Em formação

7.16A: Detecção de microorganismos não cultivados - Biologia


Usando a metagenômica, os constituintes microbianos do mundo podem ser identificados pelo cultivo de cada espécie individual.

OBJETIVOS DE APRENDIZADO

Reconhecer os métodos usados ​​para detectar microorganismos não cultivados

Pontos chave

  • Muitos organismos que podem causar doenças não são cultiváveis, portanto, uma cultura unicelular não pode ser obtida.
  • Os estudos iniciais da fauna microbiana mostraram que eles são mais diversos do que o esperado e continham muitos micróbios que não eram cultiváveis.
  • Os avanços nas técnicas de biologia molecular permitem o sequenciamento de todos ou pelo menos muitos dos genomas de micróbios encontrados em uma amostra.

Termos chave

  • sequenciamento de espingarda: Técnica de sequenciamento de DNA em que um grande número de pequenos fragmentos de uma longa fita de DNA são gerados aleatoriamente, sequenciados e remontados para formar uma sequência da fita original.
  • cultivável: Capaz de ser cultivado (cultivado em ambiente adequado).
  • sequenciamento de alto rendimento: Tecnologias que paralelizam o processo de sequenciamento, produzindo milhares ou milhões de sequências de uma vez.

A identificação de bactérias em laboratório é particularmente relevante na medicina, onde o tratamento correto é determinado pelas espécies bacterianas que causam a infecção. Consequentemente, a necessidade de identificar patógenos humanos foi um grande impulso para o desenvolvimento de técnicas de identificação de bactérias.

Os primeiros estudos mostraram que a vida microbiana ao nosso redor no ar, no mar e no solo é muito diversa e apenas uma pequena fração das espécies é conhecida. Uma limitação da identificação de patógenos humanos ou sequenciamento convencional começa com uma cultura de células idênticas como fonte de DNA. No entanto, os primeiros estudos metagenômicos revelaram que provavelmente existem grandes grupos de microrganismos em muitos ambientes que não podem ser cultivados e, portanto, não podem ser sequenciados. Esses primeiros estudos se concentraram em sequências de RNA ribossômico 16S que são relativamente curtas, frequentemente conservadas dentro de uma espécie e geralmente diferentes entre as espécies. Foram encontradas muitas sequências de rRNA 16S que não pertencem a nenhuma espécie de cultura conhecida, indicando que existem numerosos organismos não isolados por aí. Essas pesquisas de genes de RNA ribossômico (rRNA) retirados diretamente do ambiente revelaram que métodos baseados em cultivo encontram menos de 1% das espécies bacterianas e de archaea em uma amostra.

A descoberta dessa diversidade levou ao campo da metagenômica, que é o estudo dos metagenomas, material genético recuperado diretamente de amostras ambientais. Em vez de cultivar um micróbio, essa abordagem pega uma amostra e identifica as diferentes espécies, sequenciando todas as espécies simultaneamente. No entanto, a recuperação de sequências de DNA maiores do que alguns milhares de pares de bases de amostras ambientais era muito difícil até os avanços recentes nas técnicas de biologia molecular. Mais especificamente, a construção de bibliotecas em cromossomos artificiais bacterianos (BACs) proporcionou melhores vetores para clonagem molecular.

Os avanços na bioinformática, os refinamentos da amplificação do DNA e a proliferação do poder computacional ajudaram muito na análise de sequências de DNA recuperadas de amostras ambientais. Esses avanços permitiram a adaptação do sequenciamento shotgun para amostras metagenômicas. A abordagem, usada para sequenciar muitos microrganismos cultivados e o genoma humano, corta o DNA aleatoriamente, sequencia muitas sequências curtas e as reconstrói em uma sequência de consenso.

Sequenciamento Shotgun e triagens de bibliotecas de clones revelam genes presentes em amostras ambientais. Isso pode ser útil para compreender a ecologia de uma comunidade, especialmente se várias amostras forem comparadas entre si. Isso foi seguido por um sequenciamento de alto rendimento, que fez o mesmo processo do sequenciamento shotgun, mas em uma escala muito maior em termos da quantidade de DNA que poderia ser sequenciado de uma amostra. Isso fornece informações sobre quais organismos estão presentes e quais processos metabólicos são possíveis na comunidade. Usando a metagenômica e o sequenciamento resultante de micróbios não cultivados, a metagenômica tem o potencial de avançar o conhecimento em uma ampla variedade de campos. Também pode ser aplicado para resolver desafios práticos na medicina, engenharia, agricultura e sustentabilidade.


Catabolismo e interações de organismos não cultivados moldados pela eco-termodinâmica em bioprocessos metanogênicos

A compreensão atual do ciclo do carbono em ambientes metanogênicos envolve interações tróficas, como interespécies H2 transferência entre organotróficos e metanógenos. No entanto, muitos processos metabólicos são termodinamicamente sensíveis ao H2 acumulação e pode ser inibida por H2 produzido a partir de metabolismos coocorrentes. Estratégias para direcionar metabolismos termodinamicamente competitivos em ambientes metanogênicos permanecem inexploradas.

Resultados

Para descobrir como os anaeróbios combatem este H2 conflito in situ, empregamos metagenômica e metatranscriptômica para revisitar um modelo de ecossistema que inspirou muitas descobertas fundamentais em ecologia anaeróbia - biorreatores metanogênicos. Por meio da análise de 17 digestores anaeróbios, recuperamos 1.343 genomas de alta qualidade montados em metagenoma e perfis de expressão gênica correspondentes para linhagens não cultivadas abrangendo 66 filos e reconstruímos suas capacidades metabólicas. Descobrimos que diversas populações não cultivadas podem conduzir H2- metabolismos sensíveis por meio de (i) acoplamento metabólico com H simultâneo2- catabolismo tolerante, (ii) renunciando a H2 geração em favor da transferência entre espécies de formato e elétrons (mediada por citocromo e pili) para evitar conflito termodinâmico, e (iii) integração de O de baixa concentração2 metabolismo como um coletor de elétrons auxiliar na melhoria da termodinâmica. As populações de arquea apoiam esses processos por meio de metabolismos metanogênicos únicos - H altamente favorável2 oxidação conduzida por metanogênese redutora de metila e captação tripartida de formato, elétrons e acetato.

Conclusão

A integração de ômicas e eco-termodinâmica revelou comportamento negligenciado e interações de organismos não cultivados, incluindo acoplamento de metabolismos favoráveis ​​e desfavoráveis, mudando de H2 para transferência de formato, respirando baixa concentração de O2, realizando transferência direta de elétrons entre espécies e interagindo com alto H2-metanogênese de afinidade. Essas descobertas lançam luz sobre como os microrganismos superam um obstáculo crítico nos ciclos do carbono metanogênico que até então havíamos desconsiderado e fornecem uma visão fundamental sobre a ecologia microbiana anaeróbia.


Resumo

Bancos de dados de sequências publicamente disponíveis do gene da pequena subunidade do RNA ribossômico, também conhecido como 16S rRNA em bactérias e arquéias, estão crescendo rapidamente e o número de entradas atualmente ultrapassa 4 milhões. No entanto, uma classificação unificada e estrutura de nomenclatura para todas as bactérias e arqueas ainda não existe. Neste artigo de análise, propomos limites taxonômicos racionais para altos táxons de bactérias e arquéias com base nas identidades da sequência do gene 16S rRNA e sugerimos uma justificativa para a circunscrição de táxons não cultivados que seja compatível com a taxonomia de bactérias e arquéias cultivadas. Nossas análises mostram que apenas sequências de rRNA 16S quase completas fornecem medidas precisas de diversidade taxonômica. Além disso, nossas análises sugerem que a maioria das sequências de rRNA 16S dos táxons elevados será descoberta em levantamentos ambientais no final da década atual.


Nova perspectiva sobre a divisão filogenética bacteriana não cultivada OP11

Organismos pertencentes à divisão filogenética candidata OP11 de Bactérias foram detectados apenas em pesquisas de sequências baseadas em rRNA de amostras ambientais. Estudos preliminares indicaram que tais organismos representados pelas sequências são abundantes e difundidos na natureza e altamente diversificados filogeneticamente. Para documentar mais detalhadamente a amplitude filogenética e a distribuição ambiental desse grupo diverso de organismos, conduzimos análises moleculares adicionais em DNAs ambientais. Usando técnicas de PCR e primers direcionados para cada uma das cinco subdivisões descritas de OP11, pesquisamos 17 DNAs ambientais e analisamos sequências de genes de rRNA em 27 bibliotecas clonais de 14 ambientes. Noventa e nove sequências novas e únicas foram determinadas completamente e aproximadamente 200 clones adicionais foram submetidos a sequenciação parcial. Extensas comparações filogenéticas das novas sequências com aquelas que representam outras divisões bacterianas resolveram ainda mais a filogenia da divisão candidata bacteriana OP11 e identificaram duas novas divisões bacterianas candidatas, derivadas de OP11 1 (OD1) e Rio Sulphur 1 (SR1). A ampla distribuição ambiental de representantes das divisões bacterianas OD1, OP11 e SR1 sugere papéis biogeoquímicos potencialmente conspícuos para esses organismos em seus respectivos ambientes. As informações sobre a distribuição ambiental oferecem pistas para tentativas de cultura representantes de marcos dessas novas divisões bacterianas, e as sequências são assinaturas moleculares específicas que fornecem para sua identificação em outros contextos.

Bonecos

Árvore de consenso de bootstrap mostrando o ...

Árvore de consenso de bootstrap mostrando as relações filogenéticas bem suportadas para as divisões bacterianas OP11, ...


Desnitrificação conduzida por sulfeto: detecção de microrganismos ativos em culturas de enriquecimento em lote alimentado por sondagem de isótopos estáveis ​​de DNA

Uma comunidade microbiana foi enriquecida no compartimento anóxico de um biorreator em escala piloto operado por 180 dias, alimentado com esgoto e destinado à remoção de matéria orgânica, nitrogênio e sulfeto por acoplamento de digestão anaeróbia, nitrificação e desnitrificação mixotrófica. A desnitrificação ocorreu com doadores de elétrons endógenos, principalmente sulfeto e matéria orgânica residual, provenientes do compartimento anaeróbio. Os microrganismos envolvidos na desnitrificação com sulfeto como doador de elétrons foram identificados por sondagem de isótopos estáveis ​​de DNA com CO marcado com [U-13 C]2 e NaHCO3. A desnitrificação completa ocorreu a cada dois dias, e o NO aplicado3 A razão - / S 2− foi de 1,6. Bactérias pertencentes ao Sulfurimonas denitrificans foi identificado como um desnitrificador quimioautotrófico, e aqueles relacionados com Georgfuchisa toluolica, Geothrix fermentans e Ferritrophicum radicicola foram provavelmente associados à desnitrificação heterotrófica usando células endógenas e / ou metabólitos intermediários. Este estudo mostrou que o DNA-SIP foi uma técnica adequada para identificar a microbiota ativa envolvida na desnitrificação por sulfeto em um ambiente complexo, o que pode contribuir para melhorar o projeto e operação de biorreatores visando a remoção de carbono-nitrogênio-enxofre.


DISCUSSÃO

Estudos moleculares independentes de cultura sugeriram uma relação entre a microbiota intestinal e doença inflamatória intestinal 7, 11, alergias 8, 10 e obesidade 9, 12. Como as funções de muitos genes presentes em bancos de dados de sequência são indefinidas ou anotadas incorretamente, os dados metagenômicos por si só não representam todas as bactérias intestinais cultivadas. O cultivo de bactérias até então não cultivadas, que compreendem mais de 70% das bactérias intestinais 4, irá expandir nossas capacidades para realizar estudos microbiológicos mais abrangentes (por exemplo, análise de bioatividade de espécies individuais e estudos usando isolados em animais gnotobióticos). Esses estudos fornecerão informações mais detalhadas sobre as relações entre a microbiota intestinal e as doenças humanas. Portanto, o desenvolvimento de métodos de cultura que superem todas as limitações dos métodos de cultura convencionais é fundamental para o avanço da pesquisa microbiana.

A cocultura com outras bactérias usando um filtro de membrana pode resultar no fornecimento de vários fatores de crescimento desconhecidos que são criticamente importantes para o crescimento celular 25.

Comparado com meio ágar 1,5%, ágar mole contribui para manter as condições ideais de crescimento porque as moléculas se difundem mais rapidamente no último. Por exemplo, o corante azul de metileno difunde-se mais rapidamente em meio de ágar 0,4% do que em ágar 1,5% (dados não mostrados). Portanto, os fatores de crescimento fornecidos por uma cepa de suporte podem atingir a cepa alvo mais rápido em ágar mole do que em meio de placa sólida. Além disso, produtos metabólicos e substâncias secretadas podem ser removidos mais rapidamente, o que reduz a inibição induzida por metabólitos do crescimento e da atividade das bactérias 26. Além disso, as bactérias em meio de ágar mole podem formar colônias únicas e são mais fáceis de isolar.

Este sistema é simples e pode ser fácil e economicamente aplicado a instrumentação convencional e várias condições de cultura (por exemplo, culturas aeróbicas e anaeróbicas).

A composição de nutrientes do meio TYG é mais simples do que a dos meios de cultura convencionais ricos em nutrientes, podendo induzir desequilíbrio metabólico e matar uma proporção de bactérias 27. Em contraste, os meios de cultura mais convencionais (por exemplo, meio EG) usados ​​para isolar bactérias intestinais contêm vários açúcares, extrato de carne, sangue, vitaminas e ácidos graxos para promover o crescimento celular 19, 28, 29. No entanto, o intestino delgado absorve a maioria dos nutrientes dos alimentos digeridos, os nutrientes restantes sendo responsáveis ​​por apenas 6–7% do conteúdo do intestino grosso. Portanto, as condições nutricionais reais fornecidas pelo alimento digerido no intestino humano são provavelmente inadequadas para que a microbiota intestinal prospere sem simbiose, mutualismo, comensalismo ou uma combinação de todos eles. Por exemplo, mais de 70% das contagens de colônias de uma cultura de fezes de 14 dias em ágar EG foram obtidas após 2 dias de incubação. Embora este meio acelere o crescimento de certas bactérias, ele pode complementar artificialmente as substâncias originalmente fornecidas por outras bactérias no intestino humano. Assim, as interações interbacterianas não detectadas de isolados do ágar EG são provavelmente atribuíveis a substâncias reabastecidas necessárias para a simbiose.

Em contraste, as contagens de colônias no ágar TYG continuaram a aumentar ao longo de 14 dias. As lacunas no crescimento bacteriano ocorrem, segundo consta, em estudos de alimentação cruzada simbiótica de Bifidobacterium espécies e bactérias produtoras de ácido butírico 17, 18. Em um meio contendo fruto-oligossacarídeos como única fonte de energia, Bifidobacterium as cepas funcionam como utilizadoras de substrato, crescem primeiro e são então substituídas por bactérias produtoras de butirato que degradam substratos, metabólitos ou ambos (por exemplo, lactato). Considerando esses relatórios e a transição das contagens de colônias nas placas EG e TYG, supomos que a discrepância no tempo de crescimento bacteriano detectado aqui pode indicar interações interbacterianas semelhantes à alimentação cruzada observada entre cepas que crescem rápida ou lentamente em ágar TYG. Especificamente, a composição de nutrientes menos complexa do ágar TYG pode facilitar a detecção de interações interbacterianas e prevenir a morte bacteriana causada por desequilíbrio metabólico.

Para avaliar esta hipótese, nós co-cultivamos colônias vizinhas em placas de ágar TYG. Usando co-cultivo de filtro, Parabacteroides sp. BL157, que é difícil de cultivar, cresceu e foi isolado. Além disso, detectamos interações entre Parabacteroides sp. BL157 e K. pneumoniae BL175, bem como entre Sutterella sp. BL252 e B. fragilis BL539. Especificamente, descobrimos que o crescimento de Parabacteroides sp. BL157 foi acelerado pelo crescimento da vizinhança K. pneumoniae BL175 e que o crescimento de B. fragilis BL539 dependia parcialmente da presença de Sutterella sp. BL252.

O crescimento de Parabacteroides sp. BL157 e B. fragilis BL539 foi apoiado por K. pneumoniae BL175 e Sutterella sp. BL252 no entanto, os detalhes da interação entre Parabacteroides sp. BL157 e K. pneumoniae BL175, e entre B. fragilis BL539 e Sutterella sp. BL252 não são definitivos, um estudo adicional é necessário. Certas interações interbacterianas são mediadas por metabólitos bacterianos. Por exemplo, sobrenadantes de um Bacilo tensão acelera o crescimento de S. thermophilum 15 Além disso, os sobrenadantes de Sphingomonas spp. apoiar o crescimento de Catellibacterium nectariphilum 30 Além disso, Porphyromonas gingivalis cresce na cavidade oral ao utilizar ácido succínico gerado por Treponema denticola, e T. denticola utiliza ácido isobutírico gerado por P. gingivalis 31 Aqui um Parabacteroides sp. BL157 /B. fragilis A colônia BL539 cresceu perto, mas não se sobrepôs a um K. pneumoniae BL175 /Sutterella sp. Colônia BL252, sugerindo que eles se comunicam por meio de substâncias geradas por cepas de suporte. Além disso, foi relatado que ambos B. fragilis e K. pneumoniae produzem autoindutor-2, uma molécula de sinalização interespecífica que está relacionada ao quorum sensing e à formação de colônias de biofilme 32, 33. Portanto, a sinalização interespecífica também pode estar relacionada às interações interbacterianas detectadas nesses estudos.

Phascolarctobacterium sp. BL377, que foi inicialmente colonizado neste estudo, não pode ser subcultivado em monocultura na presença de um meio altamente estimulador de crescimento (isto é, meio EG). Aqui encontramos que B. dorei BL376 e outro Bacteroides cepas apoiaram o crescimento de Phascolarctobacterium sp. BL377. o Bacteroides as cepas examinadas neste estudo geraram ácido succínico como metabólito (dados não mostrados). Além disso, alguns dos Phascolarctobacterium espécies alegadamente utilizam ácido succínico 34, 35. Portanto, substância (s) comum (s) gerada (s) pela Bacteroides espécies estudadas aqui (por exemplo, succinato) também podem influenciar o crescimento de BL377.

Embora a comunicação interbacteriana complexa entre bactérias intestinais tenha sido sugerida por uma pesquisa genômica que não envolveu cultura 16, há pouca informação sobre a dependência de crescimento múltiplo de bactérias intestinais viáveis. No presente estudo, o crescimento de B. fragilis, que promoveu o crescimento de Phascolarctobacterium sp. BL377, foi estimulado por Sutterella sp. BL252, sugerindo que as interações interbacterianas de várias etapas de bactérias intestinais viáveis ​​ocorreram no sistema de cocultura descrito aqui.

Embora o nome dos isolados nesses estudos tenha sido selecionado com base na homologia de sequências de 16 S rRNA, a homologia de sequências de genes de 16 S rRNA sugere que as cepas BL157, BL252 e BL377 provavelmente representam novos gêneros ou espécies. Assim, o nome desses isolados deve ser alterado para denotar novas espécies. Assim, a proposição de designar sistematicamente esses isolados como novas espécies está em andamento.

Usando a técnica de co-cultivo projetada aqui, conseguimos isolar várias bactérias intestinais dependentes do crescimento. No entanto, essa técnica requer otimização adicional, possivelmente usando cultura de multicamadas, cultura de vários poços de alto rendimento e replicando o complexo ecossistema do intestino. Uma pista para resolver esses problemas pode ser encontrada em outros métodos de cultivo inovadores 21-24. Assim, uma combinação deste sistema de filtro e outros métodos avançados resultará em uma abordagem poderosa para o cultivo e para a compreensão da ecologia de bactérias até então não cultivadas.


Notas de rodapé

Contribuições dos autores: Y.H. e V.K.S. contribuíram igualmente para este trabalho Y.H., Y.S., A.T., M.H. e M.O. pesquisa projetada Y.H. e A.T. realizou pesquisas Y.H., V.K.S., T.P., S.N. e A.T. dados analisados ​​e Y.H., T.D.T., T.K., M.H. e M.O. escreveu o jornal.

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Deposição de dados: as sequências relatadas neste documento foram depositadas no DNA Data Bank of Japan [acessos nos. AP009510 (cromossomo), AP009511–3 (plasmídeos) e AB360878 – AB360905 (outros)].


2. Materiais e métodos

2.1 Procedimento de Amostragem

O local de amostragem, a região de Diyarbakır, está localizado na fronteira da placa da Anatólia e a região petrolífera do Oriente Médio no sudeste da Turquia. Um total de 20 amostras de petróleo bruto (B1, B6, B8, B14, B23, B32, B56, GK8, GS6, GS15, M3, K2, K3, K32, K35, K44, S4, S15, Y18 e Y30) consistindo em uma mistura de óleo / água foi coletada dos poços de produção dos campos de petróleo de Diyarbakır (figura 1) Esses poços produziram óleos retirados dos depósitos de arenito de óleo (profundidades de 1600 m a 2620 m, densidade API de 24,3 ° a 42,3 °, conteúdo de água em torno de 94%, um pH médio de 7,0 e salinidade de 2966 mg l -1 a 26.961 mg l -1). As amostras foram retiradas assepticamente na cabeça do poço e colocadas em frascos de soro estéreis de 500 ml selados com rolhas de borracha e cápsulas de alumínio. As amostras foram enviadas à temperatura ambiente. Ao chegar ao laboratório, as amostras foram imediatamente analisadas. Todas as amostras foram tratadas em até 48 horas após a coleta. A decantação foi usada para separar a água produzida da mistura óleo / água.

Figura 1.

Locais de amostragem na região de Diyarbakır. Amostras de água produzidas foram coletadas de 20 poços de petróleo diferentes © Maphill / Creative Commons Attribution-NoDerivatives (CC BY-ND)

2.2 Extração de DNA

As bactérias nas amostras de água produzidas foram coletadas por filtração em filtros de poliamida com tamanho de poro de 0,20 μm (Sartolon ®, Sartorius AG, Alemanha). O DNA genômico foi extraído com o kit de isolamento UltraClean ® Microbial DNA (MO BIO Laboratories Inc, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante.

2.3 Amplificação da reação em cadeia da polimerase

O DNA extraído foi usado como molde para a amplificação por PCR de fragmentos parciais de rRNA 16S. Par de primer consistindo em 341F com um clamp GC e 907R foi usado para análise DGGE (26). Uma pinça GC de 40 bases foi usada para prevenir a desnaturação completa do fragmento durante DGGE (27).

Devido ao baixo rendimento de DNA, foi utilizada uma estratégia de PCR em duas etapas. Na primeira etapa, uma abordagem de PCR em tempo real (PCR quantitativo, qPCR) foi aplicada às amostras de água produzidas. A mistura de reação em um volume final de 22,5 μl continha 0,2 μl de cada primer, 12,5 μl iQ TM SYBR ® Green Supermix (Bio-Rad Laboratories Inc, EUA), 9,6 μl de água livre de RNase (Qiagen, Alemanha) e 0,5 μl de DNA modelo. qPCR foi realizada em iCycler iQ TM Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories Inc, EUA) usando as seguintes condições: 5 min a 95 ° C 40 ciclos de 95 ° C por 30 s, 57 ° C por 40 s, 72 ° C por 40 se 80 ° C por 25 se um final de 72 ° C por 10 min. No método qPCR, após cada ciclo, um sinal era formado. Ao observar os sinais de cada amostra, os produtos de PCR puderam ser detectados. A reação foi terminada quando a quantidade desejada de produto foi alcançada. Na segunda etapa, uma abordagem convencional de PCR foi aplicada aos produtos qPCR. A mistura de reação em um volume final de 25 μl continha 0,2 μl de cada primer, 12,5 μl Taq PCR Master Mix (Qiagen, Alemanha), 9,6 μl de água livre de RNase (Qiagen, Alemanha) e 0,5 μl de modelo de DNA. A PCR foi realizada em termociclador TGradient (Biometra, Alemanha) usando as seguintes condições: 5 min a 95 ° C 12 ciclos de 95 ° C por 30 s, 57 ° C por 40 se 72 ° C por 40 se um final de 74 ° C por 30 min.

2.4 Eletroforese em Gel de Gradiente de Desnaturação

O sistema DCode TM (Bio-Rad Laboratories, EUA) foi usado para a análise DGGE. 25 μl de cada produto de PCR (200–300 ng) foram carregados em géis de poliacrilamida 6% (p / v) contendo gradientes de 20% a 70% desnaturantes (ureia / formamida). Os géis foram corridos durante 16 h a 100 V e 60 ° C em tampão 1 × Tris-acetato-EDTA. Após a conclusão da eletroforese, os géis foram corados com SYBR ® Gold Nucleic Acid Gel Stain (Invitrogen TM, Thermo Fisher Scientific, EUA) por 20 min, visualizados e fotografados. As bandas DGGE predominantes selecionadas foram excisadas, eluídas em 40 μl de tampão Tris 1 × (pH 8) por 2 d a 4 ° C e re-amplificadas com 25 ciclos, conforme descrito acima. A mistura de reação em um volume final de 25 μl continha 0,125 μl de primer 341F, 0,125 μl de primer 907R, 12,5 μl de Taq PCR Master Mix, 9,75 μl de água ultra pura e 0,5 μl de modelo. Os produtos de PCR foram quantificados em gel de agarose 1,5% (p / v) e sequenciados pela Macrogen Inc (Seul, Coréia do Sul).

2.5 Análise de Sequência Comparativa

As sequências resultantes foram primeiro alinhadas e editadas usando o software CodonCode Aligner (CodonCode Corp, EUA). Em seguida, foram comparadas às sequências armazenadas no banco de dados GenBank ® por meio da ferramenta Basic Local Alignment Search Tool (BLAST ®) do National Center for Biotechnology Information (NCBI) (28, 29). Todas as sequências do gene 16S rRNA parciais obtidos foram depositados na base de dados GenBank ® sob os seguintes números de acesso: KF720792 - KF720796, KF720798, KF720801 - KF720802, KF720804, KF720806 - KF720808, KF720810 - KF720811, KF720814, KF720818, KF720820, KF720823, KF720825 - KF720826 , KF720828, KF720830 - KF720832, KF720839, KF720844, KF720852, KF720855, KF720858, KF720872, KF720877, KF720882 - KF720884, KF720886 - KF720889, KF720891, KF720893 - KF720894, KF720896 e KF720903.


Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Nikolai Chernych por sua assistência técnica durante o isolamento e purificação do DNA metagenômico. Agradecemos também ao Instituto Conjunto do Genoma do Departamento de Energia por sequenciar os metagenomas.

Financiamento

CDV e GM foram apoiados pelo ERC Advanced Grant PARASOL (no. 322551). A-SA e RG foram apoiados pela bolsa de pesquisa 17-04828S da Grant Agency da República Tcheca. MM foi apoiado pela Academia de Ciências Tcheca (programa de pós-doutorado PPPLZ número de inscrição L200961651). O DYS foi apoiado pelo Programa SIAM / Gravitation (Ministério da Educação e Ciência da Holanda, bolsa 24002002) e pela Russian Science Foundation (bolsa 16–14-00121). O sequenciamento foi realizado pelo Instituto do Genoma Conjunto do Departamento de Energia dos EUA, um DOE Office of Science User Facility, como parte do Programa de Sequenciamento da Comunidade (contrato no. DE-AC02-05CH11231).

Disponibilidade de dados e materiais

As leituras de sequência bruta dos cinco metagenomas foram depositadas no Arquivo de leitura de sequência NCBI (consulte o arquivo adicional 1: Tabela S6 para números de acesso e estatísticas de leitura e contig). Os 871 MAGs finais descritos neste documento foram depositados como projetos Whole Genome Shotgun em DDBJ / EMBL / GenBank, e os números de acesso estão listados no arquivo adicional 4 (BioProject ID PRJNA434545). Todas as versões descritas neste documento são a versão XXXX01000000. Os conjuntos de dados de sequência de amplicons limpos e desreplicados estão disponíveis em FigShare (https://figshare.com/s/7684627445e3621aba24). Árvores de máxima verossimilhança com base no alinhamento concatenado de 16 proteínas ribossômicas, com base nas Figs. 2 e 3, em formato newick (arquivo .tre) e conjuntos de dados complementares (usados ​​para traçar completude, contaminação, tamanho de recuperação do genoma, G + C mol% e RPKG em iTOL), bem como K atribuições de número para as proteínas previstas de todos os MAGs (KEGG-orthologues, Ghost Koala) e os MAGs CPR totalmente anotados que apoiam as conclusões deste artigo também estão disponíveis em FigShare (https://figshare.com/s/7684627445e3621aba24).


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