Em formação

6.2: Cinética enzimática - Biologia


Enzimas são catalisadores de proteínas, eles influenciam o cinética mas não a termodinâmica de uma reação

  • Aumentar a taxa de uma reação química
  • Não altere o equilíbrio

Figura 6.2.1: Atividade do catalisador

  • Eles aumentam a taxa estabilizando o estado de transição (isto é, diminuindo a barreira de energia para formar o estado de transição (eles não afetam a energia do (s) reagente (s) ou produto (s)

Derivação de Michaelis-Menten para cinética de estado estacionário simples

A equação de Michaelis-Menten é um modelo matemático isso é usado para analisar dados cinéticos simples. O modelo tem certeza premissase, desde que essas suposições estejam corretas, ele modelará com precisão seus dados experimentais. A derivação do modelo irá destacar essas premissas.

Em uma reação catalisada por enzima, o substrato forma inicialmente um complexo reversível com a enzima (isto é, o enzima e substrato devem interagir para que a enzima seja capaz de realizar sua função catalítica). A expressão padrão para mostrar isso é a seguinte:

ASSUNÇÃO # 1:

  • Não há produto presente no início da análise cinética
  • Portanto, enquanto monitorarmos taxas de reação inicial nós podemos ignorar a reação reversa de E + P indo para ES

ASSUNÇÃO # 2:

  • Durante a reação um equilíbrio condição é estabelecida para a ligação e dissociação da Enzima e do Substrato (suposição de Briggs-Haldane)
  • Assim, o taxa de formação do complexo ES é igual ao taxa de dissociação mais decomposição

ASSUNÇÃO # 3:

  • [E] << [S]
  • A enzima é um catalisador, não é destruída e pode ser reciclada, portanto, apenas pequenas quantidades são necessárias
  • A quantidade de S ligado a E em qualquer momento é pequena em comparação com a quantidade de S livre
  • Segue que [ES] << [S] e portanto [S] é constante durante o curso da análise (NOTA: esta suposição requer que a reação seja monitorada por um período curto, de modo que não muito S seja consumido e [S] não mude efetivamente - veja a próxima suposição)

ASSUNÇÃO # 4:

  • Apenas o velocidade inicial da reação é medida
  • [P] = 0 (a reação reversa E + P pode ser ignorada)
  • [WL]inicial

ASSUNÇÃO # 5:

  • A enzima está presente como enzima livre ou como o complexo ES
  • [E]total = [E] + [ES]

Derivação de Michaelis-Menten usando as premissas acima:

Taxa de formação ES = k1[E] [S] + k-2[E] [P]

A suposição # 1 diz que podemos ignorar o k-2 reação, portanto:

Taxa de formação ES = k1[E] [S]

Suposição # 5 diz [E] = [E]total - [ES], portanto:

Taxa de formação ES = k1([E]total - [ES]) [S]

A taxa de decomposição ES é uma combinação da dissociação e da conversão em produto:

Taxa de decomposição ES = k-1[ES] + k2[ES]

Taxa de desagregação ES = (k-1 + k2) [ES]

A suposição # 2 diz que a taxa de formação de ES é igual à taxa de decomposição:

k1([E]total - [ES]) [S] = (k-1 + k2) [ES]

Reorganize para definir em termos de constantes de taxa:

([E]total - [ES]) [S] / [ES] = (k-1 + k2) / k1

([E]total [S] / [ES]) - [S] = (k-1 + k2) / k1

Defina uma nova constante, Km = (k-1 + k2) / k1

([E]total [S] / [ES]) - [S] = Km

Resolva para o termo [ES] (por motivos que serão fornecidos na próxima etapa):

[ES] = [E]total [S] / (Km + [S])

A velocidade real de reação medida em qualquer momento é dada por:

V = k2[ES]

Múltiplos ambos os lados da equação acima por k2:

k2[ES] = k2[E]total [S] / (Km + [S])

portanto

V = k2[E]total [S] / (Km + [S])

A velocidade máxima possível (Vmax) ocorre quando todas as moléculas de enzima estão ligadas ao substrato [ES] = [E]total, portanto:

Vmax = k2[E]total

Substituir isso na expressão anterior dá:

V = Vmax [S] / (Km + [S])

Esta é a expressão matemática que é usada para modelar seus dados cinéticos experimentais

É conhecida como equação de Michaelis-Menten


Abordagem experimental

A abordagem geral é adicionar um concentração conhecida de substrato para a enzima e para determinar o taxa de reação inicial para aquela concentração de substrato

  • As taxas de reação são normalmente dadas como moles (ou micromole) de produto produzido por unidade de tempo (seg ou min) por mol (ou micromole) de enzima
  • O experimento é repetido para uma ampla gama de concentrações de substrato
  • Uma tabela de pontos de dados [S] versus V são coletados
  • Esses pontos de dados são traçados (V versus S) e devem se ajustar a uma curva que concorda com a equação de Michaelis-Menten

O Vmax e Km termos são intrínseco propriedades da combinação específica de enzima / substrato que você está estudando

  • Eles serão determinados a partir das características do gráfico V versus S

Vmax

Há um número limitado de moléculas de enzimas e elas podem realizar apenas uma única reação por vez. Assim, em alto [S] as enzimas podem ser saturado

  • Em condições de saturação, a reação ocorre o mais rápido possível e aumentos adicionais em [S] não aumentam a taxa de reação.
  • A taxa máxima observável é Vmax e os dados vão assíntota para este valor em alta [S]
  • Em baixo [S], a taxa de reação é geralmente linearmente proporcional ao [S] (ou seja, em baixo [S], se você dobrar [S], o V dobrará)

Km

Km = (k-1 + k2) / k1 = (taxa de decomposição de ES) / (taxa de formação de ES)

  • Km é semelhante, mas não exatamente igual a, uma constante de dissociação (Kd) para o complexo ES
  • Se k-1 >> k2, então Km »Kd
  • Devido a esta semelhança com a expressão para Kd, uma baixo valor de Km é frequentemente interpretado como um alta afinidade da enzima para o substrato, e um grande valor para Km é frequentemente interpretado como uma afinidade fraca da enzima para o substrato
  • Km tem unidades de concentração molar (assim como as unidades de [S])

Existe um tratamento matemático que permite a determinação de Km a partir dos dados experimentais V versus [S].

  • Considere a situação em que o [S] sendo avaliado resulta em um valor de V que é exatamente 1/2 da velocidade máxima de reação:

V = Vmax [S] / (Km + [S])

1/2Vmax = Vmax [S] / (Km + [S])

1/2 = [S] / (Km + [S])

Km + [S] = 2 [S]

Km = [S]

Assim, Km é igual à concentração de substrato que resulta em exatamente metade da velocidade de reação máxima possível

Figura 6.2.2: Km

Lineweaver-Burke (o "duplo recíproco" enredo)

  • A equação de Michaelis-Menten pode ser reorganizada tomando o recíproco, para produzir:

  • Se X = 1 / [S] e Y = 1 /V então esta é uma equação linear com uma inclinação de Km/Vmax e uma interceptação Y de 1 /Vmax

Figura 6.2.3: 1 / S e 1 / V

  • Uma vez que o gráfico de 1 / [S] versus 1 / v de dados deve ser uma linha reta, é mais fácil ajustar uma função linear aos dados nesta forma, e Vmax e Km pode ser facilmente determinado a partir do gráfico

Inibição Reversível

Existem duas categorias principais de inibidores reversíveis: competitivo inibidores reversíveis, e não competitivo inibidores reversíveis:

Inibidores competitivos

O inibidor (eu) compete com o substrato (S) para a enzima Site ativo (também conhecido como o S-binding site) A ligação de qualquer uma dessas moléculas no sítio ativo é um Mutualmente exclusivo evento

  • O substrato e o inibidor compartilham um alto grau de similaridade estrutural. Contudo, o inibidor não pode prosseguir através da reação para produzir o produto.
  • Aumentar a concentração de substrato irá vencer a competição o inibidor de ligação ao sítio ativo da enzima
  • Um inibidor reversível competitivo pode ser identificado por seus efeitos característicos sobre os dados cinéticos

A expressão para a expressão de Michaelis-Menten na presença de um inibidor competitivo reversível é:

V = Vmax [S] / (Km(1+ [I] / Keu) + [S])

Onde Keu é a constante de dissociação do complexo EI real

Os efeitos do inibidor competitivo reversível sobre a cinética são os seguintes:

  • Se nenhum inibidor estiver presente (ou seja, se [eu] = 0) então as equações são as mesmas
  • Conforme o inibidor é adicionado, o efeito é modificar o valor aparente de Km. Em particular, o aparente Km será aumentado por um valor igual a (1 + [I] / Keu). Se Km Está melhorado, a velocidade de reação v diminuirá.
  • Observe que como [S] fica muito grande, o valor do denominador é essencialmente igual a [S] e v @ vmax. Assim, a velocidade de reação pode ser conduzida para vmax com uma concentração de substrato alta o suficiente

Os critérios de diagnóstico para inibição competitiva reversível é isso enquanto o aparente Km é afetado pela adição do inibidor, o valor de vmax não muda

Figura 6.2.4: Efeito do inibidor competitivo reversível

Como o gráfico recíproco duplo de Lineweaver-Burke é afetado pela presença de um inibidor competitivo reversível?

Figura 6.2.5: Gráfico recíproco duplo com inibidor competitivo reversível

Inibidores não competitivos

Os inibidores não competitivos reagem com ambos E e ES (isso ocorre porque o inibidor não competitivo não liga no mesmo site na enzima como o substrato)

  • Inibição não pode ser superado aumentando a concentração de S
  • O efeito na cinética é como se a enzima fosse menos ativa (vmax É reduzido), mas que a afinidade pelo substrato não é afetada (Km continua o mesmo), uma vez que o local de ligação do substrato não é ocupado pelo inibidor não competitivo.

Figura 6.2.6: Efeito do inibidor não competitivo reversível

Figura 6.2.7: Gráfico recíproco duplo com inibidor não competitivo


Fosfofrutocinase 2

Fosfofrutocinase-2 (6-fosfofruto-2-quinase, PFK-2) ou frutose bisfosfatase-2 (FBPase-2), é uma enzima indiretamente responsável por regular as taxas de glicólise e gliconeogênese nas células. Catalisa a formação e degradação de um regulador alostérico significativo, a frutose-2,6-bifosfato (Fru-2,6-P2) a partir do substrato frutose-6-fosfato. Fru-2,6-P2 contribui para a etapa determinante da velocidade da glicólise, pois ativa a enzima fosfofrutocinase 1 na via da glicólise e inibe a frutose-1,6-bisfosfatase 1 na gliconeogênese. [1] Desde Fru-2,6-P2 regula diferencialmente a glicólise e a gliconeogênese, pode atuar como um sinal chave para alternar entre as vias opostas. [1] Porque PFK-2 produz Fru-2,6-P2 em resposta à sinalização hormonal, o metabolismo pode ser controlado de forma mais sensível e eficiente para se alinhar às necessidades glicolíticas do organismo. [2] Esta enzima participa do metabolismo da frutose e manose. A enzima é importante na regulação do metabolismo hepático de carboidratos e é encontrada em maiores quantidades no fígado, rins e coração. Em mamíferos, vários genes frequentemente codificam diferentes isoformas, cada uma das quais difere em sua distribuição nos tecidos e atividade enzimática. [3] A família descrita aqui tem uma semelhança com as fosfo-frutocinases conduzidas por ATP, no entanto, elas compartilham pouca similaridade de sequência, embora alguns resíduos pareçam essenciais para sua interação com a frutose 6-fosfato. [4]

A PFK-2 é conhecida como a "enzima bifuncional" por causa de sua estrutura notável: embora ambas estejam localizadas em um homodímero de proteína, seus dois domínios atuam como enzimas que funcionam independentemente. [5] Um terminal atua como um domínio de quinase (para PFK-2), enquanto o outro terminal atua como um domínio de fosfatase (FBPase-2). [6]

Em mamíferos, os mecanismos genéticos codificam diferentes isoformas de PFK-2 para acomodar as necessidades específicas dos tecidos. Embora a função geral permaneça a mesma, as isoformas apresentam pequenas diferenças nas propriedades enzimáticas e são controladas por diferentes métodos de regulação, essas diferenças são discutidas abaixo. [7]


Papaína

A papaína pode ser usada para quebrar fibras duras de carne e tem sido utilizada por milhares de anos em sua América do Sul nativa. É vendido como componente de um amaciante de carne em pó, disponível na maioria dos supermercados. A papaína, na forma de um amaciante de carne como o de Adolph, transformado em uma pasta com água, também é um remédio caseiro para picadas de mosquitos, picadas de água-viva, abelhas e vespas e possivelmente feridas de arraia, decompondo as toxinas protéicas do veneno. [5]

A gelatina é uma proteína produzida pela hidrólise parcial do colágeno extraído dos ossos fervidos, tecidos conjuntivos, órgãos e alguns intestinos de animais, como gado domesticado, porcos e cavalos. A gelatina é sólida quando resfriada e líquida quando aquecida. [6]

Nesta atividade, você investigará a ação do amaciante de carne, contendo a enzima papaína, sobre a gelatina e sua capacidade de "gelificar". [4]

Materiais necessários:

Procedimento:

O início do procedimento é fornecido abaixo:

  1. Prepare uma solução de gelatina aquecendo 1 colher de chá (3,0 g) de gelatina em 100 ml de água destilada até dissolver. (Misture delicadamente, não ferva.)
  2. Resfrie a solução de gelatina à temperatura ambiente.

Usando a solução de gelatina preparada e os materiais listados acima, planeje um experimento para testar o efeito do amaciante de carne na capacidade da gelatina de "gelificar".

Tabela de dados

Antes de começar, projete uma tabela de dados para registrar os resultados.


5.2 Regressão de mínimos quadrados não linear

Com o poder computacional disponível hoje, essas linearizações são realmente relictos históricos, pois podemos ajustar esses parâmetros ao nosso modelo não linear. Métodos de regressão não lineares essencialmente varrem o espaço de parâmetros, alterando iterativamente cada parâmetro e calculando a distância entre o modelo com o conjunto de parâmetros atual e os pontos de dados. A soma da distância quadrada entre nosso modelo e os dados é chamada de residual. Os valores dos parâmetros que minimizam o residual são escolhidos como nosso melhor ajuste.

método k_cat ek_cat K_m eK_m
LIBRA 114.836963256884 0.000126942716628018 9.7828737328161 0.15690573532138
EH 113.051061858663 1.09005061012357 9.54408258808163 0.144570335085599
HW 112.685492138659 5,1274104959967e-05 9.48505475242782 0.0008665705020912
NLS 112.186249467533 0.659060143051018 9.40417147589177 0.105901419035103

Separações Bioanalíticas

Nektaria Markoglou, Irving W. Wainer, em Handbook of Analytical Separations, 2003

7.2.4 Efeito da imobilização na cinética enzimática

Os parâmetros cinéticos de Michaelis-Menten de enzimas imobilizadas podem ser determinados usando as mesmas abordagens gerais desenvolvidas para o estudo de enzimas solubilizadas. Isso inclui o efeito da temperatura e do pH na atividade enzimática. No entanto, algumas considerações gerais devem ser levadas em consideração, uma vez que a imobilização pode introduzir novas dificuldades não associadas à enzima livre. Dependendo do método de imobilização e das propriedades do suporte, pode haver restrições relacionadas à difusão associadas à enzima imobilizada [27] e uma diminuição na mobilidade da enzima também pode afetar a mobilidade dos substratos e cofator.

A transferência de massa de substratos e produtos influencia o sistema de reação e a resistência à transferência de massa pode surgir devido à localização da enzima no suporte ou devido ao grande tamanho de partícula da enzima imobilizada. Nessas condições, a enzima imobilizada opera sob condições de limitação de difusão, em oposição a condições de limitação de reação, em que as camadas de difusão que se formam em torno das enzimas imobilizadas governam sua taxa catalítica [28]. Neste caso, o movimento de um substrato da solução a granel para a camada de líquido não misturado que envolve a enzima imobilizada e então através do sítio ativo representa a camada de difusão. Uma camada de difusão fina em contraste com uma camada espessa resulta em efeitos de transferência de massa limitados.

Isso inclui a diminuição do tamanho da partícula do suporte, a redução da carga da enzima e a manipulação da ligação da enzima ao suporte [9]. No entanto, as taxas de fluxo parecem ser o parâmetro chave. Foi demonstrado que a resistência à transferência de massa diminui com o aumento das taxas de fluxo e aumento da agitação [29]. Assim, na análise cinética de enzimas imobilizadas em reatores de fluxo (IMERs), a investigação do efeito da vazão é importante na determinação de Km e Vmax da enzima imobilizada.

O efeito da taxa de fluxo na atividade enzimática é ilustrado pelas mudanças na atividade enzimática observada de um reator de enzima D-gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase imobilizado (GAPDH-IMER) [21]. GAPDH catalisa a fosforilação oxidativa de D-gliceraldeído-3-fosfato (D-GA3P) para produzir 1,3-difosfoglicerato (1,3-DPGA) e a atividade da enzima pode ser monitorada seguindo a produção de NADH. O efeito da taxa de fluxo na produção de NADH foi determinado usando taxas de fluxo de 0,1 ml / min a 0,8 ml / min, refletindo os tempos de contato substrato-enzima de 8 minutos. a cerca de 1 min, respectivamente. As taxas de fluxo entre 0,1 e 0,4 ml / min produziram as maiores quantidades de NADH, Fig. 7.3, o que é consistente com um tempo de reação mais longo.

Fig. 7.3. O efeito da taxa de fluxo na atividade enzimática observada da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GADPH) expresso como a área do NADH produzida durante a fosforilação oxidativa do D-gliceraldeído-3-fosfato.


6.2: Cinética enzimática - Biologia

Esta página descreve o livro Fundamentals of Enzyme Kinetics (2ª edição) de Athel Cornish-Bowden, publicado pela Portland Press (1995). Esta página e as páginas vinculadas a ela agora são obsoleto já que a 3ª edição foi publicada. Não há intenção de atualizá-los no futuro.

Detalhes de publicação

A 2ª edição foi publicada pela Portland Press, Londres, 1995

Reimpresso em 1999 (com correções), 2001 e 2002. As correções feitas em 1999 na impressão de 1995 estão listadas em outra página. Eles são em sua maioria menores.

O que os revisores pensaram.

Alta competência.

Esta é uma edição reescrita de uma contribuição respeitada de 1979 para a cinética enzimática. Nem o esboço básico nem a alta competência foram alterados, mas houve acréscimos por toda parte. (Bioquímica Analítica)

Um texto de referência legível.

Este é um texto de referência legível para professores e pesquisadores, e um que estudantes de graduação confiantes também podem mergulhar. (Clive Bullock em Educação em Química)

Um especialista renomado.

Cornish-Bowden, um renomado especialista no campo da cinética enzimática, concentra-se no comportamento puramente cinético das enzimas. (K. Cornely em Choice)

Fondamenti per la comprensione.

Il testo fornisce i fondamenti per la comprensione della cinetica enzimatica, qualunque sia il livello di preparazione del lettore. (N.C. em Scienza e Governo)

Um livro verdadeiramente excelente.

Cornish-Bowden & # 8217s recentemente revisado Fundamentals of Enzyme Kinetics me permite oferecer elogios enquanto mantenho meu respeito próprio, pois este é um livro verdadeiramente excelente. Não comparei este livro com a edição anterior, principalmente porque meu exemplar daquele livro foi emprestado (permanentemente) por uma pessoa desconhecida. Esta é provavelmente uma indicação do valor da edição anterior. Guardarei minha cópia do presente livro com mais cuidado. (Ronald Duggleby em Protein Science)

A melhor apresentação disponível.

Uma edição revisada de um excelente texto publicado em 1979. É a melhor apresentação disponível e é um complemento essencial aos textos modernos de bioquímica, que tendem a minimizar o tratamento da cinética enzimática. (Herbert Gutfreund em Molecular Membrane Biology)

Um recurso valioso.

O livro é um recurso valioso para aqueles que estão se aproximando da cinética enzimática pela primeira vez, bem como para aqueles que desejam renovar seu conhecimento sobre o assunto. (Ariane Marolewski no Journal of Medicinal Chemistry)

Excelente e atualizado.

Existem vários livros bons sobre cinética enzimática, mas este é excelente e atualizado. Cada biblioteca bioquímica deve ter pelo menos duas cópias, uma para referência e outra para empréstimo, e eu aconselho qualquer pessoa que ensine cinética enzimática a obter sua própria cópia, será & # 16318 / US $ 29 bem investido. (Michael Selwyn em Educação Bioquímica)

Um livro quase literário.

Meu medo é esse. aqueles que precisam conhecê-los ficariam intimidados demais para ler um livro inteiro sobre cinética enzimática. Isso seria uma pena, já que Cornish-Bowden escreveu um livro quase literário sobre o que é provavelmente considerado pela maioria dos bioquímicos o mais enfadonho e árido dos assuntos, embora com uma história tão longa quanto a química física clássica. (Michael Silverberg no Revisão Trimestral de Biologia)

Eu dou boas-vindas a este volume.

O tempo que decorreu até o lançamento desta nova edição foi, a meu ver, muito longo. Congratulo-me com este volume não apenas por causa de parte do novo material que ele contém, mas também porque minhas cópias das versões anteriores há muito desapareceram por empréstimo permanente a alunos não identificáveis. (Keith Tipton em The Biochemist)

Fortemente recomendado.

Fortemente recomendado como um acompanhamento para literatura de pesquisa mais detalhada. (Richard Virden em Fisiologia Experimental)`

Introdução clara e inteligente à cinética enzimática

Esta é uma excelente introdução à cinética enzimática para alunos avançados de graduação e pós-graduação, bem como para qualquer pessoa que já tenha feito um curso introdutório de bioquímica. Se todo mundo que está fazendo cinética enzimática hoje em dia lesse este livro, seu projeto experimental seria muito menos desleixado e os resultados muito mais confiáveis. Não é tão abrangente quanto o livro de Segel & # 8217s, mas seu valor pedagógico é grande. (A única objeção que eu tive é que o estilo de exposição do autor às vezes fica um pouco amargo demais. Mas, afinal, o autor é inglês :) (Um leitor de Estocolmo, Suécia)

AVALIAÇÕES COMPLETAS

  • (Anônimo) em Bioquímica Analítica
  • Clive Bullock in Education in Chemistry in Choice in Scienza e Governo (em italiano) in Protein Science in the Journal of Membrane Biology no Journal of Medicinal Chemistry in Molecular Biotechnology in Biochemical Education in the Quarterly Review of Biology in The Biochemist in Experimental Physiology

Adoções de curso

  • EUA
    • Universidade da Califórnia em Santa Cruz *: Bioquímica Avançada
    • Clemson University, South Carolina: Enzymes
    • Davidson College, Carolina do Norte: Isocitrato desidrogenase como sistema modelo para projetos de pesquisa de graduação
    • Universidade da Geórgia em Atenas: Enzimologia
    • Wesleyan University, Connecticut: Enzyme cinética
    • Louisiana State University *: Biologia
    • Cornell University *: Estrutura e mecanismo da enzima
    • Universidade de Nebraska em Lincoln: Enzimas
    • Universidade da Pensilvânia: Enzimologia Prática Moderna
    • University of South Florida *: Avanços em enzimologia
    • Universidade do Texas em Houston *: mecanismos e cinética de enzimas
    • Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle: Estrutura, modificação e regulação de proteínas
    • Universidade do Alasca em Fairbanks: Enzimologia e química bioorgânica
    • Universidade de Washington: transporte biológico de massa
    • Universitat Aut & ogravenoma de Barcelona: Enzimologia
    • Universitat de Barcelona: Enzimolog e iacutea
    • Universidade de Le & oacuten *: Enzimolog & iacutea
    • Universidad Complutense de Madrid: Enzimolog & iacutea
    • Universidad de Navarra: Enzimolog e iacutea
    • Universidade de Rioja: Biocatalizadores
    • Universidade de Valência: Enzimolog e iacutea
    • Universidade de Valência: Pr & aacutectica de enzimolog & iacutea
    • Universidad Miguel Hern e aacutendez: Enzimolog e iacutea
    • Centro Universitario Francisco de Vitoria (Universidad Complutense de Madrid): Enzimolog & iacutea
    • Universidad de Extremadura: Enzimolog e iacutea
    • Universidad de Sevilla: Bioqu & iacutemica
    • Chalmers University of Technology, G & oumlteborg *: Cinética da enzima
    • Universidade de G & oumlteborg *: Biokemi
    • Universidade de Uppsala: Biokemisk metodik
    • University of Lund *: Cinética e termodinâmica em biotecnologia
    • Simon Fraser University, British Columbia, Canada: Enzymology
    • Sveucilistite u Zabrebu, Croácia: 3155 Biokemija I, II
    • & Aringbo Akademi University, Turku, Finlândia *: Enzymkinetik
    • Universidade de Giessen, Alemanha: Kinetik
    • Universit & agrave della Tuscia, Itália: Enzimologia
    • Universit & agrave degli Studi di Milano, Itália: Biotecnologie speciali
    • Universiti Putra Malaysia: Enzimologi
    • Universidad Nacional Aut & oacutenoma de M & eacutexico, México: Cin & eacutetica enzim & aacutetica
    • Universidade de Canterbury, Nova Zelândia *: química biológica
    • Universidade de Oslo, Noruega: Cellulaer biokjemi og reguleringsmekanismer
    • Universidade Norueguesa de Ciência e Tecnologia, Trondheim
    • Universidade de Lisboa, Portugal: Enzimologia
    • University of Bath, Reino Unido: Bioquímica

    Conteúdo

    1. Princípios Básicos de Cinética Química

    1.1 Ordem de uma reação: ordem e determinação da molecularidade da ordem de uma reação

    1.2 Dimensões das constantes de taxa

    1.4 Determinação das constantes de taxa de primeira ordem

    1.5 A influência da temperatura nas constantes de taxa: a equação de Arrhenius teoria elementar da colisão teoria do estado de transição

    2. Introdução à cinética enzimática

    Aviso: Dois erros tipográficos na impressão original (1995) deste capítulo são observados em outro lugar.

    2.1 Estudos iniciais: a ideia de um complexo enzima-substrato

    2.2 A equação de Michaelis-Menten

    2.3 O estado estacionário de uma reação catalisada por enzima: o tratamento de Briggs-Haldane a equação de Michaelis-Menten unidades de atividade enzimática a curva definida pela equação de Michaelis-Menten maneiras de escrever a equação de Michaelis-Menten

    2.4 Validade da suposição de estado estacionário

    2.5 Gráficos da equação de Michaelis-Menten: traçando v contra a a trama dupla-recíproca a trama de a / v contra a a trama de v contra v / a a trama linear direta

    2.6 O mecanismo reversível de Michaelis-Menten: a equação da taxa reversível as enzimas de sentido único da relação Haldane

    2.8 Integração da equação de Michaelis-Menten

    3. Aspectos práticos dos estudos cinéticos

    3.1 Ensaios enzimáticos: ensaios descontínuos e contínuos estimando a taxa inicial aumentando a retidão dos ensaios acoplados à curva de progresso

    3.2 Detectando a inativação da enzima

    3.3 Desenho experimental: escolha de concentrações de substrato escolha de pH, temperatura e outras condições uso de observações replicadas

    3.4 Tratamento de equilíbrios iônicos

    4. Como derivar equações de taxa de estado estacionário

    4.2 O princípio do método King-Altman

    4.3 O método de King e Altman

    4.4 O método de Wong e Hanes

    4.5 Modificações no método King-Altman

    4.6 Reações contendo etapas em equilíbrio

    4.7 Mecanismos de análise por inspeção: mecanismos de raciocínio topológico com etapas de beco sem saída de rotas alternativas

    4.8 Derivação de equações de taxas por computador

    5. Inibição e ativação de enzimas

    5.1 Inibição reversível e irreversível: análise de venenos catalíticos da taxa de tipos de inativação de inibição reversível

    5.2 Inibição linear: inibição competitiva (inibição específica) inibição mista inibição não competitiva (inibição catalítica) resumo dos tipos de inibição linear

    5.3 Resultados de inibição de plotagem

    5.4 Inibição por um substrato competidor: teste de especificidade da enzima se duas reações ocorrerem nos mesmos experimentos de proteção de substrato de local

    5.5 Ativação enzimática: diversos usos do termo ativação específica, ativação, ativação hiperbólica e inibição

    5.6 Projeto de experimentos de inibição

    5.7 Efeitos inibitórios de substratos: inibição de substrato de ligação não produtiva

    5.8 Modificação química como meio de identificar grupos essenciais

    6. Reações de mais de um substrato

    6.2 Classificação dos mecanismos: mecanismos do complexo ternário mecanismos de enzima substituída comparação entre as classificações química e cinética

    6.3 Equações de taxas: mecanismo de complexo ternário de ordem obrigatória, mecanismo de complexo ternário de ordem aleatória, cálculo de mecanismo de enzima substituída de constantes de taxa a partir de parâmetros cinéticos

    6.4 Medições de taxa inicial na ausência de produtos: significados dos parâmetros gráficos de parâmetros aparentes de Michaelis-Menten para mecanismos de complexo ternário gráficos secundários para gráficos de mecanismos de complexo ternário para o mecanismo de enzima substituída

    6.5 Inibição do substrato: por que ocorre a inibição do substrato, mecanismo do complexo ternário de ordem compulsória, mecanismo do complexo ternário de ordem aleatória, mecanismo de enzima substituída, valor diagnóstico da inibição do substrato

    6.8 Reações com três ou mais substratos

    7. Uso de isótopos para estudar mecanismos enzimáticos

    Novo capítulo: não está na edição original

    7.1 Troca de isótopos e efeitos de isótopos

    7.2 Princípios de troca de isótopos

    7.3 Troca de isótopos em equilíbrio

    7.4 Troca de isótopos em mecanismos de enzimas substituídas

    7.5 Troca de isótopos sem equilíbrio: perturbação do traçador de cinética de isomerase de razões de quimifluxo

    7.6 Teoria dos efeitos de isótopos cinéticos: efeitos de isótopos primários efeitos de isótopos secundários efeitos de isótopos de equilíbrio

    7.7 Efeitos isotópicos primários na cinética enzimática

    8. Efeitos ambientais nas enzimas

    8,1 pH e cinética enzimática

    8.2 Propriedades ácido-base de proteínas

    8.3 Ionização de um ácido dibásico: expressão em termos de constantes de dissociação de grupo constantes de dissociação molecular curvas em formato de sino

    8.5 Ionização do substrato

    8.6 Efeitos de pH mais complexos

    8.7 Dependência da temperatura das reações catalisadas por enzimas: temperatura desnaturação temperatura aplicação ótima da equação de Arrhenius às enzimas

    8.8 Efeitos de isótopos de solvente

    9. Controle da atividade enzimática

    9.1 Função das interações cooperativas e alostéricas: ciclos fúteis inadequação da cinética de Michaelis-Menten para a regulação das interações alostéricas da cooperatividade

    9.2 O desenvolvimento de modelos para explicar a cooperatividade: a equação de Hill um índice alternativo de pressuposto de cooperatividade da ligação de equilíbrio na cinética cooperativa a equação de Adair definições mecanísticas e operacionais de cooperatividade

    9.3 Análise de experimentos de ligação: o gráfico de Scatchard

    9.5 Modelos modernos de cooperatividade: o modelo de simetria de Monod, Wyman e Changeux o modelo sequencial de Koshland, N & eacutemethy e modelos de associação-dissociação de Filmer

    10. Cinética de sistemas multi-enzimáticos

    Novo capítulo: não está na edição original

    Uma versão em hipertexto deste capítulo pode ser consultada na web.

    Aviso: Três erros tipográficos na impressão original (1995) deste capítulo são observados em outro lugar.

    10.1 Enzimas em seu contexto fisiológico

    10.2 Análise de controle metabólico

    10.3 Elasticidades: definição das propriedades comuns de elasticidade das elasticidades cinética enzimática vista a partir da análise de controle

    10.5 Relações de soma

    10.6 Relações entre elasticidades e coeficientes de controle: coeficientes de controle de propriedades de conectividade em uma expressão de caminho de três etapas de soma e relações de conectividade em relação de conectividade de forma de matriz para um metabólito não envolvido na relação de feedback de coeficientes de controle de fluxo para elasticidades e coeficientes de controle de concentração

    10.7 Coeficientes de resposta: a resposta particionada

    10.8 Controle e regulação

    10.9 Mecanismos de regulação: cascatas de enzimas interconvertíveis de canalização de metabólitos o papel metabólico da adenilato quinase

    11. Reações rápidas

    11.1 Limitações das medições em estado estacionário

    11.2 Liberação do produto antes da conclusão do ciclo catalítico: cinética de ruptura titulação do local ativo

    11.3 Técnicas experimentais: classes de método fluxo contínuo interrompido fluxo extinto métodos de relaxamento de fluxo

    11.4 Cinética de estado transiente: sistemas longe do equilíbrio simplificação de mecanismos complexos sistemas próximos ao equilíbrio

    12. Estimativa de constantes cinéticas

    O tópico deste capítulo é abordado com mais detalhes em um livro separado, que inclui um programa para PC que Leonora projetado para análise estatística de dados cinéticos enzimáticos.

    12.1 O efeito do erro experimental na análise cinética

    12.2 Ajuste de mínimos quadrados para a equação de Michaelis-Menten: introdução do erro na estimativa da equação de Michaelis-Menten de V e K m resultados correspondentes para um desvio padrão uniforme nas taxas

    12.3 Aspectos estatísticos do gráfico linear direto: comparação entre a aplicação de estatística clássica e livre de distribuição com o gráfico linear direto, falta de necessidade de ponderação insensibilidade ao tratamento de outliers de estimativas de parâmetros negativos

    12.4 Precisão dos parâmetros cinéticos estimados

    12.5 Parcelas residuais e seus usos

    Correções

    Os erros na primeira impressão (1995) estão listados em outro lugar. Quase todos estes foram corrigidos em impressões posteriores, mas um pequeno número sobreviveu até a 3ª edição.

    Página criada antes de 1998
    Última atualização: 6 de fevereiro de 2012
    Última atualização significativa: 17 de novembro de 2004
    Comentários para Athel Cornish-Bowden


    Índice

    Parte 1: Estrutura e função das enzimas

    1: Uma introdução às enzimas

    • 1.1 O QUE SÃO ENZIMAS?
    • 1.2 UMA BREVE HISTÓRIA DE ENZIMAS
    • 1.3 A NOME E CLASSIFICAÇÃO DE ENZIMAS
    • RESUMO DO CAPÍTULO 1
    • PROBLEMAS

    2: A Estrutura das Proteínas

    • 2.1 INTRODUÇÃO
    • 2.2 AMINOÁCIDOS, OS BLOCOS DE CONSTRUÇÃO DE PROTEÍNAS
    • 2.3 A BASE DA ESTRUTURA DA PROTEÍNA
    • 2.4 A DETERMINAÇÃO DA ESTRUTURA PRIMÁRIA
    • 2.5 A DETERMINAÇÃO DA ESTRUTURA DA PROTEÍNA POR CRISTALLOGRAFIA DE RAIOS X
    • 2.6 THE INVESTIGATION OF PROTEIN STRUCTURE IN SOLUTION
    • SUMMARY OF CHAPTER 2
    • PROBLEMS

    3: The Biosynthesis and Properties of Proteins

    • 3.1 THE BIOSYNTHESIS OF PROTEINS
    • 3.2 THE PROPERTIES OF PROTEINS
    • SUMMARY OF CHAPTER 3
    • PROBLEMS

    4: Specificity of Enzyme Action

    • 4.1 TYPES OF SPECIFICITY
    • 4.2 THE ACTIVE SITE
    • 4.3 THE FISCHER ‘LOCK-AND-KEY’ HYPOTHESIS
    • 4.4 THE KOSHLAND ‘INDUCED-FIT’ HYPOTHESIS
    • 4.5 HYPOTHESES INVOLVING STRAIN OR TRANSITION-STATE STABILIZATION
    • 4.6 FURTHER COMMENTS ON SPECIFICITY
    • SUMMARY OF CHAPTER 4

    5: Monomeric and Oligomeric Enzymes

    Part 2: Kinetic and Chemical Mechanisms of Enzyme-Catalysed Reactions

    6: An Introduction to Bioenergetics, Catalysis and Kinetics

    • 6.1 SOME CONCEPTS OF BIOENERGETICS
    • 6.2 FACTORS AFFECTING THE RATES OF CHEMICAL REACTIONS
    • 6.3 KINETICS OF UNCATALYSED CHEMICAL REACTIONS
    • 6.4 KINETICS OF ENZYME-CATALYSED REACTIONS: AN HISTORICAL INTRODUCTION
    • 6.5 METHODS USED FOR INVESTIGATING THE KINETICS OF ENZYME-CATALYSED REACTIONS
    • 6.6 THE NATURE OF ENZYME CATALYSIS
    • SUMMARY OF CHAPTER 6
    • PROBLEMS

    7: Kinetics of Single-Substrate Enzyme-Catalysed Reactions

    • 7.1 THE RELATIONSHIP BETWEEN INITIAL VELOCITY AND SUBSTRATE CONCENTRATION
    • 7.2 RAPID-REACTION kINETICS
    • 7.3 THE kING AND ALTMAN PROCEDURE
    • SUMMARY OF CHAPTER 7
    • PROBLEMS
    • 8.1 INTRODUCTION
    • 8.2 REVERSIBLE INHIBITION
    • 8.3 IRREVERSIBLE INHIBITION
    • SUMMARY OF CHAPTER 8
    • PROBLEMS

    9: Kinetics of Multi-Substrate Enzyme-Catalysed Reactions

    • 9.1 EXAMPLES OF POSSIBLE MECHANISMS
    • 9.2 STEADY-STATE KINETICS
    • 9.3 INVESTIGATION OF REACTION MECHANISMS USING STEADY-STATE METHODS
    • 9.4 INVESTIGATION OF REACTION MECHANISMS USING NON-STEADY-STATE METHODS
    • SUMMARY OF CHAPTER 9
    • PROBLEMS

    10: The Investigation of Active Site Structure

    • 10.1 THE IDENTIFICATION OF BINDING SITES AND CATALYTIC SITES
    • 10.2 THE INVESTIGATION OF THE THREE-DIMENSIONAL STRUCTURES OF ACTIVE SITES
    • SUMMARY OF CHAPTER 10
    • PROBLEM

    11: The chemical nature of enzyme catalysis

    • 11.1 AN INTRODUCTION TO REACTION MECHANISMS IN ORGANIC CHEMISTRY
    • 11.2 MECHANISMS OF CATALYSIS
    • 11.3 MECHANISMS OF REACTIONS CATALYSED BY ENZYMES WITHOUT COFACTORS
    • 11.4 METAL-ACTIVATED ENZYMES AND METALLOENZYMES
    • 11.5 THE INVOLVEMENT OF COENZYMES IN ENZYME-CATALYSED REACTIONS
    • SUMMARY OF CHAPTER 11

    12: The Binding of Ligands to Proteins

    • 12.1 INTRODUCTION
    • 12.2 THE BINDING OF A LIGAND TO A PROTEIN HAVING A SINGLE LIGAND-BINDING SITE
    • 12.3 COOPERATIVITY
    • 12.4 POSITIVE HOMOTROPIC COOPERATIVITY AND THE HILL EQUATION
    • 12.5 THE ADAIR EQUATION FOR THE BINDING OF A LIGAND TO A PROTEIN HAVING TWO BINDING SITES FOR THAT LIGAND
    • 12.6 THE ADAIR EQUATION FOR THE BINDING OF A LIGAND TO A PROTEIN HAVING THREE BINDING SITES FOR THAT LIGAND
    • 12.7 THE ADAIR EQUATION FOR THE BINDING OF A LIGAND TO A PROTEIN HAVING FOUR BINDING SITES FOR THAT LIGAND
    • 12.8 INVESTIGATION OF COOPERATIVE EFFECTS
    • 12.9 THE BINDING OF OXYGEN TO HAEMOGLOBIN
    • SUMMARY OF CHAPTER 12
    • PROBLEMS

    13: Sigmoidal Kinetics and Allosteric Enzymes

    • 13.1 INTRODUCTION
    • 13.2 THE MONOD-WYMAN-CHANGEUX (MWC) MODEL
    • 13.3 THE KOSHLAND-NÉMETHY-FILMER (KNF) MODEL
    • 13.4 DIFFERENTIATION BETWEEN MODELS FOR COOPERATIVE BINDING IN PROTEINS
    • 13.5 SIGMOIDAL KINETICS IN THE ABSENCE OF COOPERATIVE BINDING
    • SUMMARY OF CHAPTER 13
    • PROBLEMS

    14: The Significance of Sigmoidal Behaviour

    • 14.1 THE PHYSIOLOGICAL IMPORTANCE OF COOPERATIVE OXYGEN-BINDING BY HΔEMOGLOBIN
    • 14.2 ALLOSTERIC ENZYMES AND METABOLIC REGULATION
    • SUMMARY OF CHAPTER 14

    Part 3: Application of Enzymology

    15: Investigation of Enzymes in Biological Preparations

    • 15.1 CHOICE OF PREPARATION FOR THE INVESTIGATION OF ENZYME CHARACTERISTICS
    • 15.2 ENZYME ASSAY
    • 15.3 INVESTIGATION OF SUB-CELLULAR COMPARTMENTATION OF ENZYMES
    • SUMMARY OF CHAPTER 15
    • PROBLEM

    16: Extraction and Purification of Enzymes

    • 16.1 EXTRACTION OF ENZYMES
    • 16.2 PURIFICATION OF ENZYMES
    • 16.3 DETERMINATION OF MOLECULAR WEIGHTS OF ENZYMES
    • SUMMARY OF CHAPTER 16
    • PROBLEM

    17: Enzymes as Analytical Reagents

    • 17.1 THE VALUE OF ENZYMES AS ANALYTICAL REAGENTS
    • 17.2 PRINCIPLES OF ENZYMATIC ANALYSIS
    • 17.3 HANDLING ENZYMES AND COENZYMES
    • SUMMARY OF CHAPTER 17
    • PROBLEMS

    18: Instrumental Techniques Available for Use in Enzymatic Analysis

    • 18.1 PRINCIPLES OF THE AVAILABLE DETECTION TECHNIQUES
    • 18.2 AUTOMATION IN ENZYMATIC ANALYSIS
    • 18.3 HIGH-THROUGHPUT ASSAYS (HTA)
    • SUMMARY OF CHAPTER 18

    19: Applications of Enzymatic Analysis in Medicine, Forensic Science and Industry


    Enzyme Kinetics : Principles and Methods , Second Edition

    “Overall, this is an excellent and thorough treatment of a difficult subject. As well as appealing to biochemists, there are also elements of interest to those studying pharmacology and the pharmacokinetic distribution of drugs. The mathematical nature and advanced coverage means that it is most suitable for researchers who already have a strong grounding in the subject. I will certainly be consulting it during my research.” (Biochemist, 29 May 2013)

    “This new, expanded and updated edition of the user–friendly and comprehensive treatise on enzyme kinetics expertly balances theory and practice. This is an indispensable aid for advanced students and professionals working with enzymes, whether biochemists, biotechnologists, chemical biologists, pharmacologists or bioengineers in academia, industry and clinical research.” (Biology Community, 29 November 2012)

    Enzyme kinetics is not a new area in biochemistry. Thirty years ago, enzyme kinetics was one of the most important tools for deconstructing enzymatic mechanisms. With advances in enzyme structure determination and molecular genetics, enzyme kinetics is no longer as prominent. However, enzyme kinetics is still useful to gain insight into enzymes that are too large for NMR studies and that cannot be crystallized. Many enzymes that fit into this category are membrane bound, the kinetics of which are much more complicated. In this new edition (1st ed., 2002), Bisswanger (Univ. of Tübingen, Germany) does a nice job of extending solution enzyme kinetics to membrane-bound enzymes. Setting it apart from other works on the subject, Enzyme Kinetics does not simply deal with substrate binding as a part of the reaction kinetics, but instead devotes about one-third of the text to equilibrium binding between macromolecules and ligands in which no reaction catalysis follows the binding. This binding is then directly connected with enzyme catalyzed reaction kinetics. Enzyme Kinetics was written to serve as a graduate-level course resource and would serve this population well. The inclusion of student problems would be an improvement. Summing Up: Recommended. Graduate students, researchers, and faculty. -- L. J. Liotta, Stonehill College (Choice, February 2009)


    On the Steady-State Method of Enzyme Kinetics

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    Closing remarks

    For the sake of conciseness, this guide has been limited to some of the basic principles of enzymology, together with an overview of the biotechnological applications of enzymes. It is important to understand the relationship between proteins and the nucleic acids (DNA and RNA) that provide the blueprint for the assembly of proteins within the cell. Genetic engineering is thus predominantly concerned with modifying the proteins that a cell contains, and genetic defects (in medicine) generally relate to the abnormalities that occur in the proteins within cells. Much of the molecular age of biochemistry is therefore very much focused on the study of the cell, its enzymes and other proteins, and their functions.


    Assista o vídeo: Biologia - klasa 1 LO SP. Regulacja aktywności enzymów (Janeiro 2022).