Em formação

Triagem de mutagênese saturada


Espero fazer uma mutação no sítio ativo da enzima que estou pesquisando, que tem 5 resíduos nas proximidades do substrato. Estou me perguntando quantas colônias terei que avaliar para amostrar teoricamente todas as combinações possíveis de mutantes?

Estou supondo que apenas rastrear o número de combinações possíveis não terá muito sucesso porque é provável que eu experimente um mutante específico mais de uma vez.

Eu estive olhando para 'NNK Saturated Mutagenesis' que usa a redundância no código genético para ser capaz de criar todas as codificações de resíduos onde N = A / G / C / T e K = G / T, enquanto limita o número de resíduos repetidos de códons sinônimos.

Existem outras maneiras de realizar esse tipo de mutagênese com melhor compressão de códons?


Esse tipo de método é realmente muito útil e freqüentemente usado em biologia sintética: Eu usei uma abordagem semelhante antes para gerar isoladores de 5 'para promotores.

Calcular a probabilidade teórica exata do que você quer, até onde eu entendo, é uma equação combinatória complexa que não consegui obter de uma forma bem fechada com alguns minutos de trabalho. Para seus propósitos, no entanto, espero que uma estimativa razoável funcione também, e isso pode ser feito muito mais facilmente modelando a população de cada combinação como uma série independente de lançamentos de moeda tendenciosa, ou seja, uma distribuição binomial.

Considere uma situação com $ n $ combinações potenciais que você tenta cobrir com $ k $ mutantes aleatórios. Se nos concentrarmos em uma combinação particular, podemos ver que cada mutante aleatório tem um $ frac {1} {n} $ chance de acertar essa combinação. Todo o conjunto de mutantes é, portanto, uma série de $ k $ cara ou coroa tendenciosa, com uma probabilidade $ p_0 = (1- frac {1} {n}) ^ k $ de não obter mutantes que atinjam essa combinação. Isso significa que a probabilidade $ p_c $ que a combinação é coberta é $ p_c = 1-p_0 $, expandindo para: $$ p_c = 1- (1- frac {1} {n}) ^ k $$

Com um grande número de combinações potenciais e um grande número de mutantes, podemos fazer uma estimativa razoável tratando cada combinação como independente. Neste caso, a probabilidade de que tudo as combinações são cobertas é o produto das probabilidades de que cada combinação seja coberta de forma independente. Eles não são realmente independentes: cada combinação que é coberta diminui ligeiramente a capacidade de outras combinações serem cobertas. Uma estimativa usando uma suposição de independência é, portanto, uma superestimativa da probabilidade real, e quanto maior isso $ k $ é o mais próximo que a estimativa deve estar da probabilidade exata. Resumidamente: $$ p_ {all} <(1- (1- frac {1} {n}) ^ k) ^ n $$

Isso cheira como o tipo de equação para a qual deveria haver uma boa identidade, mas não sei a identidade, então darei apenas alguns exemplos de cálculos com ela:

  • NNK = 32 combinações, 50 mutantes (n = 32, k = 50): $ p_ {all} $ < 0.07%
  • NNK = 32 combinações, 100 mutantes (n = 32, k = 100): $ p_ {all} $ < 25.5%
  • NNK = 32 combinações, 200 mutantes (n = 32, k = 200): $ p_ {all} $ < 94.6%

Como você pode ver, há uma transição abrupta à medida que a contagem de cobertura aumenta.

Advertência importante: o valor teórico pode não lhe dar o que você deseja. No artigo I vinculado acima, usamos dois primers degenerados com 18 N bases para injetar 36bp de material aleatório, o que significa que tínhamos $ 4,7 x 10 ^ {21} $ combinações possíveis e nunca deveria haver uma repetição - exceto que o sequenciamento mostrou que de fato obtivemos várias repetições de apenas algumas centenas de colônias. Assim, vieses na biologia podem fazer com que suas estatísticas sejam distorcidas do que a teoria sugere.


CyberDope foi escrito primeiro no MIT, depois novamente no Kairos, e novamente por mim (em particular) no Mathematica. O programa fornece as melhores "drogas" para um conjunto-alvo de aminoácidos. Você precisará de alguém que tenha o Mathematica para visualizar este programa no formato ".nb" e executá-lo. Eu sugeriria ainda que eles atualizassem o programa para a versão 12. do Mathematica. Acabei de fazer o upload de uma cópia para a nuvem Wolfram (pública):

CyberDope

A publicação original é:

Arkin e Youvan

Vinte anos atrás, o trabalho estava nesta fase:

https://www.researchgate.net/publication/228715857_Directed_evolution_and_solid_phase_enzyme_screening

Se você quer apenas "espreitar" uma boa droga, olhe para esta figura, circule os resíduos de aminoácidos que deseja e, em seguida, olhe para os três eixos de nucleotídeos:

(Isso é do artigo do Código Genético da Wikipedia)


O OP também lida com a complexidade combinatória. Então, eles podem querer olhar para esta figura se eles estão mutagenizando na segunda posição do códon. Novamente, da Wikipedia (Código Genético)


Engenharia de enzimas: uma abordagem de biologia sintética para geração de biblioteca mais eficaz e triagem automatizada de alto rendimento

Affiliations Département de Chimie, Université de Montréal, Montréal, QC, Canadá, Centre for Green Chemistry and Catalysis (CGCC), Université de Montréal, Montréal, QC, Canadá, PROTEO, The Québec Network for Research on Protein Function, Engineering and Applications, Québec, QC, Canadá

Affiliations Centre for Green Chemistry and Catalysis (CGCC), Université de Montréal, Montréal, QC, Canadá, PROTEO, The Québec Network for Research on Protein Function, Engineering and Applications, Québec, QC, Canada, Département de Biochimie, Université de Montréal, Montreal, QC, Canadá

Affiliation DSM Nutritional Products, 101 Research Drive, Dartmouth, NS, Canadá

Affiliations Département de Chimie, Université de Montréal, Montréal, QC, Canadá, Centre for Green Chemistry and Catalysis (CGCC), Université de Montréal, Montréal, QC, Canadá, PROTEO, The Québec Network for Research on Protein Function, Engineering and Applications, Québec, QC, Canadá, Département de Biochimie, Université de Montréal, Montreal, QC, Canadá


Resumo

Uma população mutante abrangente é um recurso básico para explorar a função do gene. Desenvolvemos uma 'biblioteca de mutação' de tomate isogênico no fundo genético da variedade consanguínea M82. Um total de 13 000 milhões2 famílias, derivadas de EMS (etil metanossulfonato) e mutagênese de nêutrons rápidos, foram visualmente fenotipadas no campo e categorizadas em um catálogo morfológico que inclui 15 categorias primárias e 48 secundárias. Atualmente, 3417 mutações foram catalogadas entre elas são a maioria dos fenótipos previamente descritos da coleção de mutantes monogênicos do The Tomato Genetics Resource Center, e mais de mil novos mutantes, com vários alelos por locus. O banco de dados fenotípico indica que a maioria das mutações se enquadra em mais de uma categoria (pleiotrópica), com alguns órgãos, como folhas, mais sujeitos a alterações do que outros. Todos os dados e imagens podem ser pesquisados ​​e acessados ​​na Solanaceae Genome Network (SGN) em um site chamado ‘The Genes That Make Tomatoes’ (http://zamir.sgn.cornell.edu/mutants/).


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3. Mutagênese de alvo selecionado

A mutagênese selecionada no alvo é usada para identificar mutações em um gene específico de um genoma mutagenizado aleatoriamente. A abordagem envolve mutagênese padrão usando EMS ou UV / TMP, por exemplo, seguido de triagem usando a reação em cadeia da polimerase (PCR) ou outro método para identificar animais portadores de lesões no gene de interesse.

Dois consórcios da comunidade, o C. elegans Consórcio Knockout (celeganskoconsortium.omrf.org), e o C. elegans O National Bioresource Project of Japan (NBRP, http://www.shigen.nig.ac.jp/c.elegans/mutants/index.jsp) está atualmente usando mutagênese selecionada para identificar alelos mutantes para cada gene no C. elegans genoma C. elegans Deletion Mutant Consortium, 2012). Juntos, mais de 6.700 deleção ou alelos nulos foram isolados por esses grupos e estão disponíveis para a comunidade científica ( C. elegans Deletion Mutant Consortium, 2012). Cepas de C. elegans Consórcio Knockout estão disponíveis no Caenorhabditis Genetics Center (CGC, http://www.cbs.umn.edu/research/resources/cgc) sob a designação de alelo OK ou gk. Cepas geradas pelo NBRP, com designação de alelo tm , estão disponíveis após a apresentação de um Contrato de Transferência de Materiais (Mitani, 2009). As cepas de exclusão estão listadas no Wormbase, que deve ser consultado primeiro para determinar se um alelo já está disponível para um gene de interesse. Caso contrário, pode-se solicitar uma cepa de exclusão do Consórcio. Ao receber uma cepa, ela deve ser cruzada para remover mutações irrelevantes. É sempre importante verificar a presença da mutação em uma cepa. Além disso, mutações de deleção obtidas por seleção de alvo podem ser acompanhadas por duplicações proximais, resultando em heterozigosidade obrigatória para o gene em consideração. Nessas situações, a avaliação fenotípica da cepa mutante pode não revelar os defeitos associados à perda completa do gene. Para confirmar que um gene de interesse é responsável por um defeito observado, experimentos de resgate de transgênicos devem ser realizados e / ou múltiplos alelos examinados ( C. elegans Deletion Mutant Consortium, 2012). Além da coleção de deleções, o Projeto Million Mutations (http://genome.sfu.ca/mmp/) identificou mais de 800.000 polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e mais de 16.000 indels em mais de 20.000 genes ( C. elegans Deletion Mutant Consortium, 2012 Thompson et al., 2013). Embora alguns desses SNPs não afetem a função do gene, muitos podem fornecer dados de função de estrutura úteis.

3.1. Mutagênese alvo-selecionado usando PCR

O objetivo da mutagênese de alvo selecionado é gerar uma biblioteca contendo pools de animais mutagenizados que podem ser rastreados para lesões de DNA específicas. Alelos de deleção são mais fáceis de identificar usando PCR do que mutações pontuais, então UV / TMP e EMS são os mutagênicos preferidos (Lesa, 2006). Para a construção da biblioteca, 600.000 hermafroditas são mutagenizados aleatoriamente. Uma vez que os animais mutagenizados se tornam grávidos, eles são branqueados e L1s podem eclodir em M9, durante a noite. Os L1s são então subdivididos em 1.152 subculturas (placas NGM de 55 mm) de 500 animais cada. Após duas gerações de autofecundação, 20% dos animais por placa são enxaguados para isolamento de DNA genômico em doze placas de 96 poços (Lesa, 2006). Os animais restantes são armazenados a 15 & degC por até seis semanas. Embora as bibliotecas possam ser congeladas, as bibliotecas de animais vivos são menos propensas a falhas na recuperação de mutantes (Lesa, 2006).

Três abordagens são comumente usadas para pesquisar deleções em um gene de interesse: condições restritas de PCR, iniciadores de veneno e enzimas de restrição termoestáveis. Cada abordagem emprega primers de PCR aninhados projetados para flanquear a sequência genômica de interesse para aumentar a especificidade, e cada método favorece a amplificação de produtos de deleção sobre produtos de tipo selvagem maiores (Edgley et al., 2002 Jansen et al., 1997 Wei et al., 2002 Zwaal et al., 1993). Todos esses métodos são propensos a altas taxas de falsos positivos (50% -90%), portanto, cada amostra combinada deve ser rastreada em duplicata (Jansen et al., 1997). Um protocolo abrangente para a criação de biblioteca e a técnica de PCR de primer de veneno está disponível no capítulo Genética reversa no WormBook.

3.1.1. Tempo de extensão de PCR restrito (Jansen et al., 1997)

Cada pool da biblioteca é incubado primeiro com um par de iniciadores (10 pmol por iniciador) projetado 2,5-3,5 kb de distância sobre uma região de interesse, seguido pela incubação de uma diluição de 1: 500 do primeiro PCR com um par de iniciadores aninhados (Liu et al ., 1999). Após a adição de polimerase, nucleotídeos e tampão, as amostras são submetidas a ciclos com tempos de extensão curtos (45 s a 1 min) para favorecer o acúmulo do produto de deleção (Jansen et al., 1997). As DNA polimerases apresentam taxas de turnover específicas (número máximo de nucleotídeos polimerizados em um determinado período de tempo), que variam dependendo do tipo de Taq utilizado (Kornberg e Baker, 1992). Por exemplo, se o produto de tipo selvagem (WT) é de 2 kb, o produto de deleção é de 500 bp e a Taq polimerase tem uma taxa de renovação de 1 kb / min, aproximadamente dois min serão necessários para completar a reação de WT e 30 seg para o produto de exclusão. Se o tempo de extensão for limitado a 45 s, apenas o produto de exclusão será amplificado. Ao longo de muitas rodadas, algum produto WT é amplificado, mas a uma taxa muito mais lenta do que a exclusão. Isso aumenta muito as chances de detectar o alelo de deleção menos abundante. As deleções detectadas são variáveis ​​em extensão e média em torno de 1,4 kb em tamanho (Liu et al., 1999). As reações concluídas são executadas em um gel de agarose e os pools que têm um produto menor do que o produto de tipo selvagem são identificados. Os animais da biblioteca deste pool são semeados individualmente ou em pools menores e retestados para identificar hermafroditas individuais carregando a lesão relevante (Jansen et al., 1997).

3.1.2. Método de iniciação de veneno (Edgley et al., 2002)

Esta abordagem foi desenvolvida para enriquecer as deleções com tamanho inferior a 500 bp (Edgley et al., 2002). O protocolo é semelhante ao do método de extensão de tempo de PCR restrito, exceto que um terceiro primer é adicionado entre os primers externos do primeiro PCR (Figura 3). Este iniciador de veneno é projetado para amplificar apenas fora do DNA genômico de tipo selvagem, competindo com o produto de tipo selvagem de comprimento total, reduzindo assim a quantidade de modelo de tipo selvagem disponível para a segunda PCR. O segundo conjunto de primers aninhados só é capaz de ligar o produto deletado e o produto de tipo selvagem de comprimento total, cuja concentração total é reduzida à metade por causa do produto primer venenoso. Isso leva a um aumento de 500 vezes na sensibilidade, aumentando a proporção de deleção para produtos de tipo selvagem. O uso de um tempo de extensão curto (45 s) também facilita a síntese do produto de exclusão. Como o primer de veneno determina a localização dos produtos de deleção amplificados, geralmente é melhor direcionar a extremidade 5 & # 8217 de um gene para gerar alelos nulos (Edgley et al., 2002).

Figura 3. Método do iniciador de veneno para detecção de deleções. Esta técnica enriquece o DNA raro deletado sobre o produto mais abundante, de comprimento total e tipo selvagem. Os iniciadores a, b e p são usados ​​no primeiro PCR para gerar um modelo de tipo selvagem, um modelo mutante e um modelo & # 8216poison & # 8217. No segundo PCR, esses produtos são usados ​​como modelo com os iniciadores a & # 8217 e b & # 8217 para aumentar o sinal do produto excluído. Sem o primer de veneno, o produto de comprimento total domina a reação de PCR e o produto de exclusão está abaixo do limite de detecção. Quando o primer de veneno é incluído, a amplificação de comprimento total total é diminuída e o produto de exclusão é revelado.

3.1.3. Enzimas de restrição termoestáveis ​​(Huang et al., 2006 Wei et al., 2002)

Neste método menos comumente usado, sequências em um gene alvo são identificadas que têm um local de reconhecimento de enzima de restrição termoestável no intervalo medido pelos pares de primers (Wei et al., 2002). Essas enzimas são estáveis ​​em altas temperaturas, tornando-as ideais para uso com PCR. O DNA genômico agrupado é digerido por 2 h antes da PCR para clivar o DNA genômico e reduzir a quantidade de modelo de tipo selvagem disponível. As enzimas também são incluídas durante as amplificações de PCR para clivar continuamente qualquer produto de tipo selvagem. Dois conjuntos de primers aninhados são usados. As sequências de deleção direcionadas não possuem o local da enzima de restrição e não são clivadas, aumentando assim a sensibilidade da reação (Wei et al., 2002). Deleções variando de 330 bp a 1,7 kb foram encontradas usando este método (Huang et al., 2006 Wei et al., 2002). As enzimas de restrição termoestáveis ​​validadas incluem Psp GI, Tli EU, Bst UI, Macaco KI, e Tsp 45I (Huang et al., 2006 Wei et al., 2002).

3.2. TILLING

TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) permite a identificação de mutações pontuais e pequenos indels em um gene de interesse (McCallum et al., 2000). Originalmente desenvolvido em Arabidopsis thaliana , TILLING usa uma nuclease de DNA de fita simples para determinar a localização de incompatibilidades após a hibridização de um genoma mutado com um genoma não mutado (Colbert et al., 2001 Till et al., 2003). Embora este método tenha sido usado apenas uma vez para isolar mutações pontuais em um gene de interesse em C. elegans , tem sido mais usado em outros organismos. Mutações em uma população de C. elegans são gerados usando EMS ou ENU (Gilchrist et al., 2006). A PCR direcionada a um gene de interesse é realizada em DNA genômico derivado de muitos pools de animais (Figura 4). Os primers são marcados com diferentes fluoróforos, marcando as extremidades 5 & # 8217 e 3 & # 8217 do produto com cores diferentes. Após a PCR, o DNA de cada reação é desnaturado. Reannealing então permite a formação de heteroduplex entre o DNA de tipo selvagem e mutante. O DNA reencontrado é incubado com uma nuclease de DNA de fita simples, CEL1, derivada do extrato de suco de aipo (CJE) (Till et al., 2004). CJE corta DNA heteroduplex onde uma incompatibilidade ou indel cria uma protuberância de fita simples. As amostras são executadas em géis LI-COR desnaturantes e os géis são examinados em ambos os canais fluorescentes para determinar em qual pool ocorre uma incompatibilidade (Gilchrist et al., 2006). Em uma triagem para dez genes (variando de 788 bp a 9,1 kb de tamanho), 71 mutações foram identificadas. Destes, 59% constituíam alelos missense e 3% eram alelos sem sentido (Gilchrist et al., 2006).

Figura 4. TILLING permite a identificação de mutações pontuais em pools de DNA mutado. Tanto o DNA mutado quanto o DNA de tipo selvagem são submetidos a PCR, usando iniciadores 5 & # 8217 e 3 & # 8217 marcados diferencialmente (aqui em verde e vermelho). Os produtos de PCR são desnaturados e recozidos lentamente, de modo que o DNA heteroduplex se forma entre uma fita de DNA mutada e uma fita de DNA de tipo selvagem. Os produtos de PCR recriados são tratados com Cel1, uma enzima que cliva especificamente o DNA heteroduplex. A reação é visualizada em um gel LI-COR em dois canais de fluorescência. Quando o DNA heteroduplex é cortado, fragmentos de DNA menores são vistos nos canais verde e vermelho dentro da mesma pista. O produto de comprimento total e sem cortes ficará proeminente na parte superior do gel.

Animais F1 mutagenizados individuais são semeados individualmente em 1500 placas NGM semeadas. Depois que o suprimento de comida é gasto, metade dos animais são congelados a & # 872280 & degC. A outra metade é usada para gerar DNA genômico individualmente em placas de 96 poços. Para reduzir o número de reações de PCR, oito amostras de DNA F1 são agrupadas para análise. Uma vez que um pool positivo tenha sido identificado, as amostras genômicas de DNA são testadas individualmente para determinar de qual placa a amostra surgiu originalmente. Os primers de PCR são projetados em uma área de 1,5 kb, abrangendo principalmente regiões exônicas. Os primers podem ser projetados usando o programa CODDLE para selecionar regiões com alto teor de G / C, que são mais propensas a mutação por EMS (Gilchrist et al., 2006).

3.3. Mutagênese de deleção induzida por DNA G4

A sequência consenso G3+N1-7G3+N1-7G3+ N1-7G3+ dobras em vitro para formar uma estrutura quádrupla guanina (G4) que pode bloquear a replicação na Vivo (Kruisselbrink et al., 2008). A proteína FANCJ (DOG-1 em C. elegans ) é uma helicase de DNA necessária para a replicação adequada de tais tratos ricos em guanina (Kruisselbrink et al., 2008). No cão-1 mutantes, esses tratos são propensos a deleções 5 & # 8217. Existem mais de 2.900 locais quádruplos de guanina no C. elegans genoma, anotado em Wormbase sob & # 8220G4 Motif & # 8221 em GBrowse, e mais de 1.600 genes estão localizados 5 & # 8217 de um local G4 (Pontier et al., 2009). De dez genes testados em um estudo, 11 alelos de deleção foram gerados, a maioria dos quais foram até vários quilobases a montante do local G4 alvo (Pontier et al., 2009). Este método foi usado uma vez para gerar alelos de deleção (Pontier et al., 2009).

dog-1 (pk2247) mutantes são colhidos em placas NGM individuais e deixados crescer até que nenhum OP50 permaneça na placa (Pontier et al., 2009). Metade dos animais em cada placa são enxaguados com M9 para isolamento de DNA genômico. Antes do isolamento do DNA, os animais são divididos em dois grupos. Se uma deleção estiver presente em apenas uma das amostras, provavelmente é decorrente de um evento somático. No entanto, se uma deleção for detectada em ambas as amostras, é mais provável que seja uma mutação hereditária (Pontier et al., 2009). As deleções são rastreadas usando qualquer um dos protocolos de PCR descritos acima. Após o isolamento, a cepa é cruzada com animais de tipo selvagem para remover o cão-1 mutação e quaisquer deleções fora do alvo.


Resumo

As sondas de mutagênese de saturação definem seções do vasto espaço de sequência de proteínas. No entanto, mesmo que a randomização seja limitada dessa forma, o problema dos números combinatórios é grave. Como a diversidade é criada no nível do códon, a redundância do códon é um fator crucial que determina o esforço necessário para a triagem da biblioteca. Além disso, devido à natureza probabilística do processo de amostragem, a sobreamostragem é necessária para garantir a integridade da biblioteca, bem como uma alta probabilidade de encontrar todas as variantes exclusivas. Nosso truque emprega uma mistura especial de três primers, criando uma degenerescência de 22 códons exclusivos que codificam os 20 aminoácidos canônicos. Portanto, a redundância do códon e o esforço de triagem subsequente são significativamente reduzidos, e uma distribuição equilibrada do códon por aminoácido é alcançada, como demonstrado exemplarmente para uma biblioteca de monooxigenase de ciclohexanona. Mostramos que esta estratégia é adequada para qualquer metodologia de mutagênese de saturação para gerar bibliotecas menos redundantes.


Materiais e métodos

Plasmídeos e análise de DNA

O plasmídeo do vetor lentiviral pSIN-EGFP contendo um EGFP gene, IRES e Puromicina O gene foi gerado a partir de pSIN-EF2-Lin28-Puro (plasmídeo Addgene # 16580) usando locais de enzima de restrição EcoRI e BamHI. O plasmídeo SaCas9 foi um presente de Feng Zhang (plasmídeo Addgene # 61591) O plasmídeo de expressão VPR (GP230) e o plasmídeo repórter mCherry (ZP30) foram doações do Dr. Yang, Hui (Shanghai Institutes for Biological Sciences, CAS). Os plasmídeos CRISPR-Cas9 foram construídos conforme descrito online (http://www.genome-engineering.org/crispr/). As sequências de oligonucleotídeos para a construção de sgRNA estão resumidas na Tabela S2. O DNA de plasmídeo e o DNA genômico foram isolados por técnicas padrão. A sequenciação de DNA confirmou a sequência específica desejada nas construções.

Células e cultura celular

As células HEK-293 foram obtidas da ATCC (CAT # CRL-1573) e cultivadas a 37 ° C em 5% de CO2 em Dulbecco’s Modified Eagle Medium (Life Technologies, Carlsbad, CA), 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor, penicilina / estreptomicina. Expressando células HEK-293 EGFP foram descritos anteriormente [29]. Colônias únicas resistentes a drogas de células HEK-293 transduzidas foram isoladas e denominadas 293-SC1. Para manter a expressão de EGFP, o meio para a cultura 293-SC1 inclui puromicina.

Construção da biblioteca SaCas9

A biblioteca foi gerada por PCR sujeito a erros (sequência de iniciadores na Tabela S1). Especificamente, o plasmídeo (pX601) contendo a sequência de codificação de SaCas9 foi digerido com AgeI / HindIII ou HindIII / BamHI, respectivamente. Os fragmentos AgeI / HindIII ou HindIII / BamHI foram mutados pelo kit de mutagênese aleatória (CAT # 101005, TIANDZ) e depois purificados, em fusão com o esqueleto pX601 linearizado sem o fragmento correspondente. As colônias individuais da placa LB foram então colhidas manualmente. Os plasmídeos de colônias individuais foram isolados. A concentração de cada plasmídeo foi ajustada para 100 ng / μL.

Sequenciamento profundo direcionado

Locais fora do alvo (Tabela S1) foram previstos pelo software Cas-OFFinder [40], e locais fora do alvo com menos de 5 nucleotídeos incompatíveis foram selecionados. Além disso, os sites fora do alvo de OT1 e OT2 para EMX1_1 foram relatados [5]. Sites fora do alvo para chr2: 156.968.467–156.968.493, DLGAP2, e DUS2 foram selecionados por algoritmo para menos de 2 nucleotídeos incompatíveis em todo o genoma. Os experimentos de sequenciamento profundo direcionados foram realizados com WT SaCas9 e Mut268 para diferentes loci no genoma humano. Resumidamente, 1,8 x 10 5 células HEK-293 foram transfectadas com 750 ng de plasmídeos de expressão all-in-one. Setenta e duas horas após a transfecção, o DNA genômico foi extraído usando protocolos de extração de fenol / clorofórmio padrão. Para a construção da biblioteca NGS, a PCR primária foi realizada para amplificar 100 a 230 pb locais on / off-target de aproximadamente 60 ng de DNA genômico usando Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase (Vazyme Biotech Co., Ltd). A amplificação secundária foi para fixar códigos de barras, índice e sequências de adaptador nos produtos de PCR primários (Tabela S2). Os produtos de amplificação foram purificados (Thermo Fisher Scientific) e agrupados em um tubo. Após a remoção dos adaptadores e das leituras de baixa qualidade, as leituras emparelhadas foram mescladas e mapeadas para o modelo. Substituição de base e in / del foram analisados ​​usando o software “CRISPResso” de código aberto (versão 1.0.10) com qualidade de leitura acima de Q30 [41].

PEM-seq para SaCas9

O protocolo foi descrito anteriormente [42]. Especificamente, 3,2 μg de plasmídeos pX601 foram transfectados em células HEK-293 em placas de 6 cm. As células foram colhidas 48 horas após a transfecção, seguido pelo procedimento PEM-seq padrão. As leituras Hiseq foram processadas pelo pipeline “SuperQ” e os pontos de acesso fora do alvo foram identificados por “MACS2” callpeaks modo. Os resultados do MACS2 foram filtrados para remover locais com menos de 2 junções e nenhuma sequência semelhante ao local de destino por "Ferramentas de cama" e "Agulha".

Ensaio T7EI para edição de genes

Resumidamente, 293-SC1 foram semeados a uma densidade de 1,8 × 10 5 células por poço em uma placa de 12 poços no dia 0 e transfectados com 750 ng de plasmídeos CRISPR-SaCas9-sgRNA com Turbofect no dia 1. Meio fresco foi adicionado ao células 293-SC1 transfectadas no dia 2. As células foram colhidas no dia 3. Para o ensaio T7EI, 150 ng de produtos de PCR purificados foram misturados com 1,5 μL de tampão 10 × NEB # 2 e água ultrapura para um volume final de 14,5 μL e foram submetidos a processo de recozimento para permitir a formação de heteroduplex. Após o recozimento, os produtos foram tratados com 0,5 μL de Endonuclease I de T7 por 45 min.

Ensaio de ativação transcricional

O ensaio ChIP-seq foi realizado conforme descrito anteriormente [7]. Para o ensaio repórter de fluorescência, 1,0 x 10 5 células HEK-293 de cada poço (placas de 24 poços) foram semeadas no dia 0. No dia 1, cada poço de foi transfectado com 375 ng de plasmídeo dCas9-VPR, 150 ng de plasmídeo contendo sgRNA e 250 ng de plasmídeo miniCMV-mCherry. Meio fresco foi adicionado às células transfectadas no dia 2. As células foram colhidas para FCM no dia 3.

Western blotting

As células HEK-293 foram semeadas a uma densidade de 5,0 × 10 5 células por poço em uma placa de 6 poços no dia 0 e transfectadas com 1,5 μg de plasmídeos (pX601, Mut268 e efSaCas9) via reagente de transfecção TurboFect no dia 1. Meio fresco foi adicionado após 12 h. As células foram colhidas no dia 3. As proteínas foram analisadas em SDS-PAGE após a quantificação. As membranas foram manchadas com anticorpos direcionados às seguintes proteínas: HA (Mouse-1F5C6, Proteintech Cat # 66006-2-Ig, diluição 1: 2.500) e β-Actina (Mouse-8H10D10, Cell Signaling Technology Cat # 3700, 1: 1.000 ) Um anticorpo secundário conjugado com HRP (Cabra, Abcam Cat # ab97023, 1: 5.000) foi usado para detecção quimioluminescente.


A American Heart Association recomenda buscar um padrão alimentar que alcance de 5% a 6% das calorias da gordura saturada.

Por exemplo, se você precisa de cerca de 2.000 calorias por dia, não mais do que 120 delas devem vir da gordura saturada.

Isso significa cerca de 13 gramas de gordura saturada por dia.

O que são gorduras saturadas?

Do ponto de vista químico, as gorduras saturadas são simplesmente moléculas de gordura que não têm ligações duplas entre as moléculas de carbono porque estão saturadas com moléculas de hidrogênio. As gorduras saturadas são normalmente sólidas à temperatura ambiente.

Como as gorduras saturadas afetam minha saúde?

Substituir alimentos com alto teor de gordura saturada por opções mais saudáveis ​​pode reduzir os níveis de colesterol no sangue e melhorar o perfil lipídico

Quais alimentos contêm gordura saturada?

As gorduras saturadas ocorrem naturalmente em muitos alimentos. A maioria vem principalmente de fontes animais, incluindo carne e laticínios.

Exemplos de alimentos com gordura saturada são:

  • carne gorda,
  • Cordeiro,
  • carne de porco,
  • aves com pele,
  • gordura da carne (sebo),
  • banha e creme,
  • butter,
  • cheese and
  • other dairy products made from whole or reduced-fat (2 percent) milk.

In addition, many baked goods and fried foods can contain high levels of saturated fats. Some plant-based oils, such as palm oil, palm kernel oil and coconut oil, also contain primarily saturated fats, but do not contain cholesterol.

What are alternatives to replace saturated fats in the foods I eat?

Choose lean meats and poultry without skin and prepare them without added saturated and trans gordura.

You should replace foods high in saturated fats with foods high in monounsaturated and/or polyunsaturate fats. This means eating foods made with liquid vegetable oil but not tropical oils. It also means eating fish and nuts. You also might try to replace some of the meat you eat with beans or legumes.

There&rsquos a lot of conflicting information about saturated fats. Should I eat them or not?

The American Heart Association recommends limiting saturated fats &ndash which are found in butter, cheese, red meat and other animal-based foods. Decades of sound science has proven it can raise your &ldquobad&rdquo cholesterol and put you at higher risk for heart disease.

The more important thing to remember is the overall dietary picture. Saturated fats are just one piece of the puzzle. In general, you can&rsquot go wrong eating more fruits, vegetables, whole grains and fewer calories.

When you hear about the latest &ldquodiet of the day&rdquo or a new or odd-sounding theory about food, consider the source. The American Heart Association makes dietary recommendations only after carefully considering the latest scientific evidence.

Written by American Heart Association editorial staff and reviewed by science and medicine advisers. See our editorial policies and staff.


Resultados

Measuring suppression by standing variation

We set out to test mutation effects in segregant progeny from diverse yeast isolates from various geographic locations and sources (“wild yeasts”) (Liti et al, 2009 Bergström et al, 2014 ). To do so, we used the Synthetic Genetic Array approach (Tong et al, 2001 ) to cross a collection of 1,106 temperature-sensitive alleles (“TS alleles”) of 580 essential query genes in the laboratory strain S288C (Costanzo et al, 2016 ) to 10 stable haploid wild yeasts (Fig 1A) (Cubillos et al, 2009 ), as well as into the S288C control as a reference. We isolated pools of

60,000 segregant progeny carrying the TS allele to obtain populations of haploid individuals with genomes that, except for the genomic regions around the TS allele and selection markers, are a mosaic of the reference and wild parents (Fig 1B, Methods). We grew the segregant pools at permissive (26°C) and restrictive (34°C) temperatures and measured their fitness. In the control cross with S288C, no segregants are expected to grow at the restrictive temperature due to temperature sensitivity of the TS allele. However, in cases where the wild yeast strain harbours variants that can suppress the TS phenotype, the haploid segregants that carry them will be able to grow at the restrictive temperature and will take over the population (Fig 1B).

Figure 1. Experimental overview

  1. Strains used in the study. Seven wine / European strains, and three other distant ones (all blue) were crossed to the S288C reference (yellow).
  2. Strategy for identifying suppression by standing variation. A temperature sensitive (TS) allele collection of

1,100 partial loss-of-function mutants in the reference background (yellow) was crossed to the 10 wild yeast strains with potential suppressor alleles (blue), to produce large segregant populations selected to carry the TS allele. Each cross was performed in one or two biological and four technical replicates. The fitness of the resulting

Data information: Panel (A) adapted from Liti et al ( 2009 ).

We first measured the growth defect of each TS allele in complex pools of wild yeast strain cross progeny (Dataset EV1, Appendix Fig S1). We estimated suppression as normalised log2-scale growth difference between the wild and reference strain crosses at the restrictive temperature and considered a TS allele phenotype suppressed, if this value was above 0.75, i.e. the wild strain segregants had a 1.68-fold improvement in growth, and if this was unlikely due to chance (Bonferroni-corrected P = 0.04, Methods, Dataset EV2).

Our screen included several positive control crosses that were expected to show suppression. Three of the wild strains harbour a chrVIII-chrXVI reciprocal translocation (Pérez-Ortín et al, 2002 Fig EV1A). Crossing these strains to the reference strain results in 25% of the progeny carrying a duplication of a substantial part of the left arm of chromosome XVI (Fig EV1B). This creates an extra copy of the essential query genes in this region that complements the TS allele. Reassuringly, we confirmed that this extra copy suppressed 35 out of 53 TS alleles in the duplicated region on average, while segregant progeny from the other wild strains suppressed a median of two (Fig 2A). Further, the extra copy of chromosome VIII carried by the NCYC110 strain resulted in a similar pattern of suppression (Fig EV2A–C).

Figure EV1. Suppression by a translocation between chrVIII and chrXVI

  • A. Three of the strains used in our screens carried a translocation between the promoter regions of ECM34, located at the left arm of chrVIII, and SSU1, located at the left arm of chrXVI (Pérez-Ortín et al,2002 ).
  • B. Crossing S228C to one of the strains carrying the translocation will result in 25% spore lethality, due to the absence of a large part of the left arm of chrXVI, which is essential for viability. Of the viable spores, one third will carry the S288C chromosome arrangement, one third will carry the arrangement of the translocated strain, and one third will carry the S288C version of chrXVI, combined with the rearranged chromosome that carries the chrVIII centromere. This last combination of chromosomes will lead to the presence of two copies of a large part of the left arm of chrXVI.
  • C, D. A second copy of part of the left arm of chrXVI can suppress the TS phenotype of TS alleles located on this part of chrXVI. FAS2 (YPL231W) e DIM1 (YPL266W) are located on the translocated left arm of chrXVI. (C) Population sequencing read depth of haploid progeny carrying a fas2-ts allele, isolated from a cross between a S228C fas2-ts mutant and a DBVPG1373 wild-type strain, at either 26 or 34°C. Part of the left arm of chrXVI is present at increased copy number in the population at 26°C, due to the lethality of spores lacking the chromosome arm. At 34°C, selection occurs for cells carrying two copies of this chromosomal fragment, because in addition to carrying the TS allele, they will also carry a wild-type copy of FAS2 that is inherited from DBVPG1373. (D) Tetrad dissection of a cross between a S288C dim1-ts mutant and a YJM978 wild-type strain. Cells carrying both a dim1-ts e um DIM1 wild-type allele have increased fitness compared to mutants carrying only a dim1-ts alelo.

Figure 2. The extent of genetic suppression of essential gene mutants by standing variation

  1. A positive control region shows suppression signal. Average suppression score (y-axis) for TS alleles of query genes located on the left arm of chromosome XVI (TS allele index, sorted by chromosome coordinates, x-axis) across strains with a translocation that generates a duplication of the shaded area (blue markers), and strains without the translocation (grey markers). Dashed line: y = 0.75 (suppression cut-off in screen).
  2. Genotype and phenotype trees are concordant. Top: Hierarchical clustering (UPGMA) of the ten wild strains used in this study based on sharing segregating sites. Colours: global genetic cluster membership. Bottom: as top, but based on correlation distance between genetic suppression profiles. Strain abbreviations as in Fig 1A, with in addition: NC = NCYC110, UW = UWOPS87-2421, and 27 = 273614N.
  3. About a third of suppressed alleles can be explained by a deficiency in the reference strain that is not present in the majority of wild strains. The frequency (y-axis) of the number of wild strains that suppress a TS allele (x-axis) for the 187 alleles that could be suppressed by at least one strain, using a more lenient criterion (suppression > 0.5 no z-score cut-off) to avoid edge effects and winner’s curse.
  4. Genetic suppression is consistent across different TS alleles of the same gene. Suppression score (colour scale) in crosses to different wild strains (x-axis) for TS alleles (y-axis) of GAB1 e NSE4 genes.
  5. Genetic suppression is consistent across genes encoding members of the same complex. Strongest suppression score across TS alleles for a gene (colour scale, as in (D)) in crosses to different wild strains (x-axis) for genes (y-axis) that encode members of the GPI-anchor trans-amidase complex (bottom) or the nuclear condensin complex (top). o GPI16 gene suppression was not estimated in the NCYC110 strain due to chromosome II copy-number variation (“X”).

Figure EV2. Aneuploidies and suppression validation

  • A, B. The NCYC110 strain that was used in our screen carried aneuploidies of chromosomes II and VIII. Chromosome VIII is highlighted as an example. Crossing S228C to NCYC110 will result in 50% of the progeny carrying one copy of chrVIII, and 50% of the progeny carrying two copies of chrVIII. Of the progeny carrying one copy of chrVIII, one third will carry the S288C chromosome and two thirds the NCYC110 chromosome. Of the progeny carrying two copies of chrVIII, one third will carry two NCYC110 chromosomes, and two thirds will carry one S288C and one NCYC110 version of chrVIII. We note that recombination can occur between the S288C and NCYC110 chromosomes.
  • C, D. A second copy of a chromosome can suppress the TS phenotype of TS alleles located on this chromosome. (C) For each TS allele located on chrVIII, the suppression scores are plotted for haploid progeny of a cross to NCYC110 (blue) or other wild isolates (grey). (D) Shown are the relative sequencing read depth per chromosome of populations of haploid progeny isolated from a cross of NCYC110 to TS alleles located on either chrII (yellow) or chrVIII (blue). Cells carrying a TS allele on chrVIII have substantially higher coverage of this chromosome compared to query genes located on chrII. Note that aneuploidy of chromosome II is lost in the absence of positive selection, suggesting that it is detrimental in the population.
  • E. Screen and individual colony scores are concordant. Screen suppression score (x-axis log2-scale growth ratio between wild strain and reference crosses at 34°C Methods) and individual colony count difference (y-axis log2-scale colony count ratio in the wild strain cross between 26 and 34°C minus log2-scale colony count ratio in the reference cross between 26 and 34°C). Marker size: individual colony count at permissive temperature (smaller markers for fewer colonies) marker type: “x” for TS strains with low temperature sensitivity in the control cross (colony count ratio between 26 and 34°C below 2) “o” for the rest marker colour: blue for crosses with visually confirmed suppression yellow for unconfirmed. Note that visual confirmations also include cases of increased colony size, not solely increased colony number (Dataset EV3). Dashed grey line: the cut-off used for calling suppression in the screen.

Also beyond these large genomic determinants, suppression of fitness defects by standing variation in the species was relatively common. Excluding the copy-number suppression events discussed above, 192 of 1,106 TS alleles (17%) and 149 of the 580 tested genes (26%) were suppressed in segregant progeny from at least one genetic background, and on average progeny from a wild strain cross could suppress 37 essential gene mutant alleles (3%). Due to variation in temperature sensitivity, different TS alleles of the same gene are not necessarily expected to show suppression at the same temperature. Nevertheless, if a TS allele was suppressed in segregant progeny from a wild strain, the strongest suppression of another TS allele of the same gene in segregants of the same wild strain was on average substantially higher than expected by chance (0.61 vs 0.39, Appendix Fig S2).

To further validate the suppression events identified in our screen, we tested a selection of 102 suppression effects of variable strength by examining the fitness of hundreds of single colony progeny from individual crosses. As the progeny of most crosses showed high variation in colony size, which was also influenced by the number of colonies on the plate, we used stringent thresholds for identifying suppression (Methods). We observed good concordance of strong effects between the phenotypes of the population in the initial screen and the individual progeny in this assay (62% of crosses with suppression scores above 0.75 in the screen show suppression in the individual colony assay, 16% for crosses with a suppression score below 0.75, Fig EV2E, Dataset EV3).

Thus, we found that suppression by standing genetic variation is relatively common and that the identified suppression events can often be validated by additional TS alleles or in complementary assays.

Patterns of suppression

Next, we asked whether segregant progeny from genetically similar wild strains were more likely to suppress the same TS alleles compared to more diverse wild strains. Indeed, suppression patterns were more distinct for the two wild strains genetically furthest from the wine/European cluster (maximum Pearson’s R to any other wild strain for NCYC110, UWOPS87-2421 less than 0.52, and between 0.64 and 0.77 for the rest) and were consistent with the genetic relatedness otherwise (Fig 2B). The DBVPG1106 wine strain was a phenotypic outlier of Wine/European strains due to overall poor growth at the restrictive temperature (0% of TS allele crosses with log2-scale colony size of more than 10.5 across all crosses at least 11% for all other strains, Appendix Fig S1). When using different wild strains as the phenotypic reference to call suppression, the total number of suppressed TS alleles was lower compared to S288C, but their relative frequency across strains was similar (Appendix Fig S3). This suppression pattern is consistent with the reference strain acquiring additional loss-of-function mutations in the laboratory that can be suppressed by crossing to the wild strains, as well as the presence of additional suppression events that are linked to distances in both genetic and phenotypic trees.

The patterns of suppression of the same TS allele or gene in the various wild strain crosses were diverse. In 31% of the cases, the TS allele is possibly temperature-sensitive only in the reference background, with suppression in segregant progeny of most of the tested wild strains (61 of 192 TS alleles with suppression at a lower 0.5 threshold, e.g. TS alleles of GAB1, Fig 2C and D). For other TS alleles, suppression was generally limited to a single wild strain (e.g. TS alleles of NSE4, Fig 2D). Suppression was also shared across genes with related function. For example, Gab1 is a member of the GPI-anchor trans-amidase complex, mutations to three screened members of which were strongly suppressed (Fig 2E), and the GPI8 gene with less suppression was likely carrying the suppressor variant (see below). Again, we also observed suppression in specific backgrounds, e.g. mutations to genes in the nuclear condensin complex were suppressed almost exclusively in the UWOPS87-2421 background (Fig 2E). In general, we observed consistent suppression patterns between genes encoding members of the same protein complex most frequently (18% of protein complexes with average between-gene suppression correlation higher than permuted controls, Methods), followed by KEGG pathways (15%) broad functional categories (10%), cellular locations (10%) and Gene Ontology categories (3%). This concordance is consistent with the nature of connectedness within genetic networks in general, where many interactions are shared within complexes, compared to broader functional connections. Finally, we tested whether loss-of-function mutations have accumulated in essential genes in the wild strains that suppress TS alleles of the gene in S288C, but found limited signal (0.14 deleterious mutations in suppressed genes 0.16 in others).

Mapping of genomic regions involved in suppression

Given frequent, strong and technically and biologically consistent suppression of TS alleles by variants from wild genetic backgrounds, we next sought to identify the causal loci and genes. First, to estimate the average number of modifiers involved in the suppression phenotype, we dissected meiotic progeny of 16 crosses and examined the growth of spores carrying the TS allele at 26 and 34°C. In all cases, 15–65% of the spores grew well at the restrictive temperature, with little additional phenotypic variation in growth beyond survival, suggesting that most of the detected suppression phenotypes are the result of at most 1–3 strong modifier variants in the wild strain background (Fig EV3, Discussion).

Figure EV3. Estimating the number of strong modifiers

TS alleles were crossed to the wild strain in which they were suppressed, and the resulting hybrid strains were dissected at 26°C. The first 12 spores carrying the TS allele were selected from the dissection plate and were grown overnight in liquid media. Cultures were diluted to an optical density at 600 nm of 0.1 and a series of tenfold dilutions was spotted on agar plates and incubated for 2 days at 26°C or 34°C. The number of strong modifiers was estimated by determining the fraction of the spores that grew well at 34°C.

To map the suppressor loci, we performed bulk segregant analysis on 38 segregating TS allele populations at both 26°C (TS allele functional) and 34°C (TS allele loss-of-function, Fig 1B) (Liti & Louis, 2012 ). We sequenced the populations and compared variant allele frequencies between the two temperatures (Datasets EV4 and EV5). We first considered positive controls expected to involve suppression by an additional, wild-type copy of the query gene described above, either generated by the chrVIII-chrXVI translocation (six samples) or located on an aneuploid chromosome (six samples). In all 12 cases, we could indeed observe selection for either the translocation or the aneuploidy and further confirmed that suppression occurred by the presence of a second, wild-type allele of the query gene (Figs EV1C and D, and EV2D).

Figure EV4. Suppressor identification

To validate the suppressor candidates, we replaced the suppressor gene reference alleles with their wild version in the reference strain background and tested for suppression of the corresponding TS allele. Cultures of the indicated strains were grown until saturation, and a series of tenfold dilutions was spotted on YPD agar plates and incubated at the indicated temperatures. See Fig 5A for the suppression of nse3-ts4 por NSE1-UWOPS872421.

Figure EV5. o NSE1 allele of UWOPS87-2421 can suppress NSE3 e NSE4 TS mutants, but not deletion mutants

  1. Suppression of the DNA damage sensitivity of nse3-ts4 e nse4-ts4 TS mutants by the NSE1 allele of UWOPS87-2421. Cultures of the indicated strains were diluted to an optical density at 600 nm of 0.1 and a series of tenfold dilutions was spotted on agar plates and incubated for 2–3 days at 30°C. UW = UWOPS87-2421, WT = wild type.
  2. o NSE1-UW allele cannot suppress the lethality associated with deletion alleles of genes encoding SMC5/6 complex members. Spot dilutions were performed as described in (A).
  3. Smc6-FLAG levels are not affected by mutations in NSE1, NSE3, ou NSE4. Western blot analysis of Smc6-FLAG in the indicated strains. Ponceau staining was used as a loading control.

Second, we sequenced meiotic progeny of nine crosses that showed weak “suppression” in our screen (suppression score below 0.7), unrelated to any known translocations or aneuploidies. Five cases showed selection for newly acquired aneuploidies of either the chromosome carrying the query gene or other loci selected in the crossing protocol. These cases often represent ways of cells to escape the strong selection applied in our protocol, rather than true cases of suppression. The remaining four cases harboured regions of selection for the wild strain sequence specific to high temperature (Datasets EV4 and EV5), suggesting that some of the weaker scores in our screen also represent true cases of suppression and corroborating the observations from the confirmation of individual suppression effects.

Third, we analysed 17 crosses that showed strong suppression in our screen (suppression score above 0.75). The large majority (14) showed regions of specific selection for the wild sequence at high temperature (Fig 3A, Datasets EV4 and EV5), whereas two populations diploidised or showed selection for an aneuploidy. The one remaining cross did not show any suppressor loci or aneuploidies. Thus, we could map suppressor loci for 14/17 (82%) of the crosses that showed strong suppression in our screen, and in 4/9 (44%) of the crosses that showed weak suppression.

Figure 3. Mapping suppressor loci by sequencing segregant pools

  1. Example of the mapping results. Wild allele frequency in progeny of a cross of the gab1-1 temperature-sensitive allele to the YJM975 strain (y-axis) along the yeast genome (x-axis) at the permissive 26°C (blue) and restrictive 34°C (TS allele loss-of-function, cyan). The allele frequency change between the two temperatures is used in mapping. Labels: selected loci in the cross. Blue regions: called suppressor loci.
  2. Suppressors are plentiful. The average number of suppressor loci per cross (y-axis) at a given allele frequency change cut-off (x-axis) with either the wild allele beneficial (blue) or the reference allele beneficial (yellow). Vertical line at an allele frequency change of 0.2: the cut-off used for calling suppressor loci.
  3. Suppressors are reproducible across TS alleles. Allele frequency change of suppressor loci in crosses using different TS alleles of the same gene (x- e y-axis) crossed with the same wild strain. Colours: gene and wild strain combinations.
  4. Suppressors are reproducible across wild strains. Allele frequency change of suppressor loci at 34°C in crosses using the same TS allele and a different wild strain (x- e y-eixo). Colours: TS alleles.

The landscape of suppressors is diverse. We identified 31 suppressor loci in the 19 crosses without aneuploidies (1.6 on average, Figs 3B and 4A, Dataset EV5) and an additional 48 weaker reproducible signals (2.5 on average, Figs 3B and 4A, Dataset EV5). This number of modifier loci is in agreement with our estimates based on segregation patterns observed after tetrad dissection (Fig EV3). Most of the suppressor loci (27/31) were selected for the wild strain sequence, consistent with the additional variation in the species providing the substrate for circumventing essential gene function. Reassuringly, suppressor loci were reproducible across biological replicates, different TS alleles of the same gene when crossed to the same wild strain (e.g. RPN11), and same TS alleles when crossed to different wild strains (TFG1 e GAB1 Figs 3C and D, and 4A). A suppressor locus on chromosome XIV was shared across five different essential genes (GPI13, MED7, RPN11, SEC24 e TFG1), indicating the presence of a pleiotropic modifier in this locus, co-localising with the previously characterised MKT1 gene (Steinmetz et al, 2002 ).

Figure 4. Identifying and validating suppressor candidates

  1. Mapping results for segregant pools involving the indicated TS alleles and wild strains. The change in S288C allele frequency between the meiotic progeny isolated at 26°C and 34°C is plotted by genomic coordinate. Causal suppressor genes are indicated for regions that show selection for the wild strain sequence. Genes in brackets have not been validated experimentally.
  2. Comparison of the change in reference allele frequency, either for suppressor loci for which a causal suppressor gene was validated (N = 17), or for loci for which we were unable to validate a suppressor gene (N = 10). Loci for which all experiments failed due to technical reasons were excluded from the analysis. Statistical significance was determined using a two-tailed Mann–Whitney’s você-test (**P < 0.005). Boxes: first, second, and third quartiles whiskers: 1.5 interquartile range away from the first and third quartiles.
  3. A cartoon of the TORC2 signalling pathway, highlighting suppression of a TORC2 mutant (tsc11) by mutations in ORM2.
  4. Suppressor prediction within the chromosome XV QTL of rpn11 TS mutants. The functional information prioritisation score (y-axis) for genes in the suppressor region (x-axis) identified RPT4 e RPN8 as the two highest-scoring suppressor candidates.
  5. Experimental validation of RPN8 as the causal suppressor of the rpn11-8 TS mutant. Cultures of the indicated strains were diluted to an optical density at 600 nm of 0.1 and a series of tenfold dilutions was spotted on agar plates and incubated for 2–3 days at 34°C. UWOPS = UWOPS87-2421. See also Fig EV4.

Suppressor gene identification and validation

We next sought to identify the causal suppressor genes. As each of the mapped regions harbours tens of plausible candidates, we computationally prioritised them based on their functional connection to the query gene (Dataset EV6, Methods, van Leeuwen et al, 2020 ). We also included known general modifiers, such as MKT1 e HAP1, that each affects the expression of thousands of genes (Fay, 2013 Albert et al, 2014 , 2018 Parts et al, 2014 ). To test the phenotypic consequence of the candidate genes, we replaced their open reading frame and

100–400 bp surrounding region with the wild version in the reference strain background and tested for suppression of the corresponding TS allele. In total, we tested 50 suppressor gene candidates from 31 mapped loci of various strength (Dataset EV7, Fig EV4) and identified causal genes for 17 loci (55%, Dataset EV7, Figs 4A and EV4), validating both our mapping strategy, as well as the computational prioritisation. The 14 suppressor loci without a confirmed suppressor gene resulted from failed experiments, inconclusive results, or cases in which no suppression was observed for the wild allele (Dataset EV7). Causal suppressor genes were more likely to be identified for strong suppressor loci compared to weaker signals, suggesting that in unconfirmed cases the suppression phenotype may have been too weak to detect in our validation assay (Fig 4B).

Many of the validated suppressor genes were consistent with their known roles in the biology of the query gene. For example, two different TS alleles of TSC11, which encodes a subunit of TOR complex 2 (TORC2) that activates a phosphorylation cascade controlling sphingolipid biosynthesis, were suppressed by multiple variants present in the DBVPG1373 strain (Fig 4A). The two strongest suppressor loci were located around MSS4 e ORM2, which encode an upstream activator and a member of the TORC2 signalling pathway, respectively (Han et al, 2010 Lucena et al, 2018 Fig 4A and C). Indeed, we confirmed the suppression of tsc11-5 temperature sensitivity by the ORM2-DBVPG1373 allele (Fig EV4). Orm2 inhibits the first committed step in sphingolipid synthesis, and loss of Orm2 function may lead to the reactivation of sphingolipid biosynthesis in the absence of TORC2 (Fig 4C). Intriguingly, a third weak suppressor locus was identified for the tsc11-5 allele around ORM1, a paralog of ORM2. Contudo, ORM1 has no variants within the ORF in the DBVPG1373 strain, and we were not able to confirm a suppression phenotype for the ORM1 promoter variants in the presence of reference alleles of MSS4 e ORM2.

Genetic mapping alone is not sufficient to identify causal genes. Our computational prioritisation identified RPT4 e RPN8 as potential suppressor genes within the chromosome XV suppressor locus of RPN11 with equally high scores (Fig 4A and D). As the query gene RPN11 encodes a metalloprotease subunit of the 19S regulatory particle of the proteasome, and the candidate suppressors RPT4 e RPN8 also both encode subunits of the same particle, genetic information and computational prior were not sufficient to pinpoint one as the causal suppressor gene. In experimental validations, the RPN8 allele from UWOPS87-2421 suppressed the rpn11-8 phenotype, whereas the RPT4 allele did not (Figs 4E and EV4). Rpn8 and Rpn11 form an obligate heterodimer (Bard et al, 2018 ), and the RPN8 allele from UWOPS87-2421 may thus restore the interaction between the two proteins, which could have been weakened by the RPN11 mutações. This ability to resolve a causal gene from multiple linked candidates underscores the importance of thorough experimental validation to understand the mechanism of suppression.

Genetic simplicity of strong suppression

Previous approaches for identifying suppressors have relied on spontaneous mutation, and thus sample genetic backgrounds that are very similar to that of the reference. As a result, more complex allele arrangements that may be required for suppression, e.g. combinations of two or more mutations, are not easily obtained. Despite observing multiple loci that are involved in the suppression phenotype in each of the sequenced populations (Fig 4A), we found no evidence for the interdependence of one suppressor locus genotype on the presence of another, and all strong suppressors acted in isolation (Figs 4B and EV4 Discussion). For example, both the RPN8 e a MKT1 allele from UWOPS87-2421 could individually suppress the rpn11-14 TS allele to near wild-type fitness (Fig EV4). We did not observe examples consistent with strong suppression by many small effect variants. Conversely, multiple mutations within a locus could be required for suppression. o ORM2-DBVPG1373 allele that independently suppressed tsc11-5 carries two missense mutations, P26T and G134S, that affect conserved residues, are predicted to be highly deleterious and are both required for a robust suppression phenotype (Fig EV4).

Next, we compared the suppressor genes identified by our mapping results to those previously found in the reference strain background (Oughtred et al, 2019 ). In cases where we confirmed a candidate suppressor, we also often found prior evidence of suppression in that gene (4/9 unique suppressor-query pairs Dataset EV7). In all four cases, the suppressor and query gene pairs encoded members of the same protein complex or pathway, and in three cases the suppressor and query proteins interact physically (Dataset EV7). The five suppressor-query gene pairs that had not been previously described included four cases of suppression by the general modifier MKT1. We have previously observed a similar prevalence of general suppressor genes that affect the expression of the query mutant among spontaneous suppressor mutations of TS alleles isolated in the reference strain (

50% of all suppressor genes van Leeuwen et al, 2016 , 2017 ). Out of the nine suppressor-query pairs, 7 (78%) appear to involve a gain-of-function suppressor allele (Methods Dataset EV7). When we exclude MKT1, three out of 5 (60%) suppressor genes were classified as gain-of-function alleles compared to the reference allele. This relatively large proportion of gain-of-function alleles is consistent with the idea that loss-of-function alleles may be under stronger negative selection in natural populations.

Overall, mechanisms of suppression identified in a laboratory setting mimic those driven by natural variation and can involve identical suppressor genes when considering suppressors that function within the same functional module as the query gene. In addition, despite the presence of multiple selected suppressor regions in nearly every cross, strong suppressor mutations always acted independently of the genetic background. Combined, these observations are consistent with a model where single genes evolve along a lineage, perhaps adapting to the rest of the environmental and genetic context via multiple gain-of-function mutations, which then in turn gives the derived allele the ability to independently suppress fitness defects of other alleles.

Mutations in NSE1 can suppress SMC5/6 complex dysfunction

One of our mapped suppressor interactions involved the suppression of a nse3-ts4 TS allele by the NSE1 allele from UWOPS87-2421 (“NSE1-UW” Figs 4A and 5A). Nse1, Nse3 and Nse4 form a subcomplex within the highly conserved SMC5/6 complex, which is essential for the removal of recombination intermediates during DNA replication and repair (Fig 5C) (De Piccoli et al, 2006 Menolfi et al, 2015 ). Nse3 and Nse4 bridge the globular head domains of Smc5 and Smc6 (Fig 5C), whereas Nse1 is a RING finger protein with ubiquitin ligase activity that strengthens the interactions between Nse3 and Nse4 (Pebernard et al, 2008 Hudson et al, 2011 ). o NSE1-UW allele also suppressed the growth defect of a nse4-ts4 TS allele, but not that of any of the other tested SMC5/6 subunits (Fig 5A). UMA nse1 loss-of-function allele exacerbates the fitness defect of a nse3 TS mutant (Costanzo et al, 2016 ), and overexpression of NSE1 suppresses a nse3 TS allele (Magtanong et al, 2011 ) (Fig 5D), suggesting that the NSE1-UW allele has a gain-of-function effect that improves the stability or activity of the SMC5/6 complex. Indeed, the NSE1-UW allele suppressed the sensitivity of nse3 e nse4 mutants to DNA damaging ageing agents hydroxyurea (HU) and methyl methanesulfonate (MMS) (Figs 5B and EV5A), but could not suppress the lethality associated with deleting either NSE3 ou NSE4 (Fig EV5B). Thus, phenotypic defects of nse3 e nse4 partial loss-of-function mutants could be restored by the presence of NSE1-UW.

Figure 5. The NSE1 allele of UWOPS87-2421 can suppress NSE3 e NSE4 TS mutants

  • A, B. Suppression of nse3-ts4 e nse4-ts4 temperature sensitivity (A) and DNA damage sensitivity (B) by the NSE1 allele of UWOPS87-2421. Cultures of the indicated strains were diluted to an optical density at 600 nm of 0.1 and a series of tenfold dilutions was spotted on agar plates and incubated for 2–3 days. UW = UWOPS87-2421. The plates shown in (B) were incubated at 30°C.
  • C. A cartoon of the SMC5/6 complex.
  • D. An illustration of the various types of genetic interactions that have been observed between different alleles of NSE1 e NSE3.
  • E. Recruitment of Smc6-FLAG by ChIP-qPCR at two known SMC5/6-binding sites (pericentromere of chromosome XIV and CEN3) and one negative control locus (arm of chromosome III) in G2/M arrested strains. Relative enrichment corresponds to the ratio of the signal after immunoprecipitation (FLAG) over beads alone, normalised to the ratio in wild-type cells at CEN3. Error bars: standard error of the mean of three independent experiments. Statistical significance was determined using an unpaired, two-tailed t-teste (*P < 0.05, **P < 0.005).

To more directly test the impact of NSE1-UW allele on the SMC5/6 complex function, we measured its accumulation at two established chromosomal SMC5/6-binding sites using an Smc6-FLAG-based ChIP-qPCR assay in the reference strain (Lindroos et al, 2006 Jeppsson et al, 2014 ). Although the amount of Smc6-FLAG protein was similar in all strains (Fig EV5C), the accumulation of Smc6-FLAG at the two genomic loci was substantially reduced in nse3-ts4 e nse4-ts4 mutants compared to wild type (Fig 5E). Replacing the reference NSE1 allele with the NSE1 allele of UWOPS87-2421 increased recruitment of the SMC5/6 complex to the DNA, both in the presence of wild-type or TS alleles of NSE3 ou NSE4. This suggests that the NSE1-UW allele increases association of the SMC5/6 complex to the DNA, thereby counteracting the negative effects of the nse3 e nse4 TS alleles on SMC5/6 complex activity.


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