suplementar S1, Material Complementar online). Foi relatado que o receptor homomérico de rato & # x003b19 tem alta permeabilidade ao cálcio (Katz et al. 2000), semelhante à do receptor heteromérico de rato & # x003b19 & # x003b110 (Elgoyhen et al. 2001 Lipovsek et al. 2012 Weisstaub et al. 2002). Consequentemente, as correntes evocadas por ACh foram marcadamente reduzidas após a incubação com BAPTA-AM, indicando uma forte contribuição de euClCa à resposta inicial e, portanto, em & # x0fb02ux de Ca 2+ através deste receptor homomérico (fig. 1 B, traços superiores). Assim, a porcentagem de resposta restante após BAPTA-AM (14,3 & # x000b1 2,9%, n = 7) foi semelhante ao descrito anteriormente para rato & # x003b19 & # x003b110 nAChRs (tabela suplementar S1, Material Suplementar online Elgoyhen et al. 2001 Lipovsek et al. 2012). Em contraste, as respostas de ACh permaneceram inalteradas após a incubação de BAPTA-AM em oócitos que expressam o receptor homomérico de galinha & # x003b19 (99,5 & # x000b1 15,1%, n = 4 fig. 1 B, traços intermediários e tabela suplementar S1, Material Suplementar online), conforme observado para o frango & # x003b19 & # x003b110 nAChR (fig. 1 UMA Lipovsek et al. 2012), indicando uma contribuição insignificante de euClCa.

Chick & # x003b19 contendo receptores não ativam o oócito euClCa. Traços representativos de respostas evocadas por 100 & # x003bcM ACh em oócitos que expressam qualquer heteromérico (UMA), homomérico (B) ou híbrido (C), nAChRs, antes (esquerda & # x02014 traço preto) e depois (direita & # x02014 traço cinza) uma incubação de 3 h com o quelante de cálcio rápido BAPTA-AM (Vsegurar = & # x0221270 mV [Ca 2+]extracelular = 1,8 mM). Os rastros são representativos de n = 4 & # x0201312 por grupo.

Subunidades de mamíferos (rato e humano) & # x003b110 não são capazes de formar receptores homoméricos funcionais (Elgoyhen et al. 2001 Sgard et al. 2002). No entanto, a injeção de Xenopus oócitos com codificação de cRNA para a subunidade de frango & # x003b110 resultaram na expressão de receptores funcionais (fig. 1 B, traços inferiores). As correntes evocadas por ACh através dos receptores de frango & # x003b110 foram reduzidas após a incubação de BAPTA-AM (12,7 & # x000b1 4,7% da resposta inicial, n = 10), indicando uma forte contribuição de euClCa à resposta ACh e, portanto, em & # x0fb02ux de Ca 2+ (tabela suplementar S1, Material suplementar online). Estes resultados sugerem que é a subunidade & # x003b19 que determina a extensão da permeabilidade ao cálcio do & # x003b19 & # x003b110 nAChR. A fim de examinar esta possibilidade mais detalhadamente, injetamos Xenopus oócitos com duas combinações alternativas das subunidades & # x003b19 e & # x003b110, de modo a expressar receptores híbridos interespécies. As correntes evocadas por ACh foram marcadamente reduzidas após a incubação de BAPTA-AM, indicando uma forte contribuição de euClCa à resposta inicial e, portanto, em & # x0fb02ux de Ca 2+ através do receptor híbrido de rato & # x003b19 / frango & # x003b110 (fig. 1 C) A porcentagem de resposta remanescente após o tratamento com BAPTA deste híbrido interespécies (21,8 & # x000b1 8,2%, n = 5 tabela suplementar S1, Material Suplementar online) foi semelhante ao observado com o receptor de rato & # x003b19 & # x003b110 (P = 0,3329 fig. 1 UMA e tabela suplementar S1, Material Complementar online). Em contraste, as respostas de ACh do receptor híbrido de frango & # x003b19 / rat & # x003b110 permaneceram inalteradas após a incubação de BAPTA-AM (103,4 & # x000b1 20,0%, n = 7 fig. 1 C), semelhante ao comportamento do receptor de frango & # x003b19 & # x003b110 (fig. 1 UMA e tabela suplementar S1, Material Suplementar online), indicando baixo influxo de cálcio.

A configuração do grampo de tensão de dois eletrodos nos permite aplicar uma rampa de tensão aos oócitos que expressam nAChRs, medir a corrente através dos canais ativados em diferentes potenciais de retenção e, em seguida, traçar as curvas de corrente / tensão (I & # x02013V). Os receptores & # x003b19 & # x003b110 são canais catiônicos inespecíficos, permeáveis ​​a Na +, K + e Ca 2+, em condições fisiológicas. A fim de estimar a permeabilidade relativa ao Ca 2+ dos receptores recombinantes, medimos o potencial de reversão (Erev) como uma função da concentração extracelular de Ca 2+ (0,2 & # x020135 mM) e ajustou os dados à equação estendida de Goldman & # x02013Hodgkin & # x02013Katz (GHK). Erev é o potencial de corrente zero na figura 2, por exemplo, o potencial no qual a corrente inverte o sinal. Apenas mudanças na concentração extracelular de íons permeando afetarão o Erev. Para o receptor homomérico de rato & # x003b19, Erev mostrou uma dependência do cálcio extracelular semelhante ao do receptor heteromérico de rato & # x003b19 & # x003b110 (fig. 2 UMA painel esquerdo e B as inserções mostram um zoom próximo ao Erev para 0,5 e 5 mM de Ca 2+). Por conseguinte, o ajuste desses dados à equação GHK estendida rendeu uma alta razão de permeabilidade de cálcio (pCa / pNa, 6,1 & # x000b1 1,2, n = 4), como o receptor de rato & # x003b19 & # x003b110 (7,9 & # x000b1 0,6, n = 11 P = 0,1820 tabela suplementar S1, material suplementar online). Por outro lado, o valor de pCa / pNa para o receptor de frango & # x003b19 (2,6 & # x000b1 0,3, n = 12) foi semelhante ao obtido para o receptor de frango & # x003b19 & # x003b110 (2.3 & # x000b1 0.3, n = 9 P = 0,5098 fig. 2 UMA painel central e B tabela suplementar S1, material suplementar online), mas mais de três vezes menor do que a de rato & # x003b19 & # x003b110 (P & # x0003c 0,0001 tabela suplementar S1, material suplementar online). Finalmente, o receptor homomérico de frango & # x003b110 teve um alto pCa / pNa (6,9 & # x000b1 1.0, n = 8), semelhante ao do receptor de rato & # x003b19 & # x003b110 (P = 0,3907 fig. 2 UMA painel direito e B tabela suplementar S1, material suplementar online). Figura 2 C mostra curvas representativas I & # x02013V para o receptor híbrido rato & # x003b19 / frango & # x003b110 e a figura 2 D, Erev em função da concentração extracelular de cálcio. Consistente com os resultados obtidos na avaliação da ativação de euClCa ( Figura 1 C), o híbrido de rato & # x003b19 / frango & # x003b110 teve um alto pCa / pNa (9.0 & # x000b1 1.0, n = 7), semelhante ao do receptor de rato & # x003b19 & # x003b110 (P = 0,3013 tabela suplementar S1, material suplementar online). Assim, a subunidade de frango & # x003b110 não tem determinantes capazes de afetar a permeabilidade ao cálcio do receptor & # x003b19 & # x003b110.

Os receptores homoméricos e híbridos têm diferentes permeabilidades relativas ao cálcio. (UMA) Curvas I & # x02013V representativas obtidas pela aplicação de rampas de voltagem (& # x02212120 a +50 mV, 2 s) no platô da resposta a 100 & # x003bcM ACh em oócitos superfundidos com soluções baseadas em NMG + contendo diferentes Ca 2+ concentrações (0,5 mM, cinza e 5 mM, preto) para oócitos que expressam nAChRs de rato & # x003b19 (canto superior esquerdo), frango & # x003b19 (centro superior) ou frango & # x003b110 (canto superior direito). Inserções: Ampliação perto do Erev. (B) Parcela de Erev valores em função da concentração extracelular de Ca 2+ para nAChRs homoméricos de rato & # x003b19, frango & # x003b19 e frango & # x003b110 homomérico. Erev os valores para rato & # x003b19 & # x003b110 (vermelho) e frango & # x003b19 & # x003b110 (azul) são mostrados para comparação. Os valores são a média & # x000b1 SEM de 4 & # x0201312 experimentos por grupo. As linhas sólidas são ajustadas à equação GHK (consulte Materiais e métodos). (C) Idem como em (UMA) para oócitos que expressam nAChRs híbridos de rato & # x003b19 / frango & # x003b110. (D) Idem como em (B) para o rato & # x003b19 / frango & # x003b110 híbrido nAChR.

A Figura 3 resume as conclusões tiradas dos experimentos acima: Sempre que um receptor tem uma subunidade de rato & # x003b19 (círculo vermelho), seja homomérico, heteromérico ou híbrido, a ativação do euClCa é alto (porcentagem reduzida de resposta após BAPTA, fig. 3 UMA) e, portanto, a permeabilidade relativa do cálcio é alta (fig. 3 B) Pelo contrário, sempre que um receptor contém uma subunidade de frango & # x003b19 (círculo azul), a ativação do euClCa é baixo (fig. 3 UMA) e, portanto, a permeabilidade relativa ao cálcio é baixa (fig. 3 B) Portanto, a alta permeabilidade relativa ao cálcio do receptor nicotínico de mamífero & # x003b19 & # x003b110 resulta dos determinantes moleculares presentes na subunidade & # x003b19 e não na subunidade & # x003b110 como sugerido anteriormente pela análise de probabilidade máxima baseada em códon de seleção positiva (Franchini e Elgoyhen 2006 Lipovsek et al. 2012).

A subunidade & # x003b19 nAChR define a extensão da permeabilidade ao cálcio dos receptores & # x003b19 & # x003b110. (UMA) Porcentagem de resposta a 100 & # x003bcM ACh após 3 h de incubação com o quelante de cálcio rápido BAPTA-AM para nAChRs heteroméricos, homoméricos e híbridos. A percentagem da resposta inicial remanescente após a incubação com BAPTA foi determinada para cada oócito individualmente e, em seguida, calculada a média para cada receptor. Os valores são médios & # x000b1 SEM. (B) Permeabilidade relativa ao cálcio (pCa / pNa) conforme determinado a partir do encaixe Erev dados, como uma função da concentração de cálcio extracelular, para a equação GHK estendida para incluir cátions divalentes. Os valores são médios & # x000b1 SEM. Observe que sempre que uma subunidade de rato & # x003b19 está presente, a permeabilidade ao cálcio é alta e sempre que uma subunidade de frango & # x003b19 está presente, a permeabilidade ao cálcio é baixa.

Evolução molecular de mamíferos e subunidades # x003b19

Os experimentos descritos na primeira seção alocam as diferenças na extensão da permeabilidade ao cálcio dos receptores & # x003b19 & # x003b110 para a subunidade & # x003b19. No entanto, a análise anterior realizada nas sequências de codificação de & # x003b19 de 13 espécies de vertebrados não encontrou evidências de seleção positiva em qualquer região da proteína & # x003b19 ou em qualquer linhagem da filogenia de vertebrados (Franchini e Elgoyhen 2006). Agora estendemos esta análise para as sequências de codificação da subunidade & # x003b19 de 52 espécies de vertebrados, incluindo a adição relevante de seis espécies de aves / répteis. O alinhamento na figura suplementar S1, Material suplementar online, mostra que todas as sequências existentes usadas nos números de acesso da análise estão listadas na tabela suplementar S2, Material suplementar online. Realizamos o teste de seleção positiva de locais de ramificação, que detecta a presença de locais sob seleção positiva dentro de um determinado gene em linhagens específicas de uma filogenia (Yang e Nielsen 2002 Zhang et al. 2005). As linhagens de mamífero, eutério e sauropsídeo foram usadas como ramos de primeiro plano em análises separadas. Conforme mostrado na tabela 1, não encontramos nenhuma evidência estatisticamente significativa de seleção positiva na sequência de codificação da subunidade & # x003b19. No entanto, como os estudos funcionais indicam inequivocamente que as diferenças na permeabilidade ao cálcio são determinadas pela subunidade & # x003b19, isso pode ser conferido pelo pequeno número de diferenças de aminoácidos observadas entre as linhagens e que não são detectadas pelas análises de seleção positiva.

Tabela 1.

Estimativas de valor de verossimilhança para os modelos de local de filial e hipótese nula.

Modelos de local de filialLog probabilidadeLRTP(& # x003c7 2 1)
Mamíferos
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003Site da filial& # x0221220,543.1773310.0089440.9246
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003 Hipótese nula& # x0221220,543,186275
Eutheria
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003Site da filial& # x0221220,546.5292180.1122040.7376
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003 Hipótese nula& # x0221220,546.641422
Sauropsida
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003Site da filial& # x0221220,548.67749201
& # x02003 & # x02003 & # x02003 & # x02003 Hipótese nula& # x0221220,548.677494

N ota. & # X02014 O teste do local de ramificação para evolução positiva foi conduzido separadamente três vezes usando mamíferos (Mammalia), mamíferos placentários (Eutheria) e aves / répteis (Sauropsida) como linhagem de primeiro plano. LRT = 2 & # x000d7 (ln LHUMA & # x02212 ln LH0) HUMA, modelo de local de filial H0, hipótese nula ln L, log-verossimilhança.

A fim de aprofundar nosso conhecimento sobre a história evolutiva das sequências de codificação da subunidade & # x003b19 e seu número limitado de substituições não-sinônimas entre as linhagens, realizamos uma reconstrução da sequência ancestral para todos os nós da filogenia representada na figura suplementar S2, Material Suplementar online . Nosso objetivo foi identificar a ocorrência de substituições de aminoácidos específicas para cada grupo principal. O alinhamento da figura suplementar S1, Material Suplementar online, mostra todas as sequências existentes usadas na análise, junto com as sequências ancestrais preditas dos nós principais.

No geral, um maior grau de divergência do ancestral amniota comum foi observado para os mamíferos do que para a linhagem sauropsídeo (pássaros e répteis) (veja também comprimentos de ramos na figura suplementar S2, Material Suplementar online). Uma inspeção cuidadosa do alinhamento das sequências existentes e daquelas previstas para os nós principais mostrou que, ao comparar as sequências de aminoácidos de mamífero versus sauropsídeo & # x003b19, ambas ramificando do amniota ancestral, 42 locais mostraram substituições específicas de ramificação não sinônimas (destacadas no alinhamento). A tabela suplementar S3, Material suplementar online, mostra o estado do personagem e sua probabilidade posterior marginal correspondente para cada um desses locais para todos os nós principais da filogenia e espécies representativas de cada grupo. Figura 4 UMA resume a história evolutiva desses locais, mostrando apenas resíduos correspondentes às sequências de rato e galinha & # x003b19 existentes, as sequências ancestrais previstas para seus grupos correspondentes (Eutheria e Diapsida, respectivamente) e a sequência ancestral amniota comum prevista & # x003b19. A sequência ancestral amniota compartilhou 36 desses 42 aminoácidos com a linhagem diápsida (e sauropsídeo). Por outro lado, compartilhou apenas seis aminoácidos com eutheria (cinco com Boreoeutheria) (fig. 4 UMA) A assimetria observada de divergência de sequência após a divisão do amniota ancestral sugere que a alta permeabilidade ao cálcio observada nos receptores & # x003b19 & # x003b110 de mamíferos pode ser o estado de caráter divergente, isto é, o receptor & # x003b19 & # x003b110 do amniota ancestral pode ter tinha baixa permeabilidade ao cálcio. Se este fosse o caso, algumas das substituições não sinônimas que se acumularam ao longo da história evolutiva da linhagem dos mamíferos deveriam ter conferido a alta permeabilidade ao cálcio observada nos receptores & # x003b19 & # x003b110 dos mamíferos existentes.

A reconstrução da sequência ancestral aloca substituições não sinônimas para a linhagem dos mamíferos. (UMA) Resíduos de aminoácidos presentes nos 42 locais específicos de clado para as sequências existentes de rato e galinha & # x003b19 e sequências ancestrais preditas de eutéria, diapsida e amniota & # x003b19. Vermelho, resíduo de mamífero azul, resíduo de sauropsídeo verde, resíduo de tetrápode. Observe que a maioria dos resíduos presentes na sequência de amniota ancestral prevista corresponde a resíduos de sauropsídeo. (B) Estrutura do Torpedo californica nAChR (2bg9 Unwin 2005) mostrando, em azul, a localização homóloga dos sítios que apresentam substituições não-sinônimas específicas do clado e estão posicionados ao longo da via de condução de íons. Os locais específicos do clado K433, L435, K436, T441, N442, S443 e S446 da MA & # x003b1-hélice também estão destacados em azul. Duas subunidades foram removidas para uma melhor visualização do canal. O domínio transmembranar 2 & # x003b1-hélices de revestimento de poro são destacados em rosa. (C) Filogenia esquemática que descreve a história evolutiva dos seis locais analisados ​​por mutagênese dirigida ao local: 110 e 127 no vestíbulo extracelular, e 24 & # x02032, 11 & # x02032, 7 & # x02032, e & # x022124 & # x02032 em, ou flanqueando o Domínio TM2 (numeração de rato & # x003b19 e Miller 1989). Para cada local, o estado do caractere (aminoácido) e a probabilidade posterior da reconstrução marginal são mostrados. Vermelho, resíduo de mamífero azul, resíduo de sauropsídeo branco, resíduo presente apenas em monotremados.

Três substituições de aminoácidos específicas de mamíferos conferem alta permeabilidade de cálcio aos mamíferos & # x003b19 & # x003b110 nAChRs

A fim de determinar quais das 37 substituições não sinônimas adquiridas durante a história evolutiva das subunidades de mamíferos & # x003b19 são responsáveis ​​pelo aumento resultante na permeabilidade ao cálcio, primeiro destacamos os diferentes resíduos localizados em regiões do receptor conhecidas por afetar a seletividade de íons ( destacado em azul na fig. 4 B) Dois resíduos estão localizados no vestíbulo extracelular (D110 e S127), quatro em ou flanqueando o domínio de revestimento de poros TM2 (A264 (-4 & # x02032), I275 (7 & # x02032), M279 (11 & # x02032) e A292 ( 24 & # x02032)), enquanto os sete resíduos restantes (K433, L435, K436, T441, N442, S443 e S446) estão na membrana associada (MA) & # x003b1-hélice do domínio intracelular (rato & # x003b19 numeração & # x02014 e para o domínio TM2, numeração após Miller [1989]). A filogenia da figura 4 C mostra a história evolutiva dos seis locais localizados nos domínios extracelular e TM2, ilustrando claramente que as substituições não sinônimas são exclusivas da linhagem de mamíferos.

Para testar o efeito na permeabilidade ao cálcio das substituições não-sinônimas específicas do ramo de mamífero localizadas nos domínios extracelular e transmembrana, cada aminoácido presente na subunidade & # x003b19 de rato foi revertido para o resíduo correspondente na subunidade amniota ancestral prevista. Para avaliar o efeito de todas as substituições encontradas no domínio intracelular altamente variável, incluindo as sete substituições específicas de clado localizadas na hélice MA & # x003b1 mais conservada, construímos uma subunidade quimérica na qual todo o domínio intracelular do rato & A subunidade # x003b19 foi substituída pelo domínio intracelular da subunidade & # x003b19 da galinha. Subunidades & # x003b19 de rato mutante ou quimérico foram co-injetadas com a subunidade & # x003b110 de rato de tipo selvagem. A permeabilidade ao cálcio foi avaliada, como antes, analisando a ativação do oócito & # x02019s euClCa (fig. 5 UMA e tabela suplementar S1, Material Suplementar online) e pela determinação da permeabilidade relativa ao cálcio (pCa / pNa fig. 5 B e figo suplementar. S3, material suplementar online).

Mutações no vestíbulo extracelular e a saída do poro do canal alteram a permeabilidade ao cálcio do receptor de rato & # x003b19 & # x003b110. (UMA) Traços representativos de respostas evocadas por 100 & # x003bcM ACh em oócitos expressando rato & # x003b19 & # x003b110 receptores mutantes únicos: rato & # x003b19D110N & # x003b110 (painel esquerdo), rato & # x003b19S127F & # x003b110 (painel do meio) e rato & # x003b110 (painel do meio) # x003b19 A-4 & # x02032D & # x003b110 (painel direito), antes (esquerdo & # x02014 traço preto) e depois (direito & # x02014 traço cinza) uma incubação de 3 horas com o quelante rápido de cálcio BAPTA-AM (Vsegurar = & # x0221270 mV [Ca 2+]extracelular = 1,8 mM). Os rastros são representativos de n = 4 & # x020136 por grupo. (B) Parcela de Erev valores em função da concentração extracelular de Ca 2+ para rato & # x003b19D110N & # x003b110 (painel esquerdo), rato & # x003b19S127F & # x003b110 (painel do meio) e rato & # x003b19 A-4 & # x02032D & # x003b110 (painel direito) receptores mutantes. Erev os valores para rato & # x003b19 & # x003b110 (vermelho) e frango & # x003b19 & # x003b110 (azul) são mostrados para comparação. Os valores são a média & # x000b1 SEM de 5 & # x0201311 experimentos por grupo. As linhas sólidas são ajustadas à equação GHK (consulte Materiais e métodos).

O receptor mutante de rato & # x003b19 & # x003b110 com a substituição D110N, localizado no vestíbulo extracelular, ativou o oócito & # x02019s euClCa em menor extensão (59,8 & # x000b1 11,9% da corrente restante após o tratamento com BAPTA, n = 6 fig. 5 UMA painel esquerdo e tabela suplementar S1, material suplementar online) do que o rato & # x003b19 & # x003b110 contraparte de tipo selvagem (14,8 & # x000b1 3,1%, n = 12, P = 0,0002 fig. 1 UMA e tabela suplementar S1, Material Suplementar online), indicando redução do influxo de cálcio. Esta substituição também reduziu a permeabilidade relativa do cálcio do receptor mutante (5,5 & # x000b1 0,3, n = 7 fig. 5 B painel esquerdo e tabela suplementar S1, Material Suplementar online), quando comparado com o rato de tipo selvagem & # x003b19 & # x003b110 receptor (7,9 & # x000b1 0,6, n = 11, P = 0,0206). A substituição S127F também produziu uma redução significativa do influxo de cálcio (49,4 & # x000b1 8,4% da corrente remanescente após BAPTA, n = 5, P = 0,0002 fig. 5 UMA tabela intermediária e suplementar S1, Material suplementar online) e uma diminuição significativa em pCa / pNa (5,4 & # x000b1 0,4, n = 5, P = 0,0408 fig. 5 B S1 capaz de meio e suplementar, Material Suplementar online), quando comparado com o receptor de rato de tipo selvagem & # x003b19 & # x003b110. Esses resultados indicam que esses dois resíduos localizados no vestíbulo do receptor, longe do poro do canal, contribuem para a seletividade para cátions divalentes versus monovalentes no receptor de rato & # x003b19 & # x003b110.

Para analisar melhor se esses resíduos do vestíbulo de fato interagem com a passagem de íons de cálcio, realizamos uma simulação MD em um modelo de homologia do receptor de rato & # x003b19 & # x003b110. Aplicamos um vetor de força a um íon de cálcio hidratado e medimos essa força quando o cálcio foi empurrado para o vestíbulo. O aumento na amplitude da força necessária para que o cálcio se mova mais profundamente no canal, conforme o tempo de simulação avança, é um indicador da força de sua interação com os resíduos do vestíbulo. Figura 6 UMA mostra um gráfico da força associada à passagem de cálcio através do canal em função do tempo de simulação (1,25 ns & # x02014 cinco repetições). Os picos (setas vermelhas em 0,1, 0,7 e 1,1 ns) indicam tempos de simulação em que o cálcio interage mais fortemente com resíduos específicos dentro do vestíbulo. Assim, à medida que atravessa o vestíbulo extracelular, um íon cálcio interage primeiro com os resíduos D110 e E129 da subunidade & # x003b19 (fig. 6 B, a 0,1 ns) e os resíduos F39 e Y42 da subunidade & # x003b110 (todos numerados após rato & # x003b19). Em seguida, ele interage com os resíduos D124 / D125 da subunidade & # x003b19 (fig. 6 C, a 0,7 ns). Finalmente, o íon cálcio interage com uma série de resíduos altamente conservados localizados na boca do poro do canal: resíduos E294 das subunidades & # x003b19 e & # x003b110, localizados nos respectivos loops TM2 & # x02013TM3 e resíduos N74 do & # x003b19 subunidade e D71 e N74 da subunidade & # x003b110, localizadas nos respectivos loops & # x003b21 & # x02013 & # x003b22 (fig. 6 D, a 1,1 ns). Assim, esta evidência mostra uma interação direta do resíduo D110 com o cálcio que permeia. Além disso, posiciona o resíduo S127 entre dois locais de interação consecutivos, E129 e D124 / D125, denotando a relevância das duas substituições específicas de mamíferos, localizadas no vestíbulo do receptor, no mecanismo de permeação de cálcio.

A simulação MD mostra a interação do cálcio com resíduos no vestíbulo extracelular. (UMA) Força associada à passagem do cálcio hidratado pelo vestíbulo do canal, em função do tempo de simulação. Setas vermelhas indicam picos de força que denotam interações com resíduos de canal em momentos diferentes ao longo da trajetória. (B & # x02013D) Estrutura do modelo de homologia do receptor de rato & # x003b19 & # x003b110 mostrando a passagem de um íon de cálcio (roxo) através do vestíbulo do canal em diferentes tempos de simulação. Os resíduos D110 e S127, analisados ​​por mutagênese dirigida ao local, são destacados em azul claro. Outros resíduos que interagem com o íon cálcio são destacados em amarelo (subunidade & # x003b19) e verde (subunidade & # x003b110). Cinza escuro, & # x003b19 subunidades cinza claro & # x003b110 subunidade. Duas subunidades & # x003b110 e moléculas de água foram removidas para uma melhor visualização do vestíbulo. Um close-up das interações é mostrado nos painéis do meio. As linhas azuis pontilhadas indicam as interações do íon cálcio com os resíduos do canal, as distâncias de interação correspondentes são mostradas ao lado em & # x000c5. (B) 0,1 ns: o cálcio interage com os resíduos D110 e E129 da subunidade & # x003b19 e com os resíduos F38 e Y41 de uma das subunidades & # x003b110 removidas. (C) 0,7 ns: o cálcio interage com D124 e D125 da subunidade & # x003b19. (D) 1,1 ns: o cálcio interage com os resíduos E294 da subunidade & # x003b19 e E293 da subunidade & # x003b110, localizados nos respectivos loops TM2 & # x02013TM3 e com os resíduos N74 da subunidade & # x003b19 e D70 e N73 do & # x003b110 subunidade, localizada nos respectivos loops & # x003b21 & # x02013 & # x003b22.

Ao considerar os resíduos localizados no ou perto do domínio de revestimento de poros TM2 do receptor de rato & # x003b19 & # x003b110, nenhuma das substituições A24 & # x02032P, I7 & # x02032V nem M11 & # x02032L teve um efeito significativo na ativação do oócito & # x02019s euClCa ou a permeabilidade relativa ao cálcio (pCa / pNa) (tabela suplementar S1, Material Suplementar online e fig. S3). Em contraste, a substituição A-4 & # x02032D, localizada em um anel intracelular de resíduos carregados (Imoto et al. 1988), produziu uma diminuição significativa na ativação do oócito & # x02019s euClCa (59,5 & # x000b1 5,9% da corrente restante após o tratamento com BAPTA, n = 4 fig. 5 UMA tabela S1 direita e suplementar, Material Suplementar online), quando comparado com a contraparte de tipo selvagem de rato & # x003b19 & # x003b110 (14,8 & # x000b1 3,1%, n = 12, P & # x0003c 0,0001 fig. 1 UMA e tabela suplementar S1, Material Complementar online). Consequentemente, a substituição A-4 & # x02032D também produziu uma redução significativa da permeabilidade relativa ao cálcio (4,8 & # x000b1 0,3, n = 11 fig. 5 B painel direito e tabela suplementar S1, Material Suplementar online), quando comparado com o receptor de tipo selvagem de rato & # x003b19 & # x003b110 (7,9 & # x000b1 0,6, n = 11, P = 0,0002). Finalmente, a troca completa do domínio intracelular, abrangendo as sete substituições específicas de clado do MA & # x003b1-hélice para processar o receptor quimérico de rato & # x003b19 (IC-frango & # x003b19) & # x003b110, não teve efeito sobre permeabilidade relativa ao cálcio (tabela suplementar S1, Material suplementar online e fig. S3).

Em resumo, apenas as substituições D110N, S127F e A-4 & # x02032D reduziram a permeabilidade ao cálcio do receptor de rato & # x003b19 & # x003b110 de tipo selvagem, embora nenhum em toda a extensão da baixa permeabilidade ao cálcio observada para o frango & # x003b19 & # x003b110 nAChR. Portanto, subsequentemente incorporamos todas as três substituições na subunidade rat & # x003b19. Este receptor triplo mutante & # x003b19 & # x003b110 mostrou baixo influxo de cálcio (100,5 & # x000b1 13,9% da corrente restante após BAPTA, n = 6 fig. 7 UMA e tabela suplementar S1, Material Suplementar online), semelhante ao observado para o frango & # x003b19 & # x003b110 nAChR (P = 0,9924). Consequentemente, a presença de todas as três substituições reduziu quase 3 vezes a permeabilidade relativa ao cálcio do rato & # x003b19 & # x003b110 nAChR mutante triplo para um valor de pCa / pNa (3,2 & # x000b1 0,4, n = 7) comparável ao da contraparte de frango (2.3 & # x000b1 0.3, n = 9, P = 0,0541 fig. 7 B e tabela suplementar S1, Material Complementar online). Ao todo, esses resultados mostram que a ocorrência de apenas três substituições não sinônimas dentro da subunidade & # x003b19 foi suficiente para aumentar a permeabilidade ao cálcio do receptor & # x003b19 & # x003b110 de mamífero, um evento evolutivo que ocorreu após a separação do ancestral amniota.

O mutante triplo de rato & # x003b19N110D / S127F / A-4 & # x02032D & # x003b110 mostra baixa permeabilidade ao cálcio semelhante à ave. (UMA) Traços representativos de respostas evocadas por 100 & # x003bcM ACh em oócitos que expressam o rato & # x003b19N110D / S127F / A-4 & # x02032D & # x003b110 receptor triplo mutante, antes (esquerdo & # x02014 traço preto) e depois (direito & # x02014 traço cinza) a Incubação de 3 h com o quelante de cálcio rápido BAPTA-AM (Vsegurar = & # x0221270 mV [Ca 2+]extracelular = 1,8 mM). Os rastros são representativos de n = 6. (B) Parcela de Erev valores em função da concentração extracelular de Ca 2+ para o receptor triplo mutante de rato & # x003b19N110D / S127F / A-4 & # x02032D & # x003b110. Erev os valores para rato & # x003b19 & # x003b110 (vermelho) e frango & # x003b19 & # x003b110 (azul) são mostrados para comparação. Os valores são a média & # x000b1 SEM de 7 & # x0201311 experimentos por grupo. As linhas sólidas são ajustadas à equação GHK (consulte Materiais e métodos).

O aumento da permeabilidade do cálcio é exclusivo da linhagem dos mamíferos

Os três aminoácidos identificados como determinantes do aumento na permeabilidade ao cálcio dos receptores de mamíferos & # x003b19 & # x003b110 representam substituições não sinônimas, que são exclusivas da linhagem de mamíferos. Em seguida, perguntamos se a introdução desses aminoácidos na subunidade de frango & # x003b19 pode levar a um receptor de frango & # x003b19 & # x003b110 altamente permeável ao cálcio. Consequentemente, mutamos cada um dos três resíduos de aminoácidos na subunidade & # x003b19 de frango para o resíduo correspondente presente nas subunidades & # x003b19 de mamíferos e expressamos receptores mutantes com a subunidade & # x003b110 de frango de tipo selvagem.

As substituições N110D e F127S no vestíbulo extracelular não modificaram a permeabilidade relativa ao cálcio, quando mutadas individualmente (fig. 8 UMA e tabela suplementar S1, Material Complementar online). A substituição D-4 & # x02032A produziu um aumento significativo na permeabilidade relativa ao cálcio (pCa / pNa: 3,7 & # x000b1 0,4, n = 11 fig. 8 B e a tabela suplementar S1, Material Suplementar online), quando comparado com o receptor de frango & # x003b19 & # x003b110 (2.3 & # x000b1 0.3, de tipo selvagem, n = 9, P = 0,0070). Quando N110D e F127S foram incorporados junto com a substituição D-4 & # x02032A, o cálcio relativo para a permeabilidade monovalente não diferiu daquele do receptor de tipo selvagem de galinha (pCa / pNa = 2,7 & # x000b1 0,3, n = 6 P = 0,3238 fig. 8 B) Estes resultados indicam que a introdução das substituições específicas de mamíferos no contexto do receptor de frango & # x003b19 & # x003b110 não reproduz a alta permeabilidade de cálcio descrita para os receptores de mamíferos & # x003b19 & # x003b110 e apóia ainda a conclusão de que o aumento de cálcio permeabilidade de & # x003b19 & # x003b110 nAChRs é um evento específico de mamífero.

Mutações específicas de mamíferos não aumentam a permeabilidade ao cálcio do receptor de frango & # x003b19 & # x003b110. Parcela de Erev valores em função da concentração extracelular de Ca 2+ para mutantes de vestíbulo extracelular de frango & # x003b19N110D & # x003b110 e de frango & # x003b19F12SF & # x003b110 vestíbulo extracelular (UMA) e pintinho & # x003b19D-4 & # x02032A & # x003b110 TM1 & # x02013TM2 mutante de loop e frango & # x003b19D110N / F127S / D-4 & # x02032A & # x003b110 receptor triplo mutante (B) Erev os valores para rato & # x003b19 & # x003b110 (vermelho) e frango & # x003b19 & # x003b110 (azul) são mostrados para comparação. Os valores são a média & # x000b1 SEM de 5 & # x0201311 experimentos por grupo. As linhas sólidas são ajustadas à equação GHK (consulte Materiais e métodos).

A fim de explorar ainda mais um mecanismo subjacente plausível para esta observação paradoxal, geramos modelos de homologia para receptores de rato e galinha & # x003b19 & # x003b110 do tipo selvagem e mutados nas posições 110, 127 e 4 & # x02032 e realizamos uma análise dos receptores eletrostáticos potencial dos vestíbulos do canal. Figura 9 UMA mostra o receptor de tipo selvagem de rato & # x003b19 & # x003b110 como um exemplo sombreado em cinza é o potencial eletrostático de um plano longitudinal que corta no meio-vagalmente através do receptor (a posição do plano é mostrada na vista superior girada do receptor no painel esquerdo). Os valores para o potencial foram medidos ao longo de uma central Z eixo (linha pontilhada na fig. 9 UMA) e são plotados, para todos os quatro receptores, na figura 9 B. Na proximidade das mutações (asteriscos roxos), observamos apenas pequenas modificações do potencial eletrostático, embora do sinal esperado, por exemplo, a mudança do negativo D110 e polar S127 da subunidade rato & # x003b19, para o polar N e F hidrofóbico, resultou em um potencial menos negativo, enquanto as mudanças opostas dentro da subunidade de frango & # x003b19 causaram o efeito reverso. Visivelmente, essas mutações tiveram um efeito de longo alcance mais forte no potencial eletrostático na porção mais profunda do vestíbulo, imediatamente antes da entrada para a região transmembrana (TM), a região que corresponde ao terceiro local de interação do cálcio, em 1,1 ns de simulação tempo, conforme descrito nas simulações MD (ver fig. 6). Assim, no caso do receptor de rato & # x003b19 & # x003b110, a presença das substituições D110N e S127F diminuiu o potencial eletrostático nesta região profunda do vestíbulo, em uma extensão semelhante à do frango selvagem & # x003b19 & Receptor # x003b110 de acordo com a redução prevista e observada na permeabilidade ao cálcio. Pelo contrário, as substituições reversas, N110D e F127S, no receptor de frango & # x003b19 & # x003b110 não trouxeram o potencial eletrostático mais próximo do potencial menos eletronegativo observado para o receptor de tipo selvagem de rato, mas mais distante, de acordo com o falta de aumento na permeabilidade ao cálcio observada para o receptor de frango mutante & # x003b19 & # x003b110. Isso ainda apóia a conclusão de que o acúmulo de substituições não sinônimas dentro da subunidade & # x003b19 que afetam a permeabilidade ao cálcio é um evento específico para mamíferos.

A modelagem de homologia mostra que substituições pontuais de aminoácidos no domínio extracelular têm efeitos de longo alcance no potencial eletrostático. (UMA) Modelo de homologia do receptor de tipo selvagem de rato & # x003b19 & # x003b110 mostrando, em escala de cinza, o potencial eletrostático em um plano longitudinal medianoagital ao vestíbulo. A localização do avião é mostrada em uma vista superior do receptor (painel esquerdo). Apenas as subunidades no plano da seção são mostradas. A linha preta pontilhada denota a localização do centro Z eixo. As linhas pontilhadas em azul claro denotam a localização dos três locais de interação do cálcio correspondentes aos tempos de simulação de 0,1 -, 0,7 - e 1,1-ns, conforme ilustrado na figura 6. A posição das duas substituições de aminoácidos estudadas é indicada por asteriscos roxos. (B) Potencial eletrostático determinado na central Z eixo para ratos e galinhas & # x003b19 & # x003b110 receptores de tipo selvagem e mutantes, abrangendo todo o comprimento do vestíbulo. Asteriscos roxos denotam a localização dos resíduos substituídos 110 e 127.


6. Discussão

O original rxd pacote expandido de modelagem multiescala em NEURON das escalas eletrofisiológicas de neuritos, células e redes em escalas quimiofisiológicas de espinhos, organelas subcelulares, interactômica, metabolômica, proteômica. Este desenvolvimento posterior do módulo no domínio do espaço extracelular estende consideravelmente o escopo da quimofisiologia nas vastas distâncias do espaço interneuronal. O desempenho computacional para este problema de larga escala é melhorado pelo uso de paralelização multi-threading do algoritmo DG-ADI para difusão, paralelização multiprocessador para eletrofisiologia e compilação JIT de reações. A implementação do módulo ECS foi verificada em relação a uma solução analítica, um teste de conservação e por comparação com um simulador estabelecido.

A extensão para simulação de órgão inteiro no cérebro é particularmente importante para o desenvolvimento de modelagem multiescala para aplicações clínicas (Hunt et al., 2018, Mulugeta et al., 2018).No passado, grandes simulações neurais eram tipicamente redes neuronais que se concentravam exclusivamente na atividade elétrica dos neurônios e sua influência mútua por meio de sinapses químicas e elétricas. Essas simulações de rede neuronal operaram efetivamente no vácuo, omitindo os efeitos de neuromoduladores não sinápticos, gases neuromoduladores, íons, glia, metabólitos, etc. Esses agentes fisiológicos também desempenham papéis fisiopatológicos, por exemplo, as concentrações excessivas de íons vistas na depressão alastrante, e falta de metabólitos que causa danos aos tecidos por isquemia e acidente vascular cerebral. Os agentes farmacológicos usados ​​nos tratamentos também são difundidos de forma difusiva, assim como os agentes e efeitos associados à microglia. Fatores mecânicos de trauma cerebral e corrente na estimulação elétrica seguem seus respectivos limites de impedância do tecido. Muitos distúrbios patológicos, particularmente acidente vascular cerebral e lesão cerebral traumática, envolvem grandes volumes de tecido. Por esta razão, o desenvolvimento inicial de nossa nova extensão se concentrou na discretização espacial grosseira para acomodar grandes distâncias, permitindo que redes neuronais representativas sejam semeadas em um mosaico de localizações dentro do volume.

6.1. Abordagem de grande volume médio

Modelos eletrofisiológicos em NEURON podem especificar correntes em termos absolutos ou como densidades de corrente. No último caso, a área da superfície da membrana deve ser usada para calcular a corrente. O ECS rxd O módulo identifica o fluxo de íons de correntes, que são então colocadas no voxel correspondente da simulação ECS. A medida macroscópica da difusão iônica no tecido a granel observada experimentalmente com sensores seletivos de íons, biossensores e voltametria cíclica de varredura rápida pode ser usada para restringir parâmetros (Budygin et al., 2000 Dale et al., 2005 Nicholson and Hrab & # x0011Btov & # x000E1, 2017).

Atualmente, oferecemos suporte a duas condições de contorno: condições de contorno de Neumann (fluxo de contorno constante) e condições de Dirichlet (concentração de contorno constante). As condições de contorno de Neumann são adequadas para na Vivo modelos em que simulamos um pedaço de cérebro em continuidade com outros pedaços de cérebro semelhantes. Nesse caso, qualquer substância que saísse do espaço simulado seria substituída por substância de regiões vizinhas. Por outro lado, as condições de Dirichlet (limite constante) são apropriadas se a região modelada não for representativa, como ocorre em condições patológicas, como a área central de um AVC. Neste caso, espera-se que as perturbações nas concentrações extracelulares sejam restauradas suficientemente longe de sua fonte. Em ambos os casos, a depuração ainda pode ser modelada usando modelos NEURON ou reações extracelulares para representar o transporte através da barreira hematoencefálica. Se o ECS for grande o suficiente em relação à duração da simulação, a escolha das condições de contorno não terá um efeito significativo nos resultados.

6,2 Múltiplos usos da simulação de difusão-reação extracelular

Existem muitas formas de sinalização extra-sináptica extracelular entre as células. Aqui, ilustramos a utilidade do módulo com um modelo simples para depressão de espalhamento, onde o & # x0201Csignal & # x0201D é uma mudança na concentração de íons. O extracelular rxd módulo tem uma ampla gama de aplicações potenciais rastreando a variedade de substâncias de relevância fisiológica e patológica. Por exemplo, substâncias neurotóxicas, como radicais livres, difundem-se para longe de áreas do tecido amiloide danificado - oligômeros & # x003B2 podem se difundir para longe de células específicas, criando o dobramento incorreto da proteína em células remotas (Waters, 2010). Tanto o transbordamento sináptico quanto a liberação não sináptica fornecem difusão de neurotransmissores (por exemplo, glutamato e excitotoxicidade) e de neuromoduladores: dopamina, acetilcolina, norepinefrina, adenosina, etc. Por exemplo, a dopamina (DA) no estriado é liberada por projeções axonais do mesencéfalo, e difunde-se em uma região local antes da recaptação pelo transportador DA (Sulzer et al., 2016). Modelos de atividade estriatal em condições fisiológicas (Humphries et al., 2010) ou patológicas (Migliore et al., 2008, Blackwell et al., 2018) se beneficiariam ao incluir essa disseminação extracelular de dopamina. A simulação da dopamina extracelular seguiria o mesmo procedimento descrito na seção 3.1, especificando a região com tortuosidade e porosidade, a espécie com seu coeficiente de difusão e condições de contorno e as reações que a removem do ECS, incluindo a cinética dos transportadores DA.

6.3. Desenvolvimento futuro

A simulação ECS desenvolvida aqui fornecerá a mais ampla escala espacial para futuros modelos multiescala que irão adicionar métodos adicionais em escalas menores. Esses métodos múltiplos irão se interconectar de modo a serem usados ​​juntos em simulações multiescala únicas que coordenam uma ampla gama de escalas espaciais e temporais, que não poderiam ser avaliadas usando uma discretização fina uniforme, ou algoritmos uniformes por toda parte. Nas melhores escalas, métodos estocásticos serão usados ​​para entender melhor a variabilidade vista em pequena escala, por exemplo, em fendas sinápticas. O método de simulação adicional que está sendo abordado atualmente inclui técnicas para compreender o fluxo de corrente de tecido em massa para simular a estimulação de corrente profunda e transcraniana. Quer sejam induzidos externamente ou produzidos por potenciais de campo locais (Lind & # x000E9n et al., 2014), os efeitos do campo elétrico em massa não só despolarizam ou hiperpolarizam as células, mas também afetam a difusão de íons e outras espécies carregadas, ou seja, o fenômeno da eletrodifusão. Não apenas os íons são afetados pelo campo, os íons também produzem um campo que afetará outros íons, potencialmente produzindo campos da ordem de centenas de microvolts em 1 mm de tecido (Halnes et al., 2016 Solbr & # x000E5 et al., 2018). É provável que tais gradientes tenham uma influência ainda maior no SD, onde há uma grande redistribuição de íons.

Existem vários outros processos importantes em nível de órgão que são particularmente importantes para a patologia cerebral. Isso inclui o fluxo sanguíneo, que é importante para a compreensão do derrame, e propriedades mecânicas importantes para a compreensão da lesão cerebral traumática. Processos adicionais exclusivos do cérebro incluem produção, fluxo e recaptação de LCR e o estado da barreira hematoencefálica. Mais controverso é o papel da advecção e # x02014fluxo de fluido. O cérebro carece de um sistema linfático para eliminação de resíduos e os pequenos espaços entre as células, & # x0007E40 nm, são muito pequenos para suportar a advecção (Jin et al., 2016 Holter et al., 2017). Foi hipotetizado que, em vez disso, usar um sistema glifático que estabelece o fluxo de fluido através dos canais da aquaporina-4 astrocítica glial, impulsionados pelas pulsações da respiração e batimentos cardíacos. O fluido fluiria através dos astrócitos orientados para fornecer as vias que não podem ser suportadas pelo interstício (Iliff et al., 2012).

Todos esses processos são atualmente objeto de modelagem multiescala em vários graus de sofisticação (Anderson e Vadigepalli, 2016 Linninger et al., 2016 Calvetti et al., 2018 Durka et al., 2018 Zhao et al., 2018). Embora não seja prático incorporar esses muitos tipos de simulação dentro do NEURON, haverá possibilidades de comunicação entre simuladores, fornecendo simulações multifísicas complexas no futuro (Djurfeldt et al., 2010). Nesse ínterim, alguns aspectos dessa complexidade podem ser prontamente incorporados sem considerar os detalhes: por exemplo, a vascularização do cérebro pode ser modelada como um & # x0201C campo de metabolito & # x0201D que levaria em conta a maior disponibilidade de oxigênio e glicose em locais dentro, e disponibilidade reduzida no áreas de bacia hidrográfica que ficam entre as principais árvores de distribuição da artéria.

O termo modelagem em mosaico pode ser usado para descrever essas complexas simulações multiescala, multifísica, multialgorítmica e multidimensional & # x02014 o mosaico envolve pedaços de uma célula ou de um cérebro simulado com dimensionalidade diferente, algoritmos diferentes e discretizações diferentes. Um exemplo no nível celular são os espinhos, que são mais bem tratados estocasticamente e em três dimensões, enquanto o resto da célula é tratado de forma determinística e como uma estrutura de árvore ramificada unidimensional (Lin et al., 2017a, b). Da mesma forma, no ECS, pequenos espaços, como sinapses, requerem uma abordagem microscópica que não é prática para modelagem de tecido em massa. No futuro, essas peças do mosaico serão adaptadas de abordagens atualmente utilizadas por outros simuladores. Por exemplo, uma abordagem em pequenas escalas é rastrear partículas individuais, feito por Smoldyn (Andrews, 2012) e MCell (Stiles e Bartol, 2001 Franks et al., 2002). Outra técnica de pequeno volume usa volumetria média feita pela plataforma ENOS, que também tem sido usada para modelos de alta resolução de sinapses glutamatérgicas e sua interação com a glia (Bouteiller et al., 2008). Outras plataformas que suportam a difusão intracelular também serão exploradas para técnicas adicionais, incluindo STEPS (Wils e De Schutter, 2009), NeuroRD (Brandi et al., 2011), MOOSE (Ray e Bhalla, 2008).


(BBB). Barreira fisiológica formada por células endoteliais do SNC para regular o tráfego de moléculas entre o sangue e o cérebro.

(NVC). O processo pelo qual a ativação neural local pode aumentar rapidamente o fluxo sanguíneo local é a base da ressonância magnética funcional.

Um termo coletivo para descrever os tipos de células que envolvem os vasos sanguíneos, incluindo as células musculares lisas nas artérias e pericitos nos capilares.

Estruturas vesiculares em forma de frasco formadas por caveolinas, com aproximadamente 70 nm de diâmetro.

Toxina que inibe a síntese de proteínas, levando à morte celular.

Crescimento de novos vasos sanguíneos a partir de vasos sanguíneos existentes.

(CVOs). Estruturas cerebrais da linha média com vasculatura permeável, permitindo a troca imediata de moléculas entre os neurônios e o sangue.

Imitação sintética do RNA de fita dupla que mimetiza o efeito da infecção viral no sistema imunológico.