Em formação

D6. Estudo do Interactome - Biologia


Sistema Híbrido de Levedura Dois

Os fatores de transcrição devem fazer mais do que se ligar a alvos a montante (elementos de resposta) no DNA. Este método de dois híbridos de levedura permitiu a determinação de parceiros de ligação de proteínas, parte do que hoje é denominado interatoma.

Figura: Levedura Two-Hybrid

Complementação de fragmento de proteína (PFC) (Tarassov, K. et al)

Um gene que codifica um fragmento de uma enzima repórter, dihidrofolato redutase (DHFR), é fundido a um gene para uma proteína isca e inserido em um plasmídeo. Um segundo gene que representa o segundo fragmento de uma enzima repórter está ligado a possíveis genes de proteínas alvo. Em uma célula transformada com ambos os plasmídeos, o gene repórter exibirá atividade enzimática apenas se a proteína isca traduzida se ligar a uma proteína alvo traduzida, permitindo que os dois fragmentos da enzima interajam e se dobrem coletivamente em uma atividade enzimática ativa holo. O gene repórter era um mutante de DHFR resistente a um inibidor, o metotrexato. A atividade DHFR funcional leva ao crescimento celular na presença de metotrexato.

Figura: Complementação de Fragmento de Proteína

Purificação de afinidade em tandem (TAP) (Rigaut, G. et al)

Um método genérico de purificação de proteínas para caracterização de complexos de proteínas e exploração de proteomas. Nature Biotechnology 17. 1030 (1999): Um gene para uma proteína isca está ligado sequencialmente a genes que codificam duas tags separadas, uma para a Proteína A (que se liga à imunoglobulina G - IgG) e um peptídeo de ligação à calmodulina (que se liga à proteína calmodulina em um processo que requer cálcio. Entre os genes para os dois marcadores está uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo ligante curto e sensível à protease. A construção do gene é introduzida na levedura e a expressão é induzida. As células são lisadas e o extrato aplicado a esferas de cromatografia de afinidade contendo covalentemente IgG ligada, que se liga à etiqueta da Proteína A. Após lavagem extensiva, a proteína isca ligada, com as proteínas alvo associadas, é eluída por proteólise do ligante peptídico. O eluato é aplicado a uma segunda coluna de afinidade contendo calmodulina ligada covalentemente. Após a lavagem, o armadilha e proteínas alvo associadas são eluídas com um quelante de cálcio (EGTA ou EDTA) como a interação de calmodulina com a segunda etiqueta, calmodulina peptídeo de ligação, requer cálcio. As proteínas alvo eluídas podem ser identificadas por 2D PAGE ou espectrometria de massa.

Figura: Purificação de Afinidade em Tandem

Uma comparação recente dos métodos Y2H, PFC e TAP foi feita (Jensen, L. e Bork, 2008; Yu, H et al, 2008). Não inesperadamente, o Y2H foi o melhor na determinação de interações de proteínas nucleares, o TAP para proteínas citoplasmáticas e abundantes e PFC para proteínas transmembrana. Todos sofrem um pouco na identificação de complexos de proteínas transitórios.


Projetos Interactome no CCSB

O mapeamento de H uman interactome é o projeto carro-chefe do CCSB. Um primeiro mapa do interactoma binário humano (Rual et al Nature 2005) foi obtido por triagem de dois híbridos de levedura (Y2H) para interações binárias diretas dentro de uma matriz "Espaço I" de

8.000 x 8.000 ORFs contidos no ORFeome humano v1.1 (Rual et al Genome Res 2004). Desenvolvemos uma estrutura empírica que mede quantitativamente os parâmetros de integridade de triagem, sensibilidade do ensaio, sensibilidade de amostragem e precisão, e usamos essa estrutura para estimar o tamanho do interactoma binário humano como

130.000 ± 32.000 interações binárias (Venkatesan et al Métodos Nat 2009). Usando uma nova estratégia de sequenciamento de última geração para identificar pares de interação (Yu et al Métodos Nat 2011), realizamos uma tela Y2H para interações dentro de uma matriz "Espaço II" de

13.000 x 13.000 ORFs contidos no ORFeome humano v5.1. Relatamos

14.000 novas interações binárias diretas (Rolland et al Cell 2014), trazendo o número total de interações binárias exclusivas para

Os vírus dependem intrinsecamente de sua célula hospedeira durante o curso da infecção e podem desencadear fenótipos patológicos semelhantes aos decorrentes de mutações (Gulbahce et al PLoS Comput Biol 2012). Aplicamos um pipeline integrado sistemático para investigar perturbações em escala de genoma de redes de interação do hospedeiro induzidas por produtos de genes individuais codificados por membros de quatro famílias funcionalmente relacionadas, mas biologicamente distintas, de vírus de tumor de DNA: polimavírus, papilomavírus, adenovírus e Epstein-Barr vírus (Rozenblatt-Rosen et al Nature 2012). Por meio de dois híbridos de levedura, rastreamos 123 ORFs virais contra

13.000 ORFs humanos, obtendo 454 interações binárias validadas entre 53 proteínas virais e 307 proteínas alvo humanas. Por purificação de afinidade em tandem seguida por espectrometria de massa (TAP-MS), mapeamos reprodutivelmente 3.787 associações de co-complexo viral-hospedeiro envolvendo 54 proteínas virais e os produtos de 1.079 genes hospedeiros identificados de forma inequívoca. mais

As plantas têm características únicas que evoluíram em resposta aos desafios ambientais e ecológicos. Faltam contas das complexas redes celulares que sustentam as funções específicas das plantas. Nós relatamos um mapa de interação proteína-proteína binária de todo o proteoma a partir de um tamanho de espaço de busca de

8.000 x 8.000 ORFs para a rede interactome da planta Arabidopsis thaliana. Este mapa interativo contém

6.200 interações altamente confiáveis ​​entre

2% do total Arabidopsis interactome biofísico binário. mais

W orm Interactome versão 8 contém 3.864 interações proteína-proteína binárias para C. elegans montado a partir da tela de dois híbridos de levedura de alto rendimento WI-2007 (1.816 novas interações relatadas em Simonis et al Métodos Nat 2009) a tela de dois híbridos de levedura de alto rendimento WI-2004 (1.735 interações relatadas em Li et al Science 2004) e um compêndio de dados de telas de dois híbridos de levedura de rendimento médio (554 interações). mais

Y east Interactome versão 1 (CCSB-YI1) contém interações de proteína-proteína de dois híbridos de levedura de alta qualidade para S. cerevisiae. Inclui 1.809 interações entre 1.278 proteínas, compreendendo

10% do interactome binário de levedura completo estimado em

18.000 ± 4.500 interações (Yu et al Science 2008). Para obter um interactome de levedura binário mais abrangente, CCSB-YI1 foi combinado com conjuntos de dados Ito-core e Uetz-screen para produzir a união Y2H, que contém 2.930 interações binárias entre 2.018 proteínas,

20% de todo o interactome binário de levedura. mais

F ragmentoma: Muitas interações proteína-proteína são mediadas por domínios modulares de dobramento independente. Os esforços de todo o proteoma para modelar redes de interatividade necessariamente negligenciaram a organização modular das proteínas. Desenvolvemos uma estratégia experimental de “fragmentação” para identificar de forma eficiente os domínios de interação (Boxem et al Cell 2008). Usamos esta estratégia para gerar uma rede interactome baseada em domínio para proteínas envolvidas em C. elegans divisões celulares embrionárias iniciais.

O Projeto de Mapeamento H uman Interactome é o projeto principal do CCSB. Um primeiro rascunho do mapa "Espaço-I" do interactome humano, que descreve as interações dentro da matriz de 8000x8000 ORFs contidas no Human ORFeome v1.1, foi publicado em 2005 (Rual et al.). Usamos esses dados para desenvolver uma estrutura conceitual que incorpora a integridade da tela, capacidade de detecção do ensaio e saturação da tela para estimar o tamanho do interactoma humano (Venkatesan et al, submetido). Atualmente, o trabalho está em andamento para mapear o espaço II (12kx12k) e III (16k x 16k) do interactoma humano com cobertura tripla.

C hlamydomonas reinhardtii é um promissor organismo de "bioenergia", capaz de produzir gás hidrogênio e outros recursos de "biocombustível". Neste projeto financiado pelo GTL do Departamento de Energia, estamos: i) verificando e definindo experimentalmente as estruturas de transcrição de

2.000 genes relacionados metabolicamente e clonagem de suas estruturas de leitura aberta (ORF) ii) identificação de interações proteína-proteína entre os produtos de genes metabólicos e iii) construção de mapas de interação de proteínas e redes metabólicas que, em última instância, permitirão o desenvolvimento de previsões testáveis ​​de C. reinhardtii fisiologia, incluindo a letalidade do gene e taxas de crescimento sob condições ambientais definidas. mais


BioPlex Interactome

O genoma humano codifica instruções para fazer aproximadamente 20.000 proteínas diferentes & ndash no agregado, o proteoma & ndash cujas atividades medeiam a maioria dos processos biológicos em ambos os níveis celular e orgânico. O proteoma pode ser visto como constelações de proteínas em interação que se reúnem para formar uma miríade de complexos, compartimentos e vias de transdução de sinal que organizam proteínas individuais de acordo com a função biológica compartilhada. Assim, compreender o interactome & ndash o conjunto completo de interações proteína-proteína humana e as condições em que ocorrem & ndash será essencial para o desenvolvimento de uma compreensão de nível de sistema da célula humana.

Desde 2012, temos traçado o perfil de interações de proteínas em células humanas por meio de espectrometria de massa de purificação por afinidade e analisando sistematicamente as interações para todas as proteínas humanas acessíveis em escala de proteoma. Aproveitando os clones disponíveis no ORFeome humano (v. 8.1) desenvolvido por Marc Vidal e David Hill no Dana Farber Cancer Center, temos expressado versões marcadas com HA-FLAG C-terminal de cada proteína humana para imunopurificação e LC-MS identificação de parceiros de ligação. Em seguida, combinamos esses perfis de interação aos milhares para criar uma série de modelos do interativo humano em escala cada vez maior. Enquanto o primeiro, BioPlex 1.0, incluído

24.000 interações entre 8.000 proteínas (Célula 2015), BioPlex 2.0 cobertura expandida para

57.000 interações entre 11.000 proteínas (Natureza 2017). O mais recente, BioPlex 3.0, inclui quase 120.000 interações entre cerca de 15.000 proteínas e é o modelo derivado experimentalmente mais abrangente do interactoma humano até o momento (Célula 2021). Como a posição de cada proteína na rede reflete sua localização subcelular, função biológica e associação com doenças, essas redes têm sido ferramentas poderosas para o estudo de milhares de proteínas não caracterizadas. Eles também forneceram uma miríade de insights sobre a modularidade e a organização do interatividade.

Como as interações de proteínas dependem do contexto, agora estamos traçando sistematicamente as interações de proteínas em várias linhas de células, além das células 293T. Mais recentemente, lançamos uma rede complementar resultante de AP-MS de 5.522 iscas em células HCT116 (Célula 2021). Abrangendo 71.000 interações entre 10.531 proteínas, esta segunda rede em escala de proteoma complementa nossa rede 293T e revela uma remodelação específica de célula significativa. Com base nesses resultados empolgantes, agora estamos trabalhando para concluir

10.000 IP & # 8217s em células HCT116 e nos próximos anos criarão redes de interação adicionais específicas de linha celular. Volte aqui frequentemente para atualizações!

O projeto BioPlex é uma colaboração entre os laboratórios Gygi e Harper dentro do Departamento de Biologia Celular no Harvard Medical School e é liderado por Ed Huttlin, Wade Harper, e Steve Gygi. A cultura de células e os pipelines de bioquímica são dirigidos por Laura Pontano Vaites. O site BioPlex foi desenvolvido por Devin Schweppe.


A análise do interactoma do citomegalovírus humano identifica centros de degradação, associações de domínio e funções de proteínas virais

O citomegalovírus humano (HCMV) modula extensivamente as células hospedeiras, regulando negativamente & gt900 proteínas humanas durante a replicação viral e degradando ≥133 proteínas logo após a infecção. O mecanismo de degradação da maioria das proteínas do hospedeiro permanece não resolvido e as funções de muitas proteínas virais não estão completamente caracterizadas. Realizamos uma análise de interactoma baseada em espectrometria de massa de proteínas de cepa canônica Merlin expressas de forma estável com 169 marcações e duas proteínas de HCMV não canônicas em células infectadas. Isso identificou uma rede de interações de & gt3400 vírus-hospedeiro e & gt150 vírus-proteína de vírus, fornecendo informações sobre as funções de vários genes virais. A análise de domínio previu a ligação da proteína UL25 viral aos domínios SH3 da proteína-1 adaptadora de NCK. As proteínas de interação viral foram identificadas para 31/133 alvos degradados do hospedeiro. Finalmente, descobriu-se que a proteína ORFL147C não caracterizada e não canônica interage com elementos da maquinaria de splicing do mRNA, e um estudo mutacional sugeriu sua importância na replicação viral. Os dados de interactome serão importantes para estudos futuros de infecção por herpesvírus.

Palavras-chave: biologia computacional interação hospedeiro-patógeno humano citomegalovírus humano evasão imunológica doenças infecciosas microbiologia interação proteína-proteína sistemas de proteômica sistemas de biologia virologia vírus.

Declaração de conflito de interesse

LN, KN, BR, RA, LS, JN, JD, SS, EW, AD, GW, RS, EH, MW Nenhum interesse conflitante declarado

Bonecos

Figura 1 .. Esquema da estratégia de IP.

Figura 1 .. Esquema da estratégia de IP.

Amostras IP foram geradas e analisadas em técnicos…

Figura 1 — figura suplemento 1 .. Mais detalhes de ...

Figura 1 - suplemento da figura 1. Mais detalhes do interactome.

Figura 1 - suplemento de figura 2 .. Mais detalhes de ...

Figura 1 - suplemento da figura 2. Mais detalhes das interações.

( UMA ) Número de HCIPs por ...

Figura 2 .. Análise sistemática de dados interactome ...

Figura 2 .. A análise sistemática de dados de interactome prevê novas funções para proteínas virais.

Figura 2 - figura do suplemento 1 .. Caminhos enriquecidos com ...

Figura 2 - figura do suplemento 1 .. Caminhos enriquecidos com p 33% dos componentes identificados interagiram com ... 0,05 & gt

Figura 2 — figura suplemento 2 .. Mais detalhes de ...

Figura 2 — figura do suplemento 2. Mais detalhes das interações de acordo com a classe temporal da proteína viral.

Figura 3 .. Validação de dados interactome por ...

Figura 3 .. Validação de dados interactome por co-IP.

( UMA ) Co-IPs validando que UL72 ...

Figura 4 .. Interação entre UL25 e NCK1 ...

Figura 4 .. Interação entre UL25 e NCK1 identificada por análise de associação de domínio.

Figura 4 - suplemento de figura 1 .. Dados de interação completos ...

Figura 4 - figura suplementar 1 .. Dados de interação completos para UL25 e UL26, anotados conforme descrito em…

Figura 5 .. UL42 identificado como um hub ...

Figura 5 .. UL42 identificado como um centro de destruição E3 por uma combinação de interactome ...

Figura 5 - suplemento da figura 1 .. Validação da interação ...

Figura 5 - figura do suplemento 1 .. Validação da interação entre UL42 e NEDD4 (painel esquerdo) e NEDD4L…

Figura 6 .. Interatores HCMV ORFL147C funcionam em ...

Figura 6 .. Interatores de HCMV ORFL147C funcionam na ligação, splicing e transcrição de RNA.

Figura 6 - suplemento de figura 1 .. Mais detalhes de ...

Figura 6 - figura do suplemento 1. Mais detalhes das interações ORFL147C e construção do vírus ΔORFL147C.

Figura 7 .. Sobreposição em funções visadas por ...

Figura 7 .. Sobreposição em funções direcionadas por vírus diferentes.

( UMA ) Análise DAVID de ...

50.000 interações isca-presa não filtradas de KSHV para indicar a expressão da proteína (Davis et al., 2015). Posteriormente, as presas interagindo de alta confiança de iscas KSHV e os interatores de primeiro grau dessas presas do interactoma humano foram excluídos (Huttlin et al., 2017), para deixar uma lista de proteínas que interagiam apenas com HCMV. Os valores p ajustados de Benjamini-Hochberg são mostrados para cada caminho. Detalhes completos sobre a interação das proteínas virais e do hospedeiro são fornecidos no arquivo suplementar 7B.


Redes de interação proteína-proteína

Interações proteína-proteína (PPIs) são essenciais para quase todos os processos em uma célula, portanto, compreender os PPIs é crucial para compreender a fisiologia celular em estados normais e de doença. Também é essencial no desenvolvimento de medicamentos, uma vez que os medicamentos podem afetar os IBPs. Redes de interação proteína-proteína (PPIN) são representações matemáticas dos contatos físicos entre as proteínas na célula. Esses contatos:

  • são específicos
  • ocorrem entre regiões de ligação definidas nas proteínas
  • têm um significado biológico particular (ou seja, eles têm uma função específica)

As informações PPI podem representar interações transitórias e estáveis:

  • As interações estáveis ​​são formadas em complexos de proteínas (por exemplo, ribossomo, hemoglobina)
  • As interações transitórias são interações breves que modificam ou carregam uma proteína, levando a mudanças adicionais (por exemplo, proteínas quinases, importinas de poros nucleares). Eles constituem a parte mais dinâmica do interactome

O conhecimento dos PPIs pode ser usado para:

  • atribuir papéis putativos a proteínas não caracterizadas
  • adicionar detalhes refinados sobre as etapas dentro de uma via de sinalização
  • caracterizar as relações entre as proteínas que formam complexos multi-moleculares, como o proteassoma

O interactome

o interagir é a totalidade de PPIs que ocorrem em uma célula, um organismo ou um contexto biológico específico. O desenvolvimento de técnicas de triagem de PPI em grande escala, especialmente purificação de afinidade de alto rendimento combinada com espectrometria de massa e o ensaio de dois híbridos de levedura, causou uma explosão na quantidade de dados de PPI e a construção de interatomas cada vez mais complexos e completos ( Figura 16). Esta evidência experimental é complementada pela disponibilidade de algoritmos de previsão PPI. Muitas dessas informações estão disponíveis em bancos de dados de interação molecular, como o IntAct.

Figura 16 Interactomas de levedura (esquerda) e humanos (direita) obtidos usando o método de dois híbridos de levedura. Imagens reproduzidas com permissão da Macmillan Publishers Ltd: Jeong et al. Nature 2001. 411 (3) e Rual et al. Nature 2005: 437 (4).

É importante enfatizar mais uma vez as limitações dos dados de PPI disponíveis. Nosso conhecimento atual do interactome é tanto incompleto e barulhento. Os métodos de detecção de PPI têm limitações quanto ao número de interações verdadeiramente fisiológicas que podem detectar e todos encontram falsos positivos e negativos.

Nas próximas páginas, daremos uma olhada em algumas das propriedades das redes de interação proteína-proteína e as implicações dessas propriedades para a biologia.


Deuterado 18 F-9-O-hexadeutero-3-fluoropropoxil - (+) - dihidrotetrabenazina (D6-FP - (+) - DTBZ): Um agente de imagem transportador de monoamina vesicular 2 (VMAT2)

Os transportadores vesiculares de monoamina 2 (VMAT2) no cérebro servem como transportadores para empacotar monoamina em vesículas para neurotransmissão normal do SNC. Vários agentes de imagem VMAT2, [11 C] - (+) - DTBZ, dihidrotetrabenazina e [18 F] FP - (+) - DTBZ (9-O-fluoropropil - (+) - dihidro tetrabenazina, também conhecido como [18 F] AV- 133), são úteis para estudar as mudanças na função cerebral relacionadas à transmissão de monoamina por imagem in vivo. Análogos deuterados foram relatados visando locais de ligação VMAT2.

Métodos

Um romance deuterado [18 F] 9-O-hexaduterofluoropropil - (+) - di-hidrotetrabenazina, [18 F] D6-FP - (+) - DTBZ, [18 F]1, foi preparado como um agente de imagem VMAT2. Este agente 18 F que tem como alvo VMAT2 foi avaliado por ligação in vitro, biodistribuição in vivo e estudos de imagem microPET em roedores.

Resultados

A reação de radiomarcação de uma etapa levou ao desejado [18 F] D6-FP - (+) - DTBZ, [18 F]1, que mostrou excelente afinidade de ligação para VMAT2 (Ki = 0,32 ± 0,07 nM) comparável ao de FP - (+) - DTBZ (Ki = 0,33 ± 0,02 nM) usando [18 F] FP - (+) - DTBZ e estriado de rato homogenatos de membrana. A biodistribuição in vivo em ratos normais mostrou que 1, exibiu excelente captação pelo cérebro e alta proporção comparável de estriado para cerebelo (alvo / fundo) em 1 h após a injeção (proporção de 6,05 ± 0,43 vs 5,66 ± 0,72 para [18 F] FP - (+) - DTBZ vs [18 F ]1, respectivamente). Estudos de imagem MicroPET em ratos confirmam ainda que o corpo estriado com alta concentração de VMAT2 foi claramente delineado no cérebro de rato normal após injeção iv de [18 F]1. Observamos pequenas alterações do metabolismo no plasma do rato entre esses dois agentes; no entanto, as alterações mostraram pouco efeito na captação e retenção regional do cérebro.

Conclusões

Os resultados relatados aqui dão suporte para o uso de [18 F] D6-FP - (+) - DTBZ, [18 F]1, como agente de imagem PET in vivo para ligação VMAT2 no cérebro.


A análise de interactoma celular da proteína K7 do vírus vaccinia identifica três máquinas de transporte como parceiros de ligação para K7

A identificação de proteínas que interagem com o hospedeiro viral contribuirá para a compreensão de como o poxvírus explora a maquinaria celular do hospedeiro. O gene K7R do vírus vaccinia codifica uma proteína conservada K7 na maioria dos ortopoxvírus. Para obter informações sobre a biologia de K7, investigamos o interatoma celular de K7 por GST pulldown acoplado com espectrometria de massa. As principais categorias de proteínas identificadas continham componentes de máquinas de tráfico. Selecionamos os principais componentes de três máquinas de transporte, incluindo coatômero, retrômero e CHEVI para confirmar ainda mais suas capacidades de ligação ao K7. O motivo di-lisina de K7 é necessário para sua interação com o coatômero, enquanto as leucinas C-terminal em K7 são críticas para a associação do retrômero. Nosso estudo revela o interactoma hospedeiro-viral do vaccinia K7 e revela três máquinas de transporte do hospedeiro como parceiros de ligação do K7, que podem ter papéis importantes nos ciclos de vida do poxvírus.

Palavras-chave: Vírus CHEVI Coatomer K7 Retromer Vaccinia.


Análise abrangente da interação do vírus hospedeiro de SARS-CoV-2

A interação proteína-vírus hospedeiro é o principal componente do ciclo de vida da síndrome respiratória aguda grave do coronavírus 2 (SARS-CoV-2). Conduzimos um estudo abrangente de interactome entre o vírus e as células hospedeiras usando purificação de afinidade em tandem e estratégias de rotulagem de proximidade e identificamos 437 proteínas humanas como as proteínas de interação de alta confiança. A caracterização funcional e a validação adicional dessas interações elucidaram como proteínas virais distintas da SARS-CoV-2 participam de seu ciclo de vida e descobriram potenciais alvos de drogas para o tratamento de COVID-19. Os interatomas de duas proteínas virais codificadas por SARS-CoV-2 chave, a proteína NSP1 e a proteína N, foram comparados com os interatomas de suas contrapartes em outros coronavírus humanos. Essas comparações não apenas revelaram caminhos comuns do hospedeiro que esses vírus manipulam para sua sobrevivência, mas também mostraram interações proteína-proteína divergentes que podem explicar as diferenças na patologia da doença. Esta interação abrangente da doença coronavírus-2019 fornece recursos valiosos para a compreensão e tratamento desta doença.


Ubiquitina: da sinalização à doença

O turnover de proteínas através do sistema de ubiquitina é um meio central pelo qual a abundância de proteínas regulatórias é controlada. Muitas dessas proteínas estão envolvidas em cascatas de transdução de sinal ligadas à proliferação celular, pontos de controle e câncer. Este laboratório emprega abordagens proteômicas e genéticas para descobrir os principais sistemas de sinalização, ubiquitina ligases e circuitos reguladores que controlam várias vias biológicas. As áreas amplas de pesquisa estão descritas no link PESQUISA acima.

Além do sistema de ubiquitina, o laboratório também está explorando os mecanismos subjacentes à homeostase do proteoma em grande escala, incluindo o sistema de autofagia e o controle de qualidade mitocondrial em doenças como a doença de Parkinson. Por exemplo, a proteína PARKIN, encontrada mutada em formas familiares precoces da doença de Parkinson, é uma ubiquitina ligase que controla a degradação de mitocôndrias danificadas por meio do processo de autofagia (referido como mitofagia). Nosso trabalho nesta área está focado no uso de abordagens proteômicas para identificar alvos da ubiquitina ligase PARKIN e como PARKIN ativa o processo de mitofagia (Sarraf et al., Natureza, 2013). Agora também estendemos nosso trabalho mitocondrial no sentido de compreender como as redes mitocondriais são estabelecidas e como esses complexos são desregulados na doença mitocondrial. Nossa primeira publicação nesta área apareceu em Molecular and Cellular Biology (Guarani et a., MCB, 2014), onde identificamos um novo componente do aparato de montagem do Complexo I da cadeia de transporte de elétrons. Outros estudos revelaram um novo componente de um complexo de junção de cristas chamado MICOS (eLife, 2015). A nova proteína transmembrana QIL1 liga vários componentes do MICOS na membrana mitocondrial interna. Em colaboração com Manuel Schiff, demonstramos que QIL1 é mutado na encefalopatia mitocondrial fetal de início precoce e as células de pacientes têm junções cristas interrompidas e estrutura mitocondrial (eLife, 2016). Recentemente, também exploramos a resposta da proteína mitocondrial desdobrada usando proteômica e RNA-Seq, identificando papéis para o processamento Pré-RNA na UPR mitocondrial (Munch et al., Natureza, 2016). Mais recentemente, examinamos sistematicamente os papéis das 6 proteínas ATG8 em células humanas usando edição de genes baseada em CRISPR, proteômica e abordagens biológicas celulares (Pontano-Vaites et al., MCB, 2016). Também examinamos sistematicamente a ribofagia sob uma série de condições de estresse distintas, identificando os agentes de estresse que induzem a ribofagia e também a degradação de outras proteínas citosólicas (An e Harper, Nature Cell Biology, 2016). Usando proteômica em células submetidas a estresse nutricional, identificamos um novo receptor -TEX264 - para turnover de uma ampla gama de proteínas ER, chamadas ER-fagia (An et al., Molecular Cell, 2019). Isso foi seguido por uma análise sistemática do turnover de proteínas por autofagia e sob estresse de nutrientes, incluindo uma análise detalhada dos ribossomos (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32612236/). Este artigo também empregou proteômica baseada em ANA para examinar sistematicamente as taxas de tradução e degradação em 8.000 proteínas.

Para auxiliar em nossos estudos de proteômica, desenvolvemos várias ferramentas e métodos proteômicos que facilitam estudos quantitativos de vias de sinalização e modificações de proteínas, como fosforilação e ubiquitilação. Um sistema chave é nossa plataforma de proteômica chamada CompPASS (Comparative Proteomics Analysis Software Suite) (Sowa et al., Célula, 2009). O CompPASS foi projetado para ajudar a facilitar a identificação de proteínas de interação candidatas de alta confiança a partir de dados IP-MS / MS. O site CompPASS contém todos os dados do papel da Cell descrevendo o interactoma da enzima desubiquitinante, o interactoma da autofagia (Natureza, 2010), e ERAD interactome (Nature Cell Biology, 2011), bem como ferramentas para navegar pelos dados e um tutorial CompPASS. Este software pode ser acessado clicando no ícone CompPASS (abaixo). Usamos essa abordagem para examinar os parceiros de interação de centenas de proteínas envolvidas na transdução de sinal e na doença. Recentemente, desenvolvemos um novo método chamado Parallel Adapter Capture proteomics para identificar substratos de Cullin-RING ligases e o aplicamos a toda a família de E3s SCF-FBXL, identificando numerosos substratos candidatos (Tan et al., Molecular Cell, 2013). Agora estendemos isso para a rede p97, identificando uma grande coleção de domínio UBDX contendo proteínas associadas ao adaptador e um papel para uma delas na ciliogênese (Raman et al., Nature Cell Biology, 2015)

Recentemente relatamos em Natureza o uso de proteômica quantitativa para identificar sistematicamente proteínas enriquecidas com autofagossomo, com o objetivo principal de identificar novas cargas e receptores de carga. Entre as novas proteínas autofagossômicas enriquecidas estava a NCOA4, uma proteína citoplasmática que demonstramos localizar em vesículas autofagossômicas em resposta à ativação da autofagia. A identificação imparcial de proteínas associadas a NCOA4 revelou cadeias pesadas e leves de ferritina, componentes de uma estrutura de gaiola cheia de ferro que protege as células de espécies reativas de ferro, mas é degradada por autofagia para liberar ferro por meio de um mecanismo desconhecido. Descobrimos que a entrega de ferritina aos lisossomos exigia NCOA4, e uma incapacidade das células deficientes em NCOA4 de degradar a ferritina leva à diminuição do ferro intracelular biodisponível. Nosso trabalho identifica o NCOA4 como um receptor de carga seletivo para o turnover autofágico de ferritina (ferritinofagia), crítico para a homeostase do ferro, e fornece um recurso para a dissecção posterior da conectividade do receptor de carga autofagossômico.

Além disso, com o Gygi Lab, desenvolvemos a proteômica diGLY como uma abordagem para a identificação de locais de ubiquitilação em proteínas de maneira dinâmica e quantitativa (Kim et al., Molecular Cell 2011). Este sistema pode ser usado para caracterizar o proteoma modificado de ubiquitina e para identificar locais de ubiquitilação por ubiquitina ligases específicas. Agora combinamos isso com a proteômica quantitativa baseada em Tandem Mass Tagging (TMT) para examinar milhares de locais de ubiquitilação de uma maneira dependente de sinal. Usando este sistema, mapeamos extensivamente a ubiquitilação de mitocôndrias dependente de PARKIN (Rose et al., Sistemas Celulares, 2016).


Assista o vídeo: Dogma Central da Biologia Molecular LEGENDADO ptBR (Janeiro 2022).