Em formação

Onde posso obter amostras de virófagos do Sputnik?


Estou trabalhando em um projeto em que estou tentando usar virófagos como vetores virais na introdução de proteínas CRISPR-Cas em outros vírus. Gostaria de saber onde posso encontrar virófagos Sputnik com defeito de replicação ou outros virófagos para esse tipo de experimento?


Zamilon virophage

Vírus dependente de mimivírus Zamilon, ou Zamilon, é um virófago, um grupo de pequenos vírus de DNA que infectam protistas e requerem um vírus auxiliar para se replicar. Eles são um tipo de vírus satélite. [2] Descoberto em 2013 na Tunísia, infectando Acanthamoeba polyphaga amebas, Zamilon mais se assemelha ao Sputnik, o primeiro virófago a ser descoberto. O nome é árabe para "o vizinho". [3] Sua partícula esférica tem 50-60 nm de diâmetro e contém um genoma de DNA circular de fita dupla de cerca de 17 kb, que se prevê codificar 20 polipeptídeos. Uma cepa relacionada, Zamilon 2, foi identificado na América do Norte.

Todos os virófagos conhecidos estão associados a ajudantes na família de vírus de DNA gigante Mimiviridae. Zamilon é restrito em sua gama de vírus auxiliares, ele pode ser suportado por vírus de Mimivírus-gostar Mimiviridae linhagens B e C, mas não da linhagem A. Isso parece ser uma consequência de um sistema imunológico rudimentar do vírus auxiliar, denominado MIMIVIRE (elemento de resistência a virófagos mimivírus), semelhante à via CRISPR-Cas. [4] Ao contrário do virófago Sputnik, o Zamilon não parece prejudicar a replicação de seu vírus auxiliar.


Artigo ORIGINAL RESEARCH

Disse Mougari 1, Meriem Bekliz 1, Jonatas Abrahao 1,2, Fabrizio Di Pinto 1, Anthony Levasseur 1 * e Bernard La Scola 1 *
  • 1 MEPHI, APHM, IRD 198, Departamento de Medicina, IHU-M & # x00E9diterran & # x00E9e Infection, Aix-Marseille University, Marseille, França
  • 2 Laborat & # x00F3rio de V & # x00EDrus, Instituto de Ci & # x00EAncias Biol & # x00F3gicas, Departamento de Microbiologia, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Brasil

Os virófagos são reguladores críticos da dinâmica da população viral e potenciais atores na estabilidade das redes microbianas. Essas pequenas entidades biológicas são anteriores ao ciclo replicativo de vírus gigantes, como os membros do Mimiviridae família ou seus parentes distantes, que produzem no citoplasma de suas células hospedeiras uma fábrica viral que abriga uma bioquímica complexa propícia ao crescimento dos parasitas menores. Neste artigo, descrevemos o isolamento e a caracterização de um novo virófago, o oitavo, que denominamos Guarani. Observamos que o Guarani exibe um ciclo de replicação tardio em comparação com seu hospedeiro gigante do vírus. Além disso, como todas as cepas de Sputnik, o Guarani é capaz de infectar as três linhagens A, B e C do Mimiviridae família e afeta a replicação e a infectividade de seu vírus hospedeiro. Em termos de conteúdo genético, o Guarani tem um genoma de DNA de fita dupla de 18.967 pb, que codifica 22 genes previstos muito semelhantes aos genes do Sputnik, exceto para ORF19 e ​​ORF12. O primeiro está mais relacionado a Zamilon, enquanto o último parece ser novo. A arquitetura do genoma Guarani está intimamente relacionada às cepas Sputnik e Zamilon, sugerindo uma origem comum para todos esses virófagos.


La Scola, B. et al. O virófago como parasita único do mimivírus gigante. Natureza 455, 100–104 (2008).

Fischer, M. G. & amp Suttle, C. A. Um virophage na origem de grandes transposons de DNA. Ciência 332, 231–234 (2011).

Desnues, C. & amp Raoult, D. Inside the lifestyle of the virophage. Intervirology 53, 293–303 (2010).

Jones, I. M. & amp Reichmann, M. E. As proteínas sintetizadas em folhas de tabaco infectadas com o vírus da necrose do tabaco e o vírus da necrose do tabaco satélite. Virologia 52, 49–56 (1973).

Parks, W. P. et al. Interferência do vírus de satélite adeno-associado com a replicação de seu adenovírus auxiliar. J. Exp. Med. 127, 91–108 (1968).

Murant, A. F. & amp Mayo, M. A. Satellites of plant virus. Annu. Rev. Phytopathol. 20, 49–70 (1982).

Claverie, J. M. & amp Abergel, C. Mimivirus and its virophage. Annu. Rev. Genet. 43, 49–66 (2009).

Kassanis, B., Vince, D. A. & amp Woods, R. D. Microscopia de luz e eletrônica de células infectadas com necrose do tabaco e vírus satélite. J. Gen. Virol. 7, 143–151 (1970).

den Boon, J. A., Diaz, A. & amp Ahlquist, P. Cytoplasmic viral replication complexes. Micróbio hospedeiro celular 8, 77–85 (2010).

Dodds, J. A. Satellite Smoking mosaic virus. Annu. Rev. Phytopathol. 36, 295–310 (1998).

Bringloe, D. H., Pleij, C. W. & amp Coutts, R. H. Mutation analysis of cis-elementos nas regiões 3 'e 5' não traduzidas do vírus satélite da necrose do tabaco da cepa C do RNA. Virologia 264, 76–84 (1999).

Fischer, M. G. et al. O vírus gigante com um notável complemento de genes infecta o zooplâncton marinho. Proc. Natl Acad. Sci. EUA 107, 19508–19513 (2010).

Sun, S. et al. Estudos estruturais do virófago Sputnik. J. Virol. 84, 894–897 (2010).

Krupovic, M. & amp Bamford, D. H. Evolução do vírus: até onde se estende a linhagem viral do barril β duplo? Nature Rev. Microbiol. 6, 941–948 (2008).

Rice, G. et al. A estrutura de um vírus archaeal termofílico mostra um tipo de cápside viral de DNA de fita dupla que abrange todos os domínios da vida. Proc. Natl Acad. Sci. EUA 101, 7716–7720 (2004).

Comeau, A. M. et al. Explorando a virosfera procariótica. Res. Microbiol. 159, 306–313 (2008).

Krupovic, M. & amp Bamford, D. H. Order to the viral universe. J. Virol. 84, 12476–12479 (2010).


Discussão

Os virófagos são entidades virais recentemente descobertas que requerem vírus gigantes para co-infectar micróbios eucarióticos. Suas interações complexas os tornam muito difíceis de isolar em laboratório e há apenas alguns representantes isolados derivados de experimentos de co-cultura. Para contornar os obstáculos da identificação experimental de virófagos e explorar a gama de sua diversidade filogenética e de habitat, desenvolvemos uma abordagem computacional aproveitando as informações disponíveis em mais de 14.000 amostras metagenômicas. Nossa abordagem baseou-se na disponibilidade de um gene de assinatura de virófago único e conservado que codifica a proteína do capsídeo principal (MCP). Por meio de um processo iterativo, modelos de HMM específicos de MCP foram desenvolvidos levando à identificação e caracterização de centenas de genomas de virófagos de alta qualidade (HQ) em uma grande diversidade de habitats. Embora os resultados possam ser tendenciosos devido à super-representação de MCPs de virófagos publicados encontrados em habitats aquáticos e os metadados das amostras dos bancos de dados analisados ​​(por exemplo, distribuição de habitat e tecnologia de sequenciamento / montagem usada), o levantamento global de virófagos possibilitou este abordagem pode levar a uma melhor compreensão da biologia de virófagos, diversidade de habitat, taxonomia e evolução.

Antes deste trabalho, apenas 33 genomas de virófagos HQ de ambos os isolados e genomas derivados de metagenoma foram identificados e classificados como membros da Lavidaviridae família. Abaixo do nível de família, a classificação de virófagos baseou-se na presença de “pelo menos alguns dos genes morfogenéticos conservados em virófagos (MCP, mCP, ATPase, PRO)” e “a dependência ou associação do vírus com um NCLDV”. Esta classificação resultou em dois gêneros separados (gênero Sputnikvirus e gênero Mavirus) [10]. Além disso, foi proposto que outros virófagos derivados de metagenoma conhecidos (OLV, YSLVs e virófagos do rúmen) provavelmente seriam classificados em diferentes gêneros, mas a ausência de isolados replicantes limitou sua classificação pelo ICTV. Estudos de biogeografia usaram anteriormente MCPs parciais de virófagos conhecidos para pesquisas baseadas em homologia para propor uma distribuição global entre microbiomas [13]. No entanto, a identificação de genomas de virófagos HQ tem sido muito limitada e tendenciosa para ambientes aquáticos [13, 15,16,17].

Este estudo revelou que a grande maioria dos aglomerados de proteínas virófagos (VpPC) foram compartilhados por menos de 5% dos genomas, indicando uma enorme diversidade genética que poderia ser atribuída à posição evolutiva do virófago e alta frequência de troca gênica horizontal com outros vírus entidades e células microbianas [43]. No entanto, as quatro famílias de genes centrais propostas anteriormente estavam presentes entre todos os genomas completos recém-identificados, incluindo os genomas de virófagos associados a ruminantes, onde o mCP foi previamente relatado como ausente [18]. Este achado é essencial para o novo esquema de classificação proposto para virófagos HQ derivados de microbioma que foram baseados na homologia de sequência e na sintaxe do gene dos VpPCs conservados. Nossa abordagem revelou que 17 dos 27 clados propostos são novos, enquanto os 10 restantes (associados a virófagos publicados e de acordo com a classificação anterior) foram amplamente expandidos com novas sequências. Esta classificação foi ainda apoiada pelo tipo de MCP, a distribuição do tipo de habitat e o conteúdo geral do gene dos membros do clado (Fig. 3) e revelou um grande aumento na diversidade dos diferentes grupos taxonômicos definidos pelas sequências do genoma de virófagos HQ.

As amostras de água doce continuaram a ser o habitat com o maior número de virófagos recuperados e ainda os reservatórios com o maior número de sequências de MCP em clados sem genomas HQ. Como exemplo, 80% e 75% dos virófagos dos clados 19 e 24 (764 e 2455 membros MCP, respectivamente) foram recuperados de amostras de água doce (Fig. 2a). Além disso, pela primeira vez, encontramos genomas HQ de virófagos em outros habitats diversos, incluindo associados a plantas, fontes termais, subsuperfície profunda, rúmen de vaca e amostras de intestino humano. Particularmente interessante foi o caso dos virófagos associados ao intestino humano, que foram caracterizados por modelos de MCP bastante distintos (Fig. 4c). Quatro dos cinco genomas de virófagos HQ associados a humanos foram identificados em amostras fecais recuperadas de indivíduos com um estilo de vida rural, com o genoma remanescente encontrado em um indivíduo com colite ulcerosa. Conseqüentemente, esses virófagos podem estar ligados à ingestão de eucariotos unicelulares com comida ou água. Esta observação também foi apoiada pela distribuição dos modelos de MCP encontrados em amostras fecais de indivíduos com estilo de vida rural, que foram compartilhados principalmente com animais (babuínos, vacas, ovelhas e artrópodes) e fontes de água doce (Fig. 2c).

Apesar da enorme variabilidade do conteúdo proteico codificado pelos genomas de virófagos previstos, esta linhagem é caracterizada pela presença de um bloco sintênico de 4-5 genes encontrados em vários genomas de partes distantes da árvore de virófagos, sugerindo que esses genes foram herdados verticalmente de um ancestral comum. No entanto, a variação de sintaxe dentro deste bloco entre os clados de virófagos propostos é indicativa de reorganização do genoma significativa.

Uma série de VpPCs (por exemplo, integrases, metilases, recombinases e DNA polimerases) têm homólogos em vírus fora da linhagem de virófagos, especialmente em polintons e vírus do tipo polinton. Isso sugere transferências de genes freqüentes entre esses diferentes tipos de elementos genéticos móveis, como previamente hipotetizado [22, 44]. Isso também foi apoiado por filogenias da DNA polimerase tipo B e rve integrase mostrando clados mistos reunindo virófagos, polintons e vírus semelhantes a polinton (arquivo adicional 2: Figura S2). A partir desse pool de genes, é de particular interesse a presença de integrases, recombinases e RNAs de transferência em virófagos. Integrases e recombinases foram identificadas na maioria dos clados de virófagos propostos (arquivo adicional 1: Tabela S4 Arquivo adicional 1: Tabela S5), provavelmente fornecendo a esses vírus a capacidade de incorporar seu DNA no genoma do hospedeiro como provirófagos. A integração foi previamente descrita para Mavirus e Bigelowiella natans virófagos [7, 42, 45] e poderia fornecer proteção potencial para o hospedeiro eucariótico contra NCLDVs [42]. Por outro lado, esta é a primeira vez que sequências de tRNA foram identificadas em genomas de virófagos (arquivo adicional 2: Figura S6). Sua presença pode ajudar os virófagos a complementar o uso do códon ou aminoácido de seu hospedeiro [32, 33] ou pode ser um resultado da aquisição do genoma do hospedeiro, uma vez que os tRNAs são conhecidos como pontos quentes para a integração do vírus [32, 34, 35].

Finalmente, uma nova abordagem computacional baseada no MIMIVIRE para prever a associação de virófagos com vírus gigantes revelou novas linhagens de vírus gigantes potencialmente alvejados por virófagos. Além disso, a análise dos transcriptomas de protozoários permitiu a detecção da associação tripla entre um Mavirusvirófago relacionado, um vírus gigante relacionado ao CroV e um dinoflagelado marinho A. tamarense. Antecipamos que esses dados conduzirão ao projeto experimental e validação das previsões computacionais de tripletos virophage-gigante vírus-microeukaryote e elucidar a evolução e ecologia desses sistemas biológicos notáveis.


Revisores e relatórios # x02019

Revisor 1

Mart Krupovic, Institut Pasteur

Nesta nota de descoberta, Yutin et al. descrevem um novo grupo de virófagos putativos, que eles descobriram no metagenoma do rúmen das ovelhas. Esses novos elementos diferem consideravelmente dos virófagos descritos anteriormente e parecem conter um genoma quimérico. O módulo de morfogênese do vírion é semelhante ao compartilhado por todos os virófagos, enquanto a família B DNA polimerase está mais intimamente relacionada às proteínas correspondentes de grandes transposons de DNA semelhantes a vírus da superfamília Polinton / Maverick. Os autores conseguiram reunir vários genomas quase completos desses novos virófagos. O metagenoma contendo virófago foi positivo para a presença de mimivírus, conforme avaliado pela ocorrência de leituras que codificam para a proteína do capsídeo principal do mimivírus. Esse resultado é consistente com a conclusão de que os virófagos recém-identificados parasitam os vírus gigantes. O manuscrito é escrito de forma muito clara e lógica.

Usando as principais sequências de proteínas do capsídeo apresentadas no arquivo adicional 1, pude confirmar a relação entre as proteínas do capsídeo dos virófagos do rúmen com aquelas dos virófagos descritos anteriormente. No entanto, não consegui acessar os contigs genômicos do metagenoma intestinal. Seria desejável apresentá-los como arquivos GenBank arquivados nas informações suplementares.

O módulo morfogenético de virófagos e polintons inclui uma proteína menor do capsídeo. Os virófagos do rúmen codificam um homólogo dessa proteína? Isso tem que ser declarado no texto.

Resposta dos autores e # x02019: Este é um ponto importante que é abordado explicitamente no manuscrito revisado. Parece que o RVP genuinamente carece da proteína do capsídeo menor.

A segunda metade da terceira frase pode ser um exagero.

Resposta dos autores e # x02019: Sim, o segundo revisor também fez um comentário semelhante. Modificamos a frase para indicar que os vírus quiméricos & # x0201cmight & # x0201d são os principais componentes dos viromas.

& # x0201cof duas famílias distintas & # x0201d mude para & # x0201cfamilies & # x0201d.

Resposta dos autores e # x02019: corrigido

& # x0201cadota uma dobra derivada do jelly-roll & # x0201d muda para? adota uma dobra derivada do jelly-roll duplo & # x0201d.

Resposta dos autores & # x02019: modificado conforme sugerido.

No último parágrafo dos resultados (antes das conclusões), pode valer a pena mencionar que, embora o genoma de Mavirus tenha sido relatado como uma molécula circular, ele contém 50 & # x000a0bp repetições invertidas (separadas por 15 & # x000a0bp) (ref 12 no presente lista de referência), que pode corresponder a repetições terminais invertidas encontradas em polintons, PGV e RVPs.

Resposta dos autores & # x02019: Considerando o formato Biology Direct, acreditamos que seja suficiente incluir este detalhe aqui. Agradecemos o revisor apontando isso.

Os rótulos de alguns dos ORFs no arquivo adicional 3 são invertidos.

Autores & # x02019 resposta: corrigido.

Revisor 2

Kenneth Stedman, Portland State University

Yutin et al., Em sua & # x0201cDiscovery Note & # x0201d realizaram pesquisas altamente sensíveis de conjuntos de dados de sequência metagenômica disponíveis para sequências semelhantes aos principais genes da proteína do capsídeo (MCP) de virófagos conhecidos. Em seguida, eles usaram essas sequências como âncoras para adquirir dados de sequência associada dos conjuntos de dados metagenômicos. Desse modo, os autores descobrem um novo grupo de sequências, cujos putativos MCPs são semelhantes aos virophage MCPs, mas consistem em um clado separado filogeneticamente bem suportado. Curiosamente, alguns desses MCPs estão associados a genes putativos da DNA polimerase preparados com proteína que são semelhantes a alguns genes da Polinton DNA polimerase. Os autores propõem uma nova família de virófagos com base nesta análise.

É lamentável que este manuscrito seja limitado pelo formato da nota de descoberta, pois considero as Figuras adicionais parte integrante da interpretação dos resultados apresentados no manuscrito. Especificamente, acho que as árvores filogenéticas para os genes putativos de ATPase e Protease viral são pelo menos tão convincentes quanto a árvore filogenética apresentada na Figura & # x000a0 1. Os mapas do genoma no arquivo adicional 3 também são extremamente úteis para entender o manuscrito e apoiar as hipóteses dos autores.

Resposta dos autores e # x02019: Apreciamos essas idéias, mas afirmamos que o formato da Nota de Descoberta é o mais apropriado para essas descobertas. A principal razão é que não temos sequências genômicas completas confirmadas do RVP e não tivemos a oportunidade de realizar qualquer sequenciamento confirmatório, conforme apontado pelo revisor abaixo. Portanto, o formato de comunicação curta parece ser a escolha correta. Concordamos que as árvores para ATPases e proteases são tão convincentes quanto a árvore pPolB e podem ser ainda mais fáceis de interpretar. Escolhemos a polimerase para o corpo principal do artigo porque, em geral, esse gene é mais comum entre diversos elementos genéticos do que qualquer um dos outros dois. Para o melhor de nosso entendimento, os arquivos adicionais são partes integrantes do artigo publicado e podem ser acessados ​​a partir do artigo com um clique. Assim, esperamos e confiamos que não haja problema para os leitores avaliarem a totalidade das evidências apresentadas aqui.

A Figura & # x000a0 2 com a árvore filogenética da DNA polimerase preparada com proteína é confusa, devido à diversidade de pPolBs em Polintons. Eu sugiro fortemente uma introdução mais ampla aos Polintons e seus diversos pPolBs. Eu também acho que isso ajudaria na interpretação da figura.

Resposta dos autores e # x02019: Não temos certeza sobre a origem da confusão. Potencialmente, o problema pode estar no fato de que diferentes grupos de vírus eucarióticos e outros elementos egoístas emergem da diversidade polinton. isto é, aparentemente evoluiu de diferentes grupos de polintons. Enfatizamos essa tendência em dois lugares no manuscrito revisado. Além desses esclarecimentos que, como esperamos, são suficientes para evitar qualquer confusão, não parece haver espaço neste breve manuscrito para apresentar os polintons em maiores detalhes..

Eu, e creio que a maioria dos leitores do Biology Direct, gostaríamos de obter mais detalhes sobre alguns dos métodos e alguns esclarecimentos sobre algumas das afirmações do manuscrito. Eles são detalhados abaixo:

Primeiro, embora nosso laboratório tenha sido o primeiro a reconhecê-los, não tenho certeza se os vírus quiméricos ssDNA e & # x02009 + & # x02009 RNA de cadeia são & # x0201ccomponentes principais dos viromas & # x0201d. Eu gostaria de pensar que sim. No entanto, como a maioria dos viromas citados, e certamente os nossos, foram amplificados usando a polimerase Phi29DNA, que amplifica preferencialmente pequenos genomas de vírus ssDNA, não se pode ter certeza da quantificação. Talvez isso seja discutido em Krupovic et al., Genome Biology and Evolution, 2015, mas não consegui acessar este manuscrito.

Resposta dos autores e # x02019: este não é, de forma alguma, um ponto-chave do artigo. Podemos ter ultrapassado o limite na versão original. A declaração foi suavizada na revisão após este comentário e um comentário semelhante do revisor 1.

Na segunda frase do segundo parágrafo de & # x0201cFindings & # x0201d, sugiro adicionar & # x0201cknown & # x0201d depois de & # x0201cThe & # x0201d e antes de & # x0201cvirophages & # x0201d e alterar & # x0201 #ckilobases1 & x20ilobases1 & x201dobas1 # x201cobases1 & x201cckilobases1 & x201cvirofagos1d # x201ckilobases1 .

Resposta dos autores & # x02019: modificado conforme sugerido.

Terceiro parágrafo das conclusões: Considere incluir uma referência aos transposons Maverick na primeira menção dos Polintons para esclarecer isso aos pesquisadores que não foram capazes de acompanhar a literatura recente dos autores (e outros) sobre Polintons.

Quinto parágrafo de & # x0201cFindings & # x0201d: A definição de & # x0201chits & # x0201d precisa ser feita aqui ou os parâmetros exatos usados ​​para as pesquisas e critérios de seleção fornecidos. Fiz uma pesquisa tBLASTn com a primeira sequência de MCP listada (Mavirus MCP) usando o id taxonômico do metagenoma e encontrei & # x0201chits & # x0201d com altos e-valores e baixos escores. Eu também listaria os ids dos metagenomas encontrados aqui, em vez de abreviações. Eu discordo que esta análise & # x0201cconfirmou & # x0201d como provável, eu diria & # x0201cidentified & # x0201d.

Resposta dos autores e # x02019: Indicamos na revisão que, no primeiro estágio, usamos o padrão BLAST, ou seja, E-value & # x02009 & # x0003c & # x0200910 (sem significância estatística necessária). & # x0201cConfirmado & # x0201d alterado para & # x0201cidentificado & # x0201d conforme sugerido. No entanto, pensamos que aqui o id taxonômico confundiria desnecessariamente o texto, abreviações deveriam ser suficientes. Os e-valores, pontuações e melhores IDs de acerto, bem como os IDs de sequências metagenômicas, estão no arquivo adicional1.

Sexto parágrafo de & # x0201cFindings & # x0201d: A afinidade dos MCPs de virófagos semelhantes ao Sputnik para os supostos MCPs de virófagos do rúmen de ovelha parece muito tênue na Figura & # x000a0 1. O valor (39) listado no ponto de ramificação da árvore entre esses dois grupos está correto? Na minha interpretação, isso significa um agrupamento diferente 61% das vezes, possivelmente meu entendimento desse valor ELW está incorreto. Todos os contigs longos no metagenoma ruminal das ovelhas foram analisados ​​aqui ou apenas aqueles que continham genes putativos de MCP para virófagos? Se todos os contigs longos corresponderam a RVPs, então eles podem ser extremamente comuns no ambiente ruminal das ovelhas.

Resposta dos autores e # x02019: a interpretação de ELW é basicamente correta. No entanto, as árvores foram refeitas com um método diferente e, com base nos resultados incluídos na versão revisada, não reivindicamos mais afinidade com a família Sputnik. Analisamos todos os contigs do metagenoma do rúmen de ovelhas depositados no GenBank no momento da submissão deste manuscrito (BioProject PRJNA202380 5,8 gbp 8.786.927 contigs <"type": "entrez-nucleotide", "attrs": <"text": "AUXO000000000.1", "term_id": "608786013", "term_text": "AUXO000000000.1" >> AUXO000000000.1http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/wgs/?val=AUXO01#contigs), e os contigs detalhados no arquivo adicional3são os únicos que codificam proteínas relacionadas a virófagos. Assim, os RVP não são particularmente comuns no rúmen das ovelhas.

Sétimo parágrafo: As montagens dos contigs metagenômicos mostradas no Arquivo Adicional 3 são muito interessantes e bastante convincentes. No entanto, os métodos devem ser descritos de como esses contigs foram montados. Parece que eles foram montados de várias maneiras diferentes.

Resposta dos autores e # x02019: Os assemblies relatados aqui foram obtidos usando pesquisas BLASTN implementadas no Censor. Uma legenda detalhada da figura está incluída no arquivo adicional revisado3. cada contig que codifica um homólogo de MCP foi usado como uma consulta em uma pesquisa do Censor contra o conjunto completo de todos os contigs do metagenoma do rúmen de ovelha (8.786.927 contigs, 5,8 Gbp). Usando o Censor, não encontramos sobreposições significativas dos terminais dos virófagos montados com quaisquer outros contigs.

Oitavo parágrafo: Eu discordo que o grupo RVP de supostos virófagos é & # x0201c claramente relacionado & # x0201d aos virófagos do tipo Sputnik (com base na Figura & # x000a0 1, se o arquivo adicional 2 for adicionado, isso tornaria o argumento muito mais forte).

Resposta dos autores e # x02019: Refizemos as árvores e removemos a declaração anotada. O que está claro é a relação do módulo morfogenético do RVP com o dos virófagos (em geral). Os RVP são uma nova família distinta de virófagos. O texto foi modificado em conformidade.

Nono parágrafo: A possível relação entre os RVPs e sequências semelhantes a mimivírus no metaviroma é claramente especulativa, mas alguma menção deve ser feita aqui se esses vírus são provavelmente endógenos ou de algo consumido pelas ovelhas. A afirmação & # x0201cparticularmente numerosa & # x0201d é imprecisa, alguma quantificação, pelo menos em relação aos outros metagenomas, deve ser fornecida aqui.

Resposta dos autores e # x02019: Dado que até agora se demonstrou que os virófagos parasitam apenas vírus gigantes da família Mimiviridae, consideramos a relação entre o RVP e os mimivírus que parecem estar presentes no mesmo habitat, julgados pela análise de metagenoma, como altamente plausível, embora, certamente , ainda uma conjectura. A possibilidade de que os mimivírus venham dos alimentos e não se reproduzam no rúmen é difícil de imaginar, dada a dieta das ovelhas que dificilmente é rica em ameba. & # x0201cParticularmente numeroso & # x0201d refere-se à proporção de MCPs semelhantes a Mimiviridae estendidos no metagenoma do rúmen em comparação com outros metagenomas analisados ​​para este assunto, conforme mostrado no arquivo adicional1. Não achamos que os números precisem ser incluídos no artigo. Um leitor particularmente interessado pode calcular usando o arquivo adicional1.

Décimo parágrafo: A análise dos TIRs também deve incluir a análise dos IRs internos, se houver, nas sequências. Se as leituras da sequência metagenômica original estiverem disponíveis, isso pode determinar se os IRs identificados são realmente terminais. Eu descreveria o virófago putativo PGV com mais detalhes. Ele apenas tem TIRs, mas nenhum dos outros genes? No final do parágrafo, acredito que os autores querem dizer & # x0201cin trans & # x0201d em vez de & # x0201cin-trance & # x0201d.

Resposta dos autores e # x02019: Não havia IRs internos. Foi adicionada uma clarificação sobre as proteínas codificadas por virófagos PGV. O erro de digitação corrigido.

Conclusões: Concordo totalmente com o incrível potencial dos metagenomas como fontes de novos genomas de vírus. Deve-se mencionar que, no caso dos vírus ssDNA quiméricos, muitos deles foram reconfirmados por amplificação e novo sequenciamento de amostras originais, o que eu não acredito que tenha sido feito para esses RVPs.

Resposta dos autores e # x02019: De fato, não houve amplificação e resequenciamento envolvidos aqui. No entanto, não acreditamos que esta isenção de responsabilidade pertença às Conclusões. Basta estar aqui para o leitor interessado ver.

Métodos: Para as pesquisas do banco de dados nr, todos os resultados de MCP putativos foram pesquisados ​​individualmente ou como uma sequência de consenso ou HMM? Por favor especifique. Como foram calculados os valores de suporte da agência?

Resposta dos autores e # x02019: Sequências individuais foram usadas como consultas para pesquisas de banco de dados. Nem o Tblastn nem o Blastp funcionam com perfis, então isso está claro como está escrito. A frase sobre o suporte da filial foi alterada.

& # x0201cContribuições do autor & # x0201d e & # x0201cAgradecimentos & # x0201d parecem estar duplicados no manuscrito.

Resposta dos autores e # x02019: Corrigido.

Legendas das figuras: sugiro remover & # x0201c Proveniência evolutiva dos virófagos do rúmen & # x0201d de ambos os títulos das figuras.

Resposta dos autores e # x02019: feito, com uma modificação adicional.

Também sugiro dividir a legenda em vez de colocar tudo na Figura & # x000a0 1, pois a Figura & # x000a0 1 não tem multifurcações ou ramos recolhidos.

Várias abreviações estão faltando nesta legenda, como ALM, YSLV, ATP, PRO, MCP e pPOLB (e E8 da Figura & # x000a0 2).

Resposta dos autores e # x02019: incluído

Não está claro para mim que valores de bootstrap menores que 50% sejam feitos em multifurcações, como 18, 31, 37 e 39 estão listados. Se os ELWs não forem bootstraps, isso deve ficar claro na legenda ou no texto, ou em ambos.

Resposta dos autores e # x02019: Multifurcações foram mencionadas por engano e # x02013 removidas. ELWs podem ser interpretados como bootstrap.

Não está claro quais ORFs se referem às sequências YSLV, eu incluiria os números de acesso para todas as sequências individuais mostradas nas árvores.

Resposta dos autores e # x02019: incluído

A orientação dos desenhos para os RVPs parece aleatória, eu orientaria todos eles da mesma forma, exceto aqueles que são claramente diferentes devido à orientação relativa dos genes pPolB. Também identificaria quais deles contêm TIRs.

Resposta dos autores e # x02019: Sim, são sugestões muito boas. Os desenhos foram reorientados com base na orientação do gene MCP. Os TIR não são adjacentes a esses genes conservados e, portanto, são mostrados no arquivo adicional3.

Arquivo adicional 1: A anotação nesta tabela é deste estudo?

Resposta dos autores & # x02019: sim, é

Arquivo adicional 2: Incluir no manuscrito e ter muito cuidado ao definir todas as abreviações e listar os números de acesso.

Autores & # x02019 resposta: TA sugestão não é totalmente clara. Se se trata de torná-lo uma figura principal em vez de um arquivo adicional, os motivos para não fazer isso são explicados acima. Abreviaturas e acessos duplamente verificados e alterados.

Arquivo adicional 3: inclua ORFs em A ou divida na Figura & # x000a0 1 (ou ambos).

Resposta dos autores e # x02019: Incluímos ORFs selecionados no virophage A (arquivo adicional3): POLB, ATPase, protease de cisteína, MCP e uma proteína não classificada (& # x0201c24 & # x0201d), outras 15 proteínas não classificadas não são mostradas (não estão presentes em outros virófagos).


O Sputnik foi isolado pela primeira vez de uma amostra obtida de humanos, colhido do fluido de lente de contato de um indivíduo com ceratite. [3] Naturalmente, entretanto, descobriu-se que o virófago Sputnik se multiplica dentro das espécies de Acanthamoeba, mas apenas se essa ameba estiver infectada com o grande mamavírus. O Sputnik aproveita as proteínas do mamavírus para produzir rapidamente novas cópias de si mesmo. [1]

O Sputnik tem um genoma de DNA de fita dupla circular que consiste em 18.343 pares de bases. [4] Ele contém genes capazes de infectar todos os três domínios da vida: Eukarya, Archaea e Bacteria. Dos vinte e um genes codificadores de proteínas previstos, três são aparentemente derivados do próprio APMV, um é homólogo de um vírus arquea e quatro outros são homólogos de proteínas em bacteriófagos e vírus eucarióticos. Treze são ORFans, ou seja, não possuem homólogos detectáveis ​​nas bases de dados de sequências atuais. O genoma do Sputnik tem um alto conteúdo de AT (73%) semelhante ao do APMV.

Vários outros homólogos, como os de uma primase-helicase, uma ATPase de empacotamento, uma subunidade de ligação a DNA de transposase de sequência de inserção e uma proteína Zn-ribbon, foram detectados no conjunto de dados ambientais do Global Ocean Survey, sugerindo que os virófagos podem ser atualmente família desconhecida de vírus.

Descobriu-se que o Sputnik contém genes que são compartilhados pelo APMV. Esses genes poderiam ter sido adquiridos pelo Sputnik após a associação do APMV com o hospedeiro e a seguir interação entre o virófago e o hospedeiro viral. A recombinação dentro da fábrica viral pode ter resultado na troca de genes. O Sputnik é uma das evidências mais convincentes da combinação e correspondência de genes entre os vírus.

A presença desses genes homólogos ao mimivírus no Sputnik sugere que a transferência de genes entre o Sputnik e o mimivírus pode ocorrer durante a infecção de Acanthamoeba. Portanto, é hipotetizado que o virófago poderia ser uma fonte de veículo mediador da transferência lateral de genes entre vírus gigantes, que constituem uma parte significativa da população de vírus de DNA em ambientes marinhos. Moreover, the presence of three APMV genes in Sputnik implies that gene transfer between a virophage and a giant virus is crucial to viral evolution. [6]


INTRODUÇÃO

Virophages, a group of circular double-stranded DNA (dsDNA) viruses, are icosahedral in shape and approximately 50 to 100 nm in size (1𠄴). Virophages have three unique features (2). First, the nuclear phase is absent during the infection cycle of virophages. Second, the replication of virophages takes place in a viral factory of the giant host DNA viruses. Third, they depend on enzymes from host viruses instead of host cells. Accordingly, virophages are considered to be parasites of giant DNA viruses, e.g., mimiviruses and phycodnaviruses (1𠄳). Giant DNA viruses possess huge genome sizes (up to 𢒁,259 kb), some of which are even larger than those of certain bacteria (5𠄷). The infection and propagation of virophages lead to a significant decrease in host virus particles and, consequently, an increase in host cell survival (1𠄳). Additionally, exchanges of genes may occur between virophages and giant DNA viruses (1𠄳, 8, 9). Therefore, virophages are potential mediators of lateral gene transfer between large DNA viruses (8, 9).

Thus far, four virophages have been identified in distinct locations ( Table 1 ). The first reported virophage, Sputnik, was isolated from an Acanthamoeba species infected with the large mamavirus in a water-cooling tower in Paris, France (2). The second virophage, Mavirus, was observed in a marine phagotrophic flagellate (Cafeteria roenbergensis) in the presence of the host virus, Cafeteria roenbergensis virus, originating from the coastal waters of Texas (1, 10). The third virophage, Organic Lake virophage (OLV), discovered in a hypersaline meromictic lake in Antarctica, is thought to parasitize large DNA viruses infecting microalgae (3, 11). At the time of this report, a fourth virophage, Sputnik 2, together with its host virus, Lentille, has been detected in the contact lens solution of a patient with keratitis in France (12). The fact that virophages exist in a wide range of virus and eukaryotic hosts, as well as in a variety of unique habitats, implies the possibility that they are more widely distributed and diverse than previously thought.

Tabela 1

VirophageLocalizaçãoHost Genome
VirusEukaryoteSize (bp)No. of ORFsC+G content (%)
SputnikA cooling tower in Paris, FranceAcanthamoeba polyphaga mimivirusA. polyphaga18,3432127.0
MavirusCoastal waters of TexasCafeteria roenbergensis vírusMarine phagotrophic flagellate (C. roenbergensis)19,0632030.3
OLVOrganic Lake, a hypersaline meromictic lake in AntarcticaLarge DNA virusesPrasinophytes (phototrophic algae)26,4212639.1
Sputnik 2Contact lens fluid of a patient with keratitis, FranceLentille virusA. polyphaga18,3382028.5
YSLV1Yellowstone LakePhycodna- or mimiviruses?Microalgae?27,8492633.4
YSLV2Yellowstone LakePhycodna- or mimiviruses?Microalgae?23,1842133.6
YSLV3Yellowstone LakePhycodna- or mimiviruses?Microalgae?27,0502334.9
YSLV4Yellowstone LakePhycodna- or mimiviruses?Microalgae?28,3063437.2
ALMAce Lake in Antarcticamimiviruses?Phagotrophic protozoan?17,7672226.7

To obtain greater insight into the unusual diversity of the global distribution and abundance of virophages, in this study, metagenomic databases on the Community cyberinfrastructure for Advanced Microbial Ecology Research and Analysis (CAMERA) 2.0 Portal (https://portal.camera.calit2.net/) (13) were analyzed comprehensively. Four complete genomic sequences of virophages and one nearly complete sequence were assembled based on the metagenomic DNA sequences of Yellowstone Lake, Wyoming, and Ace Lake, Antarctica. Comparative genomics and phylogenetic analyses were performed in order to better understand the genomic sequence features, phylogeny, and evolution of virophages.


Materiais e métodos

Water samples from Organic Lake were collected December 2006 and November and December 2008, and microbial biomass was collected onto 3.0-, 0.8-, and 0.1-μm membrane filters as described previously (14, 36). DNA extraction, sequencing, phylogenetic analyses, generation of metagenomic assemblies and annotation of OLPV and OLV mosaic genomes, and protein extraction and metaproteomic analyses were performed as previously described (14, 36). Unfiltered Organic Lake water samples from 2006 were fixed in formalin 1% (vol/vol), negatively stained, and visualized by TEM for VLPs. A modified Lotka-Volterra model was used to describe algal host, virus, and virophage dynamics, on the basis of approaches previously described (14). Full details are provided in Materiais e métodos SI.


Resultados e discussão

Overall Structure of the Sputnik Virus.

A 3.5-Å resolution, icosahedrally averaged map (Fig. 1 A–D) was determined by image reconstruction using approximately 12,000 cryo-EM particles. In addition, a 3.8-Å resolution map of empty capsids was calculated using approximately 13,000 empty particles. There are 4 and 1/3 hexon capsomers in each icosahedral asymmetric unit of the virus, where the 1/3 hexon is from a hexon sitting on the icosahedral threefold axis. In addition there is 1/5 of a penton capsomer adjacent to the fivefold vertex in the asymmetric unit. After the hexon and penton densities had been interpreted there remained three similar uninterpreted densities, each representing nine amino acids, presumably corresponding to the same sequence of a minor capsid protein. These densities were located on the inside of the capsid, at the boundary between pairs of hexons (Fig. S1), but are absent in the empty capsids and must have been associated with the DNA so as to be able to exit along with the DNA.

Reconstruction of Sputnik at 3.5-Å resolution. (UMA) Reconstruction of the whole virus, colored according to radius. (B) Fourier shell correlation (FSC) coefficient plot showing the resolution of Sputnik reconstruction to be 3.5 Å (FSC = 0.143) according to the criterion defined by Rosenthal and Henderson (42). (C) Cryo-EM density of a β-strand in the MCP. (D) Cryo-EM density of selected residues, Phe, Arg, Trp, and Tyr (from left to right), showing the quality of the reconstruction.

Major Capsid Protein.

The structures of the 13 MCPs in the icosahedral asymmetric unit were built independently and then refined with the program CNS (27). The refined structure had an R-factor of 0.26 and 3.8% of residues in disallowed regions of the Ramachandran plot. Root-mean-square deviation of bond lengths from ideal values was 0.012 and that of angles was 1.7. The structure of the first 508 amino acids of each of the MCPs could be easily built using the amino acid sequence corresponding to gene V20 (Fig. 2 UMA e B) Residues 497–508 form an α-helix that is inserted into a hydrophobic pocket located in the center of each hexon. There is not enough space for amino acids that follow residue 508 to exit this pocket (Fig. 2C) Furthermore, an SDS/PAGE gel (Fig. 2D) shows that the molecular mass of the MCP is approximately 55 kDa, whereas the calculated molecular mass of the whole protein is 65.4 kDa. Therefore, the last 87 residues of the MCP must have been cleaved off probably during assembly. The overall structure of the MCP is a double jelly-roll fold with the BC, DE, FG, and HI loops pointing toward the quasi-sixfold axis of the capsomer, as in other jelly-roll–containing viral capsomers. Amino acids 1–279 of V20 form the first jelly-roll, and amino acids 280–507 form the second jelly-roll. As in the MCPs of PBCV-1 (Vp54), PRD1 (p3), and the adenovirus hexon, there is a “tower” structure created from the usual large insertions between strands D to E and F to G in both jelly-rolls (Fig. 2B) However, in Sputnik and PRD1 the insertion between strands H and I of the first jelly-roll also contributes to the tower structure. Furthermore, in Sputnik the insertion between strands F and G of the second jelly-roll contributes to the tower of the neighboring molecule.

Double jelly-roll structure of MCP. (UMA) Ribbon diagram of the Sputnik MCP. The first and second jelly-roll domains are colored green and red, respectively. (B) Diagrammatic representation of the arrangement of β-strands and residue numbers at the ends of the β-strands. (C) Stereo diagram showing the C-terminal region of the MCP. Residues 502–508 are colored orange. These residues bind into a hydrophobic pocket. There is no density or space for the remaining 87 C-terminal residues of the MCP sequence, suggesting that these residues had been cleaved. (D) Molecular mass of the MCP is estimated to be approximately 55 kDa by SDS/PAGE gel.

PBCV-1, PRD1, and vaccinia virus have a viral membrane, and their MCPs have highly positively charged surfaces facing the membrane (Fig. 3UMA) For Sputnik the surface of the MCP facing the inside of the virus has both negatively and positively charged patches (Fig. 3B) at neutral pH, similar to the charge distribution of the inside surface of the adenovirus hexon protein. Thus, the charge distribution of Sputnik’s MCP indicates that Sputnik probably does not have a viral membrane. The absence of a lipid membrane was further confirmed using paper spray mass spectroscopy (Figs. S2 and S3 Materiais e métodos SI) The ease with which the genome can be persuaded to be ejected from the capsid by changes of pH (see below) also speaks to the absence of a barrier, were a membrane present.

Comparison of the inner surface charge distribution of dsDNA virus MCPs with a double jelly-roll fold. (UMA) Viruses that have a lipid membrane envelope. (B) Viruses that do not have a lipid membrane envelope.

The region immediately inside the capsid protein appears as three parallel layers, each approximately 25 Å thick, in a 20-Å resolution low-pass filtered map (Fig. S4UMA) The reconstruction of the empty virus does not have these layers (Fig. S4B) Therefore, the three consecutive density layers within the capsid probably represent ordered or semiordered dsDNA, as is observed for many dsDNA bacteriophages (28, 29). The outermost layer is more intense, presumably because the DNA structure is closely associated with the icosahedral capsid structure. This conclusion contradicts the earlier results (9), based on a 10.7-Å resolution map and mass spectroscopic results, that the density in this region corresponds to a membrane. Although the cause of this discrepancy is unclear, the present mass spectroscopic results have been confirmed by both positive and negative controls using viruses with and without a lipid membrane, respectively (Figs. S2 and S3).

The earlier 10.7-Å resolution study (9) had shown that the external surface of the capsid was decorated with occasional, approximately 100-Å-long, mushroom-like fibers. These features were not visible in the 3.5-Å resolution map, demonstrating that these features are essentially disordered at a resolution of better than 11 Å. It is unknown whether these features are proteins or glycans.

Penton Protein.

The Sputnik cryo-EM density representing the pentons and especially the insertion loops is slightly poorer than that of hexon densities, probably caused by greater flexibility of the penton loops. A Cα atom model was built into the electron density map, identifying the location of approximately 350 amino acids. Because the sequence of the Sputnik penton protein was unknown, a program was designed to align the protein sequences given by the Sputnik genome, expressed in terms of amino acid sizes, with the sizes of the amino acids in the cryo-EM density map (Materiais e métodos SI) A satisfactory alignment was obtained for the approximately 150 N-terminal amino acids of gene product V18 and for the alignment of gene products V19 with the remaining C-terminal residues of the Cα atom penton structural model. In the gene sequencing results (2), there was a frame shift between the V18 and the initial bases of the V19 gene. However, according to the electron density map, the penton structure was only one polypeptide chain. Therefore, when the Sputnik genome was resequenced near the junction of these genes, it was found that the original sequence had one additional erroneous base that created a stop codon for V18. Thus, in the absence of the erroneous base, V18 and the whole V19 sequence were in the same frame without a stop codon between them, making V18 and V19 one V18/19 fusion gene, coding for 379 amino acids. The amino acid sequence was then built into the cryo-EM density except for 11 disordered amino acids at the N terminus and 5 disordered amino acids at the C terminus.

The penton protein folds into two domains: a “lower” domain that has a 184 amino acid jelly-roll structure located toward the interior of the virus, and an “upper” domain consisting of 195 amino acids (amino acids 66–261) located on the surface of the virus around the fivefold vertex (Fig. 4 UMA e B) The orientation of the five jelly-roll domains is roughly similar to the orientation of the VP1 subunits in picornaviruses. In Sputnik the β-strands are roughly radial, whereas in picornaviruses the β-strands are somewhat more tangential, but in both cases the BC, DE, FG, and HI loops are closest to the outside of the virus. The upper domain is primarily a β-barrel inserted between β-strands D and E of the lower jelly-roll domain. If the inserted β-strands along the polypeptide are named IA, IB, IC, ID, and IE, then the two β-sheets would consist of strands IB, IC, IE and of IA, ID. An α-helix, lying parallel to the β-strands, links β-strands IA and IB. The mean center position of the upper domain is rotated counterclockwise (seen from outside the virus) by approximately 60° around the fivefold axis, relative to the lower domain, placing the upper domain almost above the lower domain of the neighboring monomer. The penton has a pore along the fivefold axis with a diameter of 7–10 Å near the outside of the virus that is blocked near the base of the lower domain by residues 318–320. The closest structure found in a Dali search (30) was the penton protein of human adenovirus (31). The adenovirus penton structure has the same counterclockwise twist between the upper domain and lower domain as occurs in Sputnik. Like Sputnik, the upper domain of the adenovirus penton protein has the same fold as the upper domain of the Sputnik penton protein and is an insertion of 307 amino acids between β-strands D and E of the adenovirus lower domain. However, the adenovirus penton protein upper domain has an additional insertion of 53 amino acids between β-strands G and F. The adenovirus upper domain of the penton protein contains an Arg-Gly-Asp sequence that binds to the cellular αvβ3 receptor (32, 33). Only the nonenveloped viruses adenovirus and Sputnik have an insertion domain in their penton proteins. Sputnik, unlike adenovirus, does not have an Arg-Gly-Asp sequence or a fiber and attachment protein emanating from the fivefold vertices.

Single jelly-roll structure of sputnik penton protein. (UMA) Ribbon diagram of the Sputnik penton protein. The jelly-roll domain is colored green, and the insertion domain is colored red. (B) Diagrammatic representation of the arrangement of β-strands in the penton protein and the residue numbers at the ends of the β-strands.

Capsomer Interactions.

Any pseudohexameric capsomer formed by three double jelly-roll monomers has six edges (Fig. 5UMA) Each double jelly-roll monomer within a capsomer contributes to two edges, with each edge having an interaction with a neighboring capsomer. The interaction between neighboring capsomers can be divided into three classes. The first two classes form a pseudo-twofold axis between the first (f) edge of one capsomer (dominated by the CHEF sheet of the first jelly-roll) and the first (f) edge of a neighboring capsomer (ff), or between the second (s) edge of a capsomer (dominated by the CHEF sheet of the second jelly-roll) with the second (s) edge of another capsomer (ss). A third class of interaction (fs) is between the first (f) edge of one capsomer and the second (s) edge of a neighboring capsomer. This classification has similarities to that used to describe contacts between capsomers of PRD1 (34).

Asymmetric unit of Sputnik. (UMA) Capsomers are identified by Roman numerals I to V. Thirteen independent monomers are identified by Arabic numerals 1 to 13. Each MCP is shown by a green line (the first jelly-roll domain) followed by a blue line (the second jelly-roll domain). The independent minor proteins in the asymmetric unit are colored red. Icosahedrally related positions are indicated in the same manner but with corresponding faded colors. (B) The backbone of the MCP was colored according to the root mean square deviation of each Cα position from the mean of the superimposed 13 independent MCPs, ranging from blue (<0.6 Å) to red (>0.6 Å). (C) Number of times a given residue in the 13 independent MCPs is involved in capsomer to capsomer contacts ranging from blue (<8) to red (>8).

Each type of capsomer in one icosahedral asymmetric unit of Sputnik was identified by the Roman numerals I, II, III, IV, and V and the MCP monomers by Arabic numerals 1 to 13 (Fig. 5UMA) The rotational relationships between neighboring capsomers (Table S1) can be divided into a bend and twist component. The curvature of the viral capsid is determined by the bend angle. If all of the bend angles between neighboring capsomers were zero, then the capsomers would form a plane. The variation of bend angle was found to be limited to approximately 10°, 20°, and 40° degrees in the fs, ff, and ss classes, respectively.

Hydrogen bonds between capsomers were identified by visual inspection. The three classes of interactions, ff, ss and fs, could be subdivided into two or three subclasses depending on the conservation of hydrogen bonds (Table S1). Although there are five examples of class fs in the Sputnik structure, only three of these contact regions are associated with density probably representing the binding site of a minor capsid protein (see above). These three contact regions all belong to the same subclass fs-1, whereas the other two examples of fs contacts are associated with a different set of hydrogen bonds.

The root mean square deviation between equivalence Cα atoms is less than 0.43 Å on superimposing any pair of the 13 MCP structures on each other. However, there are specific regions where the MCP structure has greater variability (Fig. 5B), with displacements of the Cα atoms as much as 3.5 Å. These regions are mostly the loops at the top of each “tower” and in the CHEF β-sheets of the second jelly roll that make contacts with neighboring capsomers (Fig. 5C).

Empty Virus.

During the purification procedure of Sputnik (Materiais e métodos), the virus separated into two bands while sedimenting through a cesium chloride gradient. The two bands corresponded to the full and empty virus. Subsequent work showed that empty particles can be produced from full particles either by raising the pH to 9 or lowering the pH to 5.5. It is therefore possible that the purified empty Sputnik particles were produced in a low-pH virus factory (35) during Mimivirus production. The purified empty particles were used in the reconstruction of a 3.8-Å resolution cryo-EM map (Materiais e métodos and Fig. S5UMA) The empty Sputnik particles had a diameter that was approximately 5.2 Å larger than the diameter of the full infectious virus when measured along the threefold axes. However, there was no expansion along the fivefold axes. Presumably the expansion was made possible by the loss of interaction between the packaged DNA and the capsid structure.

The height of the penton density in the empty virus was approximately half of the hexon density, suggesting that some of the penton proteins were missing in the empty particles (Fig. 6UMA) Presumably the DNA had escaped from one of the vertices where there was no penton protein. Indeed, two particles that had been emptied by lowering the pH of the environment showed a feature that is probably DNA-like density spilling out from one of the vertices (Fig. S5B) A similar loss of the penton structure occurs for adenovirus, which can lose some pentons in the low-pH environment of an endosome (36). Similarly a mutant of the bacteriophage PRD1 can lose some pentons in the presence of a detergent, although PRD1, unlike Sputnik and Adenovirus, has a membrane (34). In the empty particle reconstruction of Sputnik, the electron density for residues 476–508 was missing in the MCP of monomer #1, the monomer adjacent to the penton (Fig. 6B) These residues are in the interface between the penton and hexon. However, it is not clear why these residues are completely disordered when only some of the pentons are missing, which would require disorder only in the #1 MCPs close to one of the missing penton sites. Thus, possibly the pH or other stress disorders these residues, resulting in only the loss of some pentons. The loss of pentons in double jelly-roll dsDNA viruses may be a general phenomenon for genome delivery.

Structure of the empty Sputnik. (UMA) Cross-section through the empty Sputnik cryo-EM map, showing where the density is at a higher level. The density of the penton protein is lower than that of the MCPs. (B) Electron density (red) of the hexon capsomer, adjacent to the penton protein in the empty virus (Deixou) and full virus (Direito) The Cα backbone structure (green) of MCP #1, closest to the penton. The electron density from residue 476 to residue 508 of MCP #1 is missing in the empty virus. The Cα backbone structure of penton protein is colored blue.

Evolução.

Single and double jelly-roll MCP structures have been observed in ssRNA, ssDNA, and dsDNA icosahedral viruses (19, 20, 34). In all these cases the jelly-roll is assembled into threefold symmetric capsomers that have quasi-sixfold symmetry. These capsomers are assembled into hexagonal arrays as predicted by Caspar and Klug (37), separated by approximately 75 Å center-to-center (19, 38). However, a double jelly-roll assembly is not feasible around the pentameric vertices. Hence, a single jelly-roll protein fold has been retained in all such viruses to complete the assembly around the pentameric vertices. For example, in picornaviruses the pentamer is formed by five copies of VP1 (13) in adenoviruses (39), PRD1 (40), PM2 (21, 22), and Sputnik the pentamer is formed by five copies of the penton molecule.

Many, but not all, dsDNA viruses that have a double jelly-roll capsid fold also have a lipid membrane envelope. Thus, the mode of genome delivery will be quite different for these viruses, even if the assembly process might be similar. Both Sputnik and adenovirus, neither of which have a membrane envelope, have a similarly structured inserted “upper” domain at the pentameric vertex that participates in viral entry for adenovirus (33, 41) and possibly therefore also in Sputnik. However, in contrast, PRD1 has a membrane and the penton is missing the “upper” insertion domain (22), suggesting a different genome delivery system.


Andrews, S. (2010). FastQC: A Quality Control Tool for High Throughput Sequence Data. Available online at: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/

Bellas, C. M., Anesio, A. M., and Barker, G. (2015). Analysis of virus genomes from glacial environments reveals novel virus groups with unusual host interactions. Frente. Microbiol. 6:656. doi: 10.3389/fmicb.2015.00656

Blanc, G., Gallot-Lavallພ, L., and Maumus, F. (2015). Provirophages in the Bigelowiella genome bear testimony to past encounters with giant viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, E5318�. doi: 10.1073/pnas.1506469112

Breitbart, M., and Rohwer, F. (2005). Here a virus, there a virus, everywhere the same virus? Trends Microbiol. 13, 278�. doi: 10.1016/j.tim.2005.04.003

Campos, R. K., Boratto, P. V., Assis, F. L., Aguiar, E. R., Silva, L. C., Albarnaz, J. D., et al. (2014). Samba virus: a novel mimivirus from a giant rain forest, the Brazilian Amazon. Virol. J. 11:95. doi: 10.1186/1743-422X-11-95

Darling, A. C., Mau, B., Blattner, F. R., and Perna, N. T. (2004). Mauve: multiple alignment of conserved genomic sequence with rearrangements. Genome Res. 14, 1394�. doi: 10.1101/gr.2289704

Desnues, C., La Scola, B., Yutin, N., Fournous, G., Robert, C., Azza, S., et al. (2012). Provirophages and transpovirons as the diverse mobilome of giant viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18078�. doi: 10.1073/pnas.1208835109

Edgar, R. C. (2004). MÚSCULO: alinhamento de sequência múltipla com alta precisão e alto rendimento. Nucleic Acids Res. 32, 1792�. doi: 10.1093/nar/gkh340

Fischer, M. G., and Suttle, C. A. (2011). A virophage at the origin of large DNA transposons. Ciência 332, 231�. doi: 10.1126/science.1199412

Gaia, M., Benamar, S., Boughalmi, M., Pagnier, I., Croce, O., Colson, P., et al. (2014). Zamilon, a novel virophage with Mimiviridae host specificity. PLoS ONE 9:e94923. doi: 10.1371/journal.pone.0094923

Guindon, S., Lethiec, F., Duroux, P., and Gascuel, O. (2005). PHYML Online𠄺 web server for fast maximum likelihood-based phylogenetic inference. Nucleic Acids Res. 33, W557–W559. doi: 10.1093/nar/gki352

Ignacio-Espinoza, J. C., Solonenko, S. A., and Sullivan, M. B. (2013). The global virome: not as big as we thought? Curr. Opin. Virol. 3, 566�. doi: 10.1016/j.coviro.2013.07.004

Jones, P., Binns, D., Chang, H. Y., Fraser, M., Li, W., McAnulla, C., et al. (2014). InterProScan 5: genome-scale protein function classification. Bioinformática 30, 1236�. doi: 10.1093/bioinformatics/btu031

King, A. M., Adams, M. J., and Lefkowitz, E. J. (2011). Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature of Viruses. Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, Elsevier.

Krupovic, M., Bamford, D. H., and Koonin, E. V. (2014). Conservation of major and minor jelly-roll capsid proteins in Polinton (Maverick) transposons suggests that they are bona fide viruses. Biol. Direto 9:6. doi: 10.1186/1745-6150-9-6

Krupovic, M., and Koonin, E. V. (2015). Polintons: a hotbed of eukaryotic virus, transposon and plasmid evolution. Nat. Rev. Microbiol. 13, 105�. doi: 10.1038/nrmicro3389

Krupovic, M., Kuhn, J. H., and Fischer, M. G. (2016). A classification system for virophages and satellite viruses. Arco. Virol. 161, 233�. doi: 10.1007/s00705-015-2622-9

La Scola, B., Desnues, C., Pagnier, I., Robert, C., Barrassi, L., Fournous, G., et al. (2008). The virophage as a unique parasite of the giant mimivirus. Natureza 455, 100�. doi: 10.1038/nature07218

Marchler-Bauer, A., Lu, S., Anderson, J. B., Chitsaz, F., Derbyshire, M. K., Deweese-Scott, C., et al. (2011). CDD: a Conserved Domain Database for the functional annotation of proteins. Nucleic Acids Res. 39, D225�. doi: 10.1093/nar/gkq1189

Patel, R. K., and Jain, M. (2012). NGS QC Toolkit: a toolkit for quality control of next generation sequencing data. PLoS ONE 7:e30619. doi: 10.1371/journal.pone.0030619

Roux, S., Tournayre, J., Mahul, A., Debroas, D., and Enault, F. (2014). Metavir 2: new tools for viral metagenome comparison and assembled virome analysis. BMC Bioinform. 15:76. doi: 10.1186/1471-2105-15-76

Yau, S., Lauro, F. M., DeMaere, M. Z., Brown, M. V., Thomas, T., Raftery, M. J., et al. (2011). Virophage control of antarctic algal host-virus dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 6163�. doi: 10.1073/pnas.1018221108

Yutin, N., Kapitonov, V. V., and Koonin, E. V. (2015). A new family of hybrid virophages from an animal gut metagenome. Biol. Direct. 10, 19. doi: 10.1186/s13062-015-0054-9

Zablocki, O., van Zyl, L., Adriaenssens, E. M., Rubagotti, E., Tuffin, M., Cary, S. C., et al. (2014). High-level diversity of tailed phages, eukaryote-associated viruses, and virophage-like elements in the metaviromes of antarctic soils. Appl. Environ. Microbiol. 80, 6888�. doi: 10.1128/AEM.01525-14

Zhang, Q., Ding, C., Achal, V., Shan, D., Zhou, Y., Xu, Y., et al. (2014). Potential for nutrient removal by integrated remediation methods in a eutrophicated artificial lake - a case study in Dishui Lake, Lingang New City, China. Water Sci. Technol. 70, 2031�. doi: 10.2166/wst.2014.453

Zhang, W., Zhou, J., Liu, T., Yu, Y., Pan, Y., Yan, S., et al. (2015). Four novel algal virus genomes discovered from Yellowstone Lake metagenomes. Sci. Rep. 5:15131. doi: 10.1038/srep15131

Zhou, J., Sun, D., Childers, A., McDermott, T. R., Wang, Y., and Liles, M. R. (2015). Three novel virophage genomes discovered from yellowstone lake metagenomes. J. Virol. 89, 1278�. doi: 10.1128/JVI.03039-14

Zhou, J., Zhang, W., Yan, S., Xiao, J., Zhang, Y., Li, B., et al. (2013). Diversity of virophages in metagenomic data sets. J. Virol. 87, 4225�. doi: 10.1128/JVI.03398-12

Keywords: virophage, genome, metagenomics, freshwater lake, diversity

Citation: Gong C, Zhang W, Zhou X, Wang H, Sun G, Xiao J, Pan Y, Yan S and Wang Y (2016) Novel Virophages Discovered in a Freshwater Lake in China. Frente. Microbiol. 7:5. doi: 10.3389/fmicb.2016.00005

Received: 02 November 2015 Accepted: 05 January 2016
Published: 22 January 2016.

Bernard La Scola, Aix Marseille Université, France

Christelle Desnues, URMITE Centre National de la Recherche Scientifique UMR 7278, France
Matthias Fischer, Max Planck Society, Germany

Copyright © 2016 Gong, Zhang, Zhou, Wang, Sun, Xiao, Pan, Yan and Wang. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Creative Commons Attribution License (CC BY). É permitida a utilização, distribuição ou reprodução em outros fóruns, desde que o (s) autor (es) ou licenciador (a) original (is) sejam creditados e que a publicação original nesta revista seja citada, de acordo com a prática acadêmica aceita. Não é permitida a utilização, distribuição ou reprodução em desacordo com estes termos.


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