Em formação

Um composto foi proposto por erro, mas depois mostrou propriedades inibidoras muito boas. Como argumentar isso em um manuscrito?


Em um projeto, realizamos alguns cálculos de triagem virtual para prever inibidores e, em seguida, compramos os compostos e os testamos em laboratório. Um deles era um inibidor de TK muito bom (IC50 nM).

No entanto, quando processamos os resultados, percebemos que a presença desse composto específico na lista original de ocorrências de triagem virtual foi devido a erros nos cálculos originais (ele foi adicionado à lista por fatores aleatórios, não por pontuação de encaixe).

Portanto, agora estamos escrevendo o artigo e nos perguntamos como argumentar isso. Não podemos simplesmente contar a história como neste post (foi descoberta por acaso ou por erro nosso). Como você argumentaria sobre isso?


Seja honesto (e possivelmente divida os papéis).

Se o composto foi identificado como um erro e você deseja incluir em um artigo que descreva o processo de sua simulação e a eficácia dos inibidores previstos, você terá que fazer isso como uma espécie de controle negativo para seus cálculos (a menos que haja alguma forma de reproduzir / racionalizar por que ele apareceu aleatoriamente). Já que este é o único inibidor bom que você tem, você teria que concluir que seu cálculo não é muito melhor do que o acaso, ou explicar por que ele é melhor, embora você tenha encontrado um inibidor melhor por acaso. Se você tiver motivos para argumentar que seus cálculos são bons e fazem sentido, exclua o inibidor 'aleatório' desse papel. Você pode escrever um artigo individual sobre um bom inibidor, o fato de que você o encontrou por acaso não é mais tão importante.


Cimento carregado com antibióticos em cirurgia ortopédica: uma revisão

As infecções em cirurgia ortopédica são um problema sério. O cimento ósseo com antibiótico foi desenvolvido para o tratamento de artroplastias articulares infectadas e para profilaxias na substituição total da articulação em casos selecionados. Apesar do uso difundido do cimento ósseo com antibiótico em ortopedia, muitas questões ainda não estão claras ou são controversas: adesão bacteriana e resistência aos antibióticos, modificação das propriedades mecânicas que seguem a adição do antibiótico, fatores que influenciam a liberação do antibiótico do cimento e o papel da superfície, o método para misturar o cimento e o antibiótico, a escolha e a eficácia do antibiótico, a combinação de dois ou mais antibióticos e a toxicidade. Esta revisão discute todos esses tópicos, com foco nas propriedades, méritos e defeitos do cimento carregado com antibiótico. O objetivo final é fornecer ao cirurgião ortopédico informações claras e concisas para a escolha correta do cimento em sua prática clínica.

1. Introdução

O objetivo desta revisão é analisar as principais questões dos cimentos ósseos carregados com antibióticos e comentar suas propriedades básicas, principais características, méritos e defeitos. O objetivo final é fornecer aos cirurgiões ortopédicos informações claras e concisas para a escolha correta do cimento carregado com antibiótico na prática clínica.

1.1. Biomateriais, infecções e ortopedia

A presença de biomateriais em cirurgia ortopédica envolve um alto risco de desenvolvimento de infecções profundas [1]. Um dos principais fatores é o fenômeno de adesão da bactéria aos biomateriais e a produção de um biofilme a partir das cepas bacterianas [2–5]. De fato, foi demonstrado que as bactérias têm a capacidade de se ligar à superfície dos biomateriais, devido a propriedades físicas e químicas específicas [2, 6, 7]. As infecções em torno das artroplastias articulares estão entre as mais difíceis de tratar e curar. Até décadas atrás, os antibióticos disponíveis para a prevenção e o tratamento das infecções ortopédicas eram poucos e esses antibióticos poderiam ter sido ineficazes contra certas bactérias como estafilococos e gram-negativas. Com a disseminação da substituição da prótese articular na década de setenta, o problema aumentou [1, 8–10]. Na verdade, a base do tratamento de uma prótese articular infectada é baseada na remoção do implante e nos produtos de toalete precisos ao redor do tecido ósseo e mole necrótico circundante, seja na técnica em dois estágios ou em dois estágios [11–13].

O posicionamento no sítio cirúrgico de cimento carregado com antibióticos pode ser útil para manter em nível local uma alta concentração do fármaco, que não poderia ser alcançada pela administração venosa sem complicações gerais e toxicidade [14, 15]. No entanto, a real eficácia do cimento carregado com antibiótico está atualmente em debate [16]. Após o tratamento cirúrgico e a higienização, a administração sistêmica de antibióticos por tempo prolongado torna-se obrigatória, não bastando apenas o banheiro. Após anos de debate científico, ainda existem muitas dúvidas e opiniões conflitantes sobre vários aspectos do uso do cimento antibiótico: o método de preparo, a escolha do antibiótico, a liberação e difusão eficazes do antibiótico nos tecidos circundantes, e a propriedades mecânicas do cimento carregado com antibiótico.

2. Desenvolvimento de cimento e infecções articulares

Objeto desta revisão, o denominado cimento ósseo é um material à base de polímero composto por polimetilmetacrilato (PMMA) ou copolímeros, é um material polimérico comumente utilizado para a fixação de implantes articulares ao osso.

Nos últimos anos, graças ao aprimoramento das técnicas cirúrgicas, à adoção de procedimentos anti-sépticos rigorosos e eficazes, pré-operatórios e intra-operatórios e, sobretudo, graças à otimização da antibioticoprofilaxia sistêmica perioperatória, uma redução significativa do número de infecções profundas e revisões subsequentes ocorreram [17–20]. Estimou-se que a taxa de infecções foi reduzida de 5–10% para aproximadamente 1-2% durante os últimos vinte anos. Dentre os diversos procedimentos de combate à infecção periprotética, o uso de cimento ósseo enriquecido com antibiótico é amplamente utilizado [21], principalmente em casos de revisão e falência séptica das artroplastias. Mais de 30 anos atrás, Bulchoz e Engelbrecht relataram que a penicilina, eritromicina, gentamicina introduzida no cimento usado para estabilizar o quadril, se espalhou nos tecidos circundantes por meses, trazendo como resultado uma concentração local prolongada de antibiótico [22]. Após esses achados, cresceu o interesse pela aplicação de cimento impregnado com antibiótico no tratamento da osteomielite. Em 1979, como alternativa à introdução de grandes depósitos de cimento antibiótico no local da osteomielite crônica, Klemm introduziu a gentamicina nos grânulos de cimento e os utilizou como preenchimento temporário da lacuna criada após a remoção do tecido necrótico. O cimento impregnado com antibiótico (ALBC: cimento ósseo carregado com antibiótico), desde o final dos anos 90, passou a ser cada vez mais utilizado na prevenção das infecções relacionadas à artroplastia. Além disso, ao longo do tempo, esta escolha sofreu mudanças e melhorias significativas no que diz respeito à formulação química, as técnicas de preparação e aplicações clínicas [22].

3. Adesão bacteriana e resistência a antibióticos

A adição de antibióticos ao cimento deve ser considerada como uma estratégia de apoio na prevenção do aparecimento de infecções e não a solução: o ponto chave ainda é representado pela esterilidade na sala de cirurgia e pelos procedimentos cirúrgicos anti-sépticos. No entanto, qualquer procedimento que possa potencialmente reduzir a adesão e a colonização bacteriana é bem-vindo em ortopedia. Foram formuladas hipóteses sobre a eficácia da adição de antibióticos em termos de redução do biofilme bacteriano nos diferentes tipos de cimento e surgiu como um processo multifatorial, não relacionado apenas à cinética de liberação do antibiótico. Alguns sustentaram que a produção a partir da bactéria de uma espécie de glicocálice (estrutura extracelular que cobre a superfície externa dos tecidos com uma “bainha” encontrada principalmente nos epitélios), que adere ao biomaterial, provoca alterações fisiológicas nas próprias bactérias e confere resistência a antibióticos [16, 23]. Outros propuseram que o principal fator pode ser a hidrofobicidade do material implantado, as interações eletrostáticas e / ou a rugosidade da superfície [24, 25]. Evidências emergentes mostraram que a adesão bacteriana a um biomaterial é resultado do desenvolvimento da resistência aos antibióticos [22]. Foi hipotetizado que o crescimento bacteriano é privilegiado em certos biomateriais: por exemplo, os estafilococos coagulase negativos prefeririam aderir ao cimento ósseo, enquanto S. aureus mostraria adesão preferencial a biomateriais metálicos [26]. A exposição prolongada ao antibiótico em concentração de dose inferior à inibitória, permite o desenvolvimento de resistência mutacional nas bactérias. Portanto, o amplo uso clínico de ALBC com fins preventivos deve ser cuidadosamente considerado [16, 22]. O uso de cimento adicionado de gentamicina para primeiros implantes foi associado ao desenvolvimento de estafilococos coagulase-negativos resistentes a essa droga [27]. Além disso, cepas bacterianas resistentes à gentamicina foram encontradas em 88% dos casos de infecção em artroplastia onde o cimento foi carregado com antibiótico, em comparação com os 16% encontrados após aqueles em que o cimento comum foi usado [28, 29]. Outro fator importante para a adesão de bactérias é a rugosidade da superfície: em geral quanto maior a rugosidade, maior a adesão e o PMMA é caracterizado por uma superfície rugosa [11].

4. O Uso de Cimento Ósseo Carregado com Antibióticos: Princípios Gerais

O PMMA entra na sala de cirurgia embalado em monômero (líquido) e polímero (pó) separadamente. No momento do preparo, ao ser misturado, torna-se uma pasta material viscosa, que se solidifica em poucos minutos por reação exotérmica. Ele atua como uma fixação entre os componentes protéticos e o osso esponjoso. Durante a mistura, poros de diferentes tamanhos são produzidos como conseqüência da reação química e variações de volume. Esses microfuros podem representar o ponto inicial de trincas e, portanto, podem ser responsáveis ​​pela quebra prematura do cimento. Para evitar a formação desses poros, é possível preparar o cimento sob vácuo. No entanto, o preparo a vácuo leva a uma maior redução de volume durante a polimerização, resultando em maior retração e pior aderência na interface osso-prótese em comparação ao cimento não misturado a vácuo. Foi demonstrado que entre os compostos preparados na sala de cirurgia, aqueles feitos sob condições de vácuo apresentam propriedades mecânicas melhoradas [30–32]. Porém, não é objetivo deste trabalho discutir o método de preparo do cimento e as vantagens ou desvantagens relativas do preparo a vácuo sobre as propriedades biomecânicas.

Alguns autores não recomendam o uso do cimento antibiótico na artroplastia primária [30], primeiro para a redução das propriedades mecânicas e, segundo, porque seu uso disseminado pode levar à seleção de bactérias resistentes aos antibióticos. O uso de cimento carregado com antibiótico em implantes primários é indicado em pacientes com risco cirúrgico de hag, em pacientes idosos, em pacientes com problemas gerais de saúde como imunodepressão, diabetes, história de infecções protéticas e periprotéticas anteriores e doenças particulares, como reumatoide artrite e LES, ou em condições de desnutrição [33, 34]. Em contraste, o uso do cimento carregado com antibiótico é recomendado pela maioria dos autores para revisões de artroplastias articulares, que apresentam maior risco de infecção em comparação com os primeiros implantes [33, 34]. O uso do cimento com antibiótico é particularmente indicado para revisões sépticas [30]. A revisão de uma artroplastia articular infectada pode ser realizada em uma única operação cirúrgica (um estágio), onde a retirada do implante e do tecido infectado e necrótico é seguida por uma limpeza precisa da área e pelo implante do novo prótese. Ao contrário, a revisão pode ser realizada com a técnica chamada de “dois estágios”, onde o primeiro passo é a retirada do implante e o toalete cirúrgico, em seguida, um espaçador provisório é implantado e, finalmente, a nova prótese é implantada em um distância de 6–8 semanas após a cirurgia com uma nova operação [12, 13, 35]. Durante o período de tempo entre as duas cirurgias, a área da articulação limpa pode ser deixada vazia ou mais comumente preenchida com um espaçador. O cimento carregado com antibiótico é o espaçador mais utilizado, devido à sua plasticidade e capacidade de liberação do antibiótico. no local [27, 30, 36]. Nesse caso, um efeito local terapêutico é adicionado à função primária do espaçador: evitar a retração dos tecidos e manter o espaço articular, facilitando assim a cirurgia de revisão [37].

5. Método para misturar o cimento e o antibiótico

O método de mistura é considerado um dos fatores mais importantes que afetam a liberação dos antibióticos e as propriedades mecânicas do cimento. A preparação deve ser o mais porosa possível para aumentar a propagação do antibiótico, mas não excessivamente porosa para enfraquecer a estrutura do próprio cimento. Uma distinção fundamental diz respeito ao método de adição do antibiótico ao cimento: misturando manualmente no momento da implantação ou mistura industrial por várias empresas que fornecem cimento ósseo carregado com antibiótico pré-misturado [31, 38, 39].

O antibiótico deve ser um preparo em pó para uma melhor integração com o cimento e uma menor interferência nas propriedades mecânicas do cimento [39]. Até agora, nenhum estudo foi realizado para correlacionar as mudanças na liberação do antibiótico com a temperatura. Deve-se considerar, entretanto, que o processo de polimerização do cimento é uma reação exotérmica com temperaturas de até 60 ° -80 ° C. Portanto, os antibióticos destinados a serem misturados ao cimento devem ser química e termicamente estáveis ​​[40]. O preparo manual, segundo estudo realizado no Simplex-P enriquecido com tobramicina, reduz a resistência do cimento em 36% em relação ao ALBC preparado industrialmente [30]. A melhora das propriedades mecânicas devido à maior compactação da estrutura do cimento, entretanto, pode levar a uma diminuição na taxa de difusão do antibiótico [32]. Essa diferença, entretanto, não é considerada significativa pela maioria dos cirurgiões.

6. A escolha do antibiótico

A escolha do antibiótico é uma questão fundamental. O antibiótico deve ter um amplo espectro antibacteriano (incluindo bactérias gram positivas e gram negativas) e uma baixa porcentagem de espécies resistentes. Os antibióticos mais comumente misturados são gentamicina e tobramicina (aminoglicosídeos com eficácia particular contra bactérias gram-negativas) e vancomicina (glicopeptídeo ativo principalmente em gram-positivas, por exemplo, Staphylococcus aureus) Além disso, o antibiótico deve fornecer uma concentração local capaz de superar o “limite de sensibilidade do ponto de quebra” dos patógenos. Isso geralmente é definido como a concentração de antibiótico que marca a transição da sensibilidade bacteriana para a indução para resistência aos antibióticos por pelo menos três ou quatro semanas. O objetivo final é atingir concentrações adequadas de antibióticos nos tecidos e ossos evitando a toxicidade da concentração dos fármacos [22].

Um estudo mostrou que estafilococos coagulase negativos são encontrados em 88% das infecções em pacientes submetidos a uma artroplastia primária onde foi usado cimento carregado com gentamicina [41]. Um estudo [42] em vitro analisou o comportamento de Staphylococcus aureus em função da cinética de liberação de gentamicina em diferentes cimentos: nenhum dos cimentos carregados com antibióticos foi capaz de reduzir imediatamente o crescimento de bactérias, mas todos levaram a uma diminuição significativa no crescimento bacteriano se comparados com cimentos não antibióticos. Aparentemente, o cimento CMW3 mostrou a capacidade de reduzir a colonização bacteriana por um período mais longo (24–72 horas) em comparação com outros cimentos. Observou-se também que a gentamicina pode atuar de forma diferente quando adicionada a diferentes cimentos, embora o mecanismo de adesão bacteriana seja sempre o mesmo. Por exemplo, foi demonstrado que a liberação de gentamicina é muito mais eficaz em Palacos do que em Simplex [14]. Da mesma forma, mudanças na eluição relacionadas ao tipo de cimento foram encontradas também para a vancomicina. A liberação desse antibiótico foi comparada em três tipos diferentes de cimento (CMW1, Palacos-R e Simplex-P) e o primeiro mostrou uma liberação aumentada em comparação com os outros dois [43]. Outros estudos em vários cimentos (Cemex, Palacos e Simplex) demonstraram que a vancomicina sozinha teve uma liberação menor e menos eficaz em comparação com a gentamicina [44]. Essa menor difusão da vancomicina estaria relacionada a diversos fatores como as propriedades físico-químicas do antibiótico, o peso molecular, a estabilidade das moléculas na presença de fluidos biológicos, a temperatura, bem como as diferentes morfologias do próprio cimento (porosidade, rugosidade, superfície, etc.). O tipo de cimento e o método de preparo podem modificar a eluição do antibiótico, embora outros estudos afirmem o contrário e argumentem que a disseminação da vancomicina e da tobramicina não dependeria do tipo de cimento usado [45].

Um estudo [40] mostrou que a tobramicina adicionada ao cimento Simplex tem boa atividade contra 98% das bactérias testadas, usando um amplo espectro de patógenos clinicamente relevantes em infecções ortopédicas (bactérias aeróbias Gram-positivas e Gram-negativas, anaeróbias, e mycobacterium). Bactérias resistentes à tobramicina nas concentrações sistêmicas usuais, como Enterococcus faecalis, estafilococos resistentes à meticilina e Staphylococcus epidermidis, exibiram uma sensibilidade limitada também ao antibiótico liberado do cimento.O estudo confirmou a eficácia da tobramicina ligada ao PMMA para a prevenção e redução de infecções causadas por um amplo espectro de microrganismos: a tobramicina é estável durante a polimerização exotérmica do cimento e sua liberação na superfície do PMMA ocorre em concentrações que geralmente inibem o crescimento da maioria das bactérias examinadas. Outro estudo dos mesmos autores [46] comparou os dois principais aminoglicosídeos usados ​​em cirurgia protética, gentamicina e tobramicina, respectivamente, adicionados ao Palacos e ao Simplex. Os resultados mostraram que a tobramicina Simplex tem atividade antibacteriana contra 98% das cepas testadas de P. Aeruginosa, enquanto a Palacos-gentamicina contrasta com 93% da mesma bactéria. Esses resultados sugerem uma atividade antibacteriana da tobramicina de 2 a 8 vezes melhor do que a gentamicina. Os aminoglicosídeos atuam por meio de um mecanismo diretamente correlacionado à concentração, portanto, o aumento da dose dos antibióticos corresponde a um aumento da eficácia antibacteriana. Além disso, a liberação de antibiótico está positivamente correlacionada à quantidade adicionada ao cimento [47].

7. Dose de antibiótico

A dosagem do antibiótico varia de acordo com o uso a que se destina o cimento. Muitos autores argumentam que em caso de infecções agudas devem ser utilizadas altas doses de antibióticos: mais de 2 g a cada 40 g de cimento, geralmente de 6 a 8 g a cada 40 g, para uma liberação prolongada e eficaz contra patógenos [16, 22, 48]. Já se o ALBC for usado para profilaxia em primeiros implantes, onde a primeira função do cimento é fixar o implante, o antibiótico pode ser misturado em baixas doses: menos de 2 g a cada 40 g de cimento antibiótico. Uma dose inadequada pode ser apontada como causa do insucesso da prótese, pois pode gerar o surgimento de bactérias resistentes [16, 22, 48].

8. Associação de mais de um antibiótico no cimento ósseo

Foi estudada a atividade de liberação de dois ou mais antibióticos do cimento ósseo. A ideia de adicionar mais de um único antibiótico surgiu após o surgimento de bactérias resistentes e após a possível combinação sinérgica de dois antibióticos tornou-se uma prática cada vez mais comum em infectivologia (geralmente, vancomicina e aminoglicosídeos são frequentemente combinados por seu potencial efeito sinérgico no tratamento de infecções graves causadas pelo S. aureus) Desde 1970, tem sido documentado que β-Os antibióticos lactâmicos podem ser combinados com a maioria dos aminoglicosídeos, quando há alta concentração de ambas as substâncias ou quando sua excreção é retardada. A combinação de uma molécula de um β-lactama com uma molécula de aminoglicosídeo pode inativar quantidades equimolares de ambos os antibióticos. Quando altas doses de ambas as substâncias são combinadas ao cimento, a inativação destas pode afetar as propriedades da combinação, mas esse fenômeno ainda não foi estudado [41].

Um estudo realizado em 20 pacientes com infecções devido a S. aureus, S. epidermidis, E. coli e P. aeruginosa, mostraram uma eficácia superior de espaçadores carregados com uma combinação de gentamicina e vancomicina em comparação com espaçadores carregados apenas com gentamicina [36]. A capacidade emergente de sobrevivência estafilocócica em materiais protéticos e o em vitro Os efeitos da gentamicina e do polimetilmetacrilato (PMMA) carregados com vancomicina foram estudados em cepas estafilocócicas adquiridas em hospitais sistematicamente inoculadas em quatro materiais ortopédicos: Polietileno de Peso Molecular Ultra-Alto (UHMPWE), Cimento palmado sem antibióticos, Cimento Palamed-G e Palamed-G carregado com vancomicina (1 g de antibiótico a cada 40 g de cimento) [49]. A amostra com associação de vancomicina-gentamicina foi a mais efetivamente protegida da colonização bacteriana. O resultado é coerente com outros testes semelhantes realizados por outros autores em outros cimentos (Palamed e Palacos) e vários antibióticos em outras cepas de bactérias [50, 51].

O efeito aditivo ou sinérgico da tobramicina na vancomicina liberada do cimento acrílico foi demonstrado [52]. Este fenômeno foi chamado de “oportunismo passivo” porque o segundo antibiótico parece agir simplesmente como um aditivo passivo solúvel. A eluição da tobramicina e da vancomicina sozinhas e combinadas a partir dos discos de cimento acrílico foi estudada: foi demonstrado que a combinação de dois antibióticos em cimento ósseo melhora a eluição de ambos os antibióticos em vitro e pode se traduzir em eluição aprimorada na Vivo [53].

As características de eluição da vancomicina e da tobramicina sozinhas e juntas foram comparadas em dois tipos de cimento, Palacos e Simplex [15], divididos em três grupos: um primeiro grupo (baixo) continha 1,2 g de tobramicina e 1 g de vancomicina, um segundo grupo (médio) 2,4 g de tobramicina e 2 g de vancomicina e um terceiro grupo (alto) 3,6 g de tobramicina e 3 g de vancomicina. Em dose baixa, ambos os antibióticos mostraram eluição muito baixa, bem como Simplex no grupo de dose média. Palacos resultou em uma liberação maior do que Simplex em grupos de dose média e alta. Em particular, Palacos com alta concentração de antibióticos apresentaram um nível de atividade que ultrapassou por mais de oitenta dias o nível de concentração inibitória mínima (CIM) dos patógenos mais comuns [15]. Além disso, a quantidade de tobramicina liberada de Palacos foi maior do que a do Simplex (10 dias). Considerando a vancomicina, a cinética de eluição foi inadequada nos três grupos para ambos os cimentos (tomando como limite a detecção de 25 µg / mL). No entanto, a vancomicina resultou ativa no primeiro dia. Considerando a tobramicina, para os grupos com dose baixa e média foi observada novamente uma inadequação na cinética de liberação, mas para o grupo com dose alta (especialmente para Palacos) a duração da liberação foi alta. Em geral, Palacos tem um nível de liberação muito mais alto (acima do MIC para os patógenos mais comuns encontrados) e por um período mais longo em comparação com o Simplex e a tobramicina mostrou um perfil de eficácia melhorado em comparação com a vancomicina [53, 54]. No entanto, a combinação dos dois antibióticos aumenta muito a liberação e, a probabilidade, a eficácia [36]. Em outro estudo sobre a combinação de antibióticos [38], a liberação de antibióticos de um espaçador em vitro foi medido com o objetivo de estabelecer o melhor emparelhamento cimento-antibiótico contra bactérias específicas (S. aureus, S. epidermidis, Enterococcus faecalise MRSA). Palacos-R e três antibióticos diferentes (gentamicina, vancomicina e teicoplanina) foram usados ​​isoladamente ou em combinação (gentamicina mais vancomicina ou teicoplanina mais gentamicina). O estudo mostrou que a combinação de dois antibióticos em um espaçador tem uma atividade bactericida mais prolongada do que um espaçador carregado com um único antibiótico. Além disso, a ação sinérgica da gentamicina e da teicoplanina teve atividade bactericida superior em comparação com a gentamicina e a vancomicina e o acoplamento de um glicopeptídeo com um aminoglicosídeo abrange as bactérias Gram-negativas e Gram-positivas.

9. Fatores que influenciam a liberação de antibiótico do cimento e o papel da superfície

Segundo alguns autores, a liberação do antibiótico pode durar vários dias [15], enquanto para a maioria dos autores o processo ocorre apenas nos primeiros dias [55]. Outros sustentam que é um processo que dura poucas horas [56]. A quantidade e a duração da liberação do antibiótico do cimento é uma questão debatida que ainda não foi completamente compreendida [3, 22, 30, 55, 56].

A liberação do antibiótico do cimento é influenciada pelo tipo (viscosidade) do cimento, pela superfície de contato / troca, pelas condições do composto e pelo tipo e quantidade de antibiótico. O antibiótico é liberado da superfície do cimento e de rachaduras e vazios no próprio cimento [57]. A natureza do polímero permite a passagem de fluidos, permitindo a liberação do antibiótico incorporado. No entanto, enquanto a hidrofobicidade do cimento limita essa liberação em menos de 10%, a maior parte do antibiótico é liberada nas primeiras horas e dias após a cirurgia [58]. Além disso, uma quantidade significativa ainda pode ficar presa no cimento por um longo tempo [58]. Segundo estudo [59], o Palamed, dado o mesmo procedimento de preparo, é o cimento que permite a maior liberação de antibiótico ao longo do tempo (17%), em comparação com Palacos (8,4%) e CMW (4-5,3%) . Muitos autores interpretam essa liberação como um fenômeno de superfície, enquanto outros discutem o que ocorre em toda a matriz polimérica. Foi demonstrado que a liberação inicial é diretamente proporcional à rugosidade da superfície: quanto maior a rugosidade, maior a área de liberação [36, 48]. Além disso, uma correspondência linear após uma semana entre a porosidade do cimento e a liberação do antibiótico foi demonstrada: a liberação contínua após vários dias dependeria da penetração profunda do antibiótico no cimento previamente determinado pela porosidade [36, 48 ]

Foi estudado o efeito do contato direto com a superfície de biomateriais, como o PMMA, sobre as características da bactéria e uma conseqüente possível mudança na população e resistência bacteriana [60]. Além disso, diferentes tipos de antibióticos foram avaliados para este assunto: β-lactamas, aminoglicosídeos, macrolídeos e outros que investigam a suscetibilidade a antibióticos tanto de bactérias aderentes ao cimento quanto de bactérias não aderentes. O contato com o material apresentou diferenças significativas em termos de crescimento para todos os antibióticos testados, com exceção da clindamicina. Esses dados sugerem que as características da superfície do material podem ser importantes na interação com bactérias e que o cimento ósseo pode levar a alterações na adesão bacteriana ao biomaterial modificando a resistência aos antibióticos [60, 61].

10. Propriedades Mecânicas do Cimento Antibiótico

Foi sugerido, como mencionado acima, que a adição de antibióticos pode desempenhar um papel no enfraquecimento da estrutura e das propriedades mecânicas do cimento. Vários cimentos e antibióticos foram comparados para determinar qual poderia ser o mais resistente ao longo do tempo: estudos realizados em Palacos-R, CMW1 e CMW3 com e sem adição de gentamicina ou Simplex-P com eritromicina, colistina ou tobramicina não mostram efeitos significativos na resistência à fadiga em comparação aos respectivos cimentos simples [33]. Deve-se notar que a maioria dos estudos que demonstraram uma desvantagem teórica do cimento carregado com antibióticos são em vitro estudos [47]. Pelo contrário, a maioria dos estudos clínicos relatou um aumento da taxa de falhas mecânicas quando altas dosagens foram usadas em comparação com o ALBC carregado em baixas doses [47, 49].

11. Toxicidade

Até onde sabemos, não há relatos na literatura de toxicidade sistêmica relacionada ao uso de ALBC. Várias pesquisas enfocaram a toxicidade local, com particular interesse para a função de osteoblastos e osteócitos: evento embora não haja relatos de efeitos adversos clínicos nessas células, alguns em vitro estudos levantaram dúvidas sobre o assunto. Além disso, as preocupações são mais consistentes no caso de cimento carregado em altas doses, onde os níveis locais de antibióticos podem ultrapassar 200 µg / mL. Em particular, quando os osteoblastos derivados do osso trabecular foram expostos a materiais contendo várias concentrações de gentamicina (0 a 100 µg / mL), a atividade dos fosfatos alcalinos diminuiu significativamente em todas as culturas com concentração de gentamicina & gt100 µg / mL, a incorporação de 3H-timidina diminui na mesma concentração de antibiótico, e o DNA total diminui para concentrações ≥700 µg / mL [62, 63]. Um estudo sobre o efeito da tobramicina (concentrações entre 0 e 10.000 µg / mL) em osteoblastos mostrou que os níveis locais & lt200 µg / mL não tem efeito na replicação dessas células, enquanto que em concentrações & gt400 µreplicação g / mL diminui, e com 10.000 µocorre morte celular em g / mL. Além disso, os efeitos da vancomicina sobre os osteoblastos foram estudados para concentrações variando entre 0 e 10.000 µg / mL: níveis de vancomicina & lt1.000 µg / mL teve pouco ou nenhum efeito na replicação, mas concentrações de 10.000 µg / mL causou a morte dos osteoblastos [64]. A vancomicina parece ser menos tóxica do que os aminoglicosídeos em altas concentrações e a gentamicina tem concentrações críticas mais baixas do que as da tobramicina, apesar de ambos serem aminoglicosídeos.

12. Conclusões

A maioria dos estudos demonstrou uma eficácia antibacteriana de cimentos carregados com antibióticos no tratamento de infecções profundas após artroplastia de quadril e joelho (um estágio e dois estágios).

O principal problema dessas análises é o tempo mínimo de tratamento que permite os efeitos do antibiótico sem desenvolver resistência bacteriana. Estudos recentes em vitro mostraram que a maior concentração de antibiótico liberado é encontrada nos primeiros dois dias em contraste, estudos na Vivo não alcançou evidências estatisticamente significativas.

A literatura demonstrou que os melhores resultados são obtidos com a associação de cimento com antibiótico e a administração sistêmica de antibiótico, se possível com testes direcionados.

Finalmente, uma diferença significativa entre a administração intravenosa de antibióticos e o uso de antibióticos no cimento para uso profilático em pacientes com risco padrão não foi encontrada, portanto, não é aconselhável o uso de cimento carregado com antibiótico de rotina como profilaxia.

Em conclusão, recomenda-se não confiar excessivamente no papel do cimento ósseo carregado de antibióticos e não dar a ele propriedades terapêuticas que não possui. É claro como ALBCs são mais eficazes do que cimentos simples, mas, sem dúvida, a “janela de eficácia” não pode ser atribuída apenas aos antibióticos. Outras propriedades relacionadas ao cimento em si, como rugosidade, porosidade, técnica de preparo e muitas características relacionadas ao paciente, devem ser lembradas.

No entanto, é preciso sublinhar que o ALBC, principalmente se direcionado por um antibiograma específico ou integrado a uma associação de mais de uma molécula, é um importante auxílio na prevenção e no tratamento das infecções protéticas.

Política de divulgação e conflito de interesses

Os autores não têm conflitos de interesse neste manuscrito submetido e não receberam bolsa, fundos e suporte financeiro. Esta pesquisa não foi influenciada por um interesse secundário, como ganho financeiro. Todos os autores leram e concordaram com todos os termos de Copyright e Contrato de Licença da Hindawi.

Referências

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Direito autoral

Copyright & # xa9 2011 Alessandro Bistolfi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob a Licença de Atribuição Creative Commons, que permite o uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o trabalho original seja devidamente citado.


Introdução

As bactérias desenvolveram resistência à maioria dos antibióticos usados ​​atualmente [1], tornando as infecções bacterianas uma das principais causas de mortalidade no sistema de saúde [2]. Há evidências que sugerem que as infecções bacterianas estão se tornando difíceis de tratar porque os patógenos são capazes de desenvolver biofilme que auxilia no estabelecimento do hospedeiro, na expansão da população e na proliferação da doença [3]. Mais de 60% de todas as infecções bacterianas humanas foram atribuídas à persistência da formação de biofilme pelas respectivas bactérias [4]. Quando as bactérias formam biofilmes, a estrutura do biofilme facilita a sobrevivência de patógenos causadores de doenças, mesmo em condições ambientais hostis. Foi demonstrado que a natureza da estrutura do biofilme e os atributos fisiológicos dos organismos formadores de biofilme conferem uma resistência inerente a condições hostis, incluindo agentes antimicrobianos, como antibióticos [5]. Portanto, há necessidade de desenvolver novos agentes antibacterianos que possam inibir a formação ou destruir os biofilmes maduros e, assim, aumentar a suscetibilidade dos micróbios aos antibióticos.

Há um interesse crescente no uso de compostos derivados de plantas medicinais como agentes antibacterianos alternativos [6]. As plantas formaram a base dos sistemas medicinais tradicionais que já existem há milhares de anos e continuam a fornecer novos remédios à humanidade [7]. Alguns dos medicamentos amplamente utilizados na prática clínica foram obtidos de plantas [8]. Vernonia adoensis é uma planta comumente usada na etnomedicina africana [9]. É uma planta herbácea da Vernonia gênero pertencente à família Asteraceae que é o maior gênero com cerca de 1000 espécies [10]. Na África Oriental, a decocção das raízes é misturada com outras árvores para o tratamento de problemas cardíacos e renais [11]. No vale do Rift e na parte ocidental do Quênia, V. adoensis é usado tradicionalmente para tratar sintomas de doenças sexualmente transmissíveis, como gonorreia [11]. As folhas da planta também são utilizadas no tratamento dos sintomas da malária [12]. Na Tanzânia, esta planta tem sido tradicionalmente usada na etnomedicina africana para o tratamento de febre e infecções do trato respiratório superior [9]. V. adoensis é nativo e comumente distribuído por todo o Zimbábue, onde é conhecido em língua vernácula Shona linguagem como Musikavakadzi [13].

Vários estudos têm sido realizados para avaliar o potencial antimicrobiano de V. adoensis com o objetivo final de justificar o uso tradicional das espécies vegetais ou descobrir drogas [14, 15]. Os extratos vegetais têm mostrado atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus e Bacillus subtilis in-vitro [16]. Foi relatado que as folhas da planta têm uma atividade anti-plasmódio muito alta contra Plasmodium falciparum [17]. Chimponda e Mukanganyama [18], relataram que as folhas de V. adoensis teve atividade inibitória contra Mycobacterium aurum e Corynebacterium glutamicum. Existem estudos que foram feitos para isolar fitoquímicos de alguns Vernonia espécies e os compostos isolados mostraram ter atividades biológicas [19,20,21]. V. adoensis demonstrou possuir alguns fitoquímicos farmacológicos importantes [21], mas há informações limitadas sobre a atividade biológica dos compostos específicos isolados da planta. A maioria dos testes de atividade biológica dos vários estudos foi realizada com extratos brutos obtidos de diferentes partes da planta.. Portanto, a necessidade de isolar fitoquímicos de V. adoensis pois podem produzir compostos de chumbo com potencial antimicrobiano significativo contra cepas selecionadas de bactérias. Estudos têm mostrado que bactérias como P. aeruginosa, S. aureus e K. pneumoniae estão entre as principais causas de infecções nosocomiais que produziram um mau prognóstico no hospital [22]. Desde o advento da aplicação de antimicrobianos no tratamento de doenças bacterianas, as bactérias patogênicas responderam desenvolvendo formas variadas de resistência [23]. Klebsiella pneumoniae tornou-se resistente aos antibióticos carbapenêmicos, que frequentemente são a última linha de defesa contra infecções Gram-negativas [24]. Staphylococcus aureus cepas agora são resistentes à penicilina [25]. Na maioria dos países asiáticos, 70–80% da mesma cepa se tornaram resistentes à meticilina [25]. Pseudomonas aeruginosa as infecções são agora responsáveis ​​pela maioria das infecções nosocomiais em hospitais e centros de saúde porque não existem agentes antimicrobianos eficazes contra elas [26]. Também infecção por P. aeruginosa através do biofilme em pulmões de pacientes com fibrose cística (FC) está causando alta morbidade e falência funcional deste órgão [27].

Há necessidade de novos agentes antibacterianos, pois as bactérias desenvolveram resistência à maioria dos antibióticos usados ​​atualmente [1]. Além disso, os antibióticos atuais têm limitações consideráveis ​​em termos de espectro antimicrobiano e efeitos colaterais [28]. O uso indiscriminado e incorreto de antibióticos tem levado ao aumento da resistência clínica de microrganismos anteriormente sensíveis e à ocorrência de infecções incomuns. Produtos naturais à base de plantas são considerados uma fonte rica de agentes antimicrobianos [29]. As plantas medicinais tradicionais têm recebido atenção significativa como fonte de novas entidades químicas porque seus fitoquímicos podem levar a novas pistas na descoberta de medicamentos [30]. O objetivo deste estudo foi isolar os fitoquímicos encontrados em V. adoensis e avaliar sua atividade antimicrobiana, uma vez que anteriormente os extratos brutos mostraram ter alta atividade antibacteriana [31].


Endofítico Penicillium espécies e suas aplicações agrícolas, biotecnológicas e farmacêuticas

Penicillium gênero constituído por mais de 200 espécies é um dos maiores e fascinantes grupos de fungos, particularmente bem estabelecido como fonte de antibióticos. Endofítico Penicillium foi relatado que coloniza seus nichos ecológicos e protege sua planta hospedeira contra múltiplos estresses, exibindo diversas funções biológicas que podem ser exploradas para inúmeras aplicações, incluindo agrícolas, biotecnológicas e farmacêuticas. Nas últimas 2 décadas, endofítico Penicillium espécies foram investigadas além de seu potencial antibiótico e inúmeras aplicações foram relatadas. Resumimos de forma abrangente os dados disponíveis nesta revisão (2000-2019) sobre compostos bioativos isolados de endofíticos Penicillium espécies bem como a aplicação destes fungos em múltiplos processos agrícolas e biotecnológicos. Esta revisão mostrou que um grande número (131) de endófitos deste gênero foram investigados até agora e mais de 280 compostos exibindo antimicrobianos, anticâncer, antivirais, antioxidantes, antiinflamatórios, antiparasitários, imunossupressores, antidiabéticos, anti-obesidade, efeitos antifibróticos, neuroprotetores e atividades inseticidas e de biocontrole foram relatados. Além disso, vários endofíticos Penicillium spp. têm sido caracterizados como biocatalisadores, promotores de crescimento de plantas, fitorremediadores e produtores de enzimas. Esperamos que esta revisão resuma o status da pesquisa sobre este gênero e estimule novas investigações.

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Triagem de Compostos

Procedimento experimental e triagem de inibidores potenciais

Todos os ensaios inibitórios da atividade de fosforilação de Yes foram realizados de acordo com o Manual Técnico Promega para o Ensaio de Quinase ADP-Glo ​​™ (Fitchburg, WI, EUA. Número de catálogo: V9102). O recombinante humano Sim [a.a. 2–543 (fim)] foi adquirido da BPS Bioscience (número de catálogo: 40488). Os detalhes do protocolo do ensaio e as informações do reagente são fornecidos em outra parte 10. Aqui, descrevemos resumidamente a triagem dos compostos com base na atividade de inibição e resultados.

A triagem foi realizada em três etapas consistindo da primeira triagem, a segunda triagem e o IC50 determinação, como pode ser ilustrado na Fig. 1b. Primeiro, determinamos as taxas de inibição dos 1.991 compostos. Cada composto foi colocado em 4 poços de uma placa de 384 poços. No total, 80 compostos foram ensaiados em uma placa e os outros poços foram usados ​​para controles positivos e negativos. Os compostos foram colocados aleatoriamente em placas de modo que os compostos propostos por um grupo não fossem colocados juntos em uma placa. Uma média de quatro taxas de inibição para cada composto foi comparada com os critérios para a primeira triagem. Esses critérios incluíram que a taxa de inibição era maior do que 25% e a taxa de inibição era maior do que a média mais três vezes o desvio padrão da placa na qual o composto foi testado, onde as taxas de inibição observadas de controles positivos e negativos não foram levado em consideração. Como resultado, 68 compostos passaram na triagem. As informações sobre os compostos eliminados são fornecidas na Tabela S3 das Informações de Apoio. Em segundo lugar, as taxas de inibição dos compostos selecionados foram determinadas em uma placa usando o mesmo procedimento do primeiro rastreio, onde os compostos foram dissolvidos a partir de pó fresco. Como resultado, 16 compostos mostraram taxas de inibição maiores do que o limite da segunda triagem (isto é, aproximadamente 50%). As informações para compostos selecionados e descartados são fornecidas na Tabela S4 das Informações de Apoio. Os compostos selecionados foram então avaliados quanto ao seu IC50 valores. A estrutura química e os resultados do ensaio desses compostos são apresentados na Tabela 2.

Entre os 16 compostos, 10 compostos apresentaram um IC50 menos do que nosso critério de acerto, que era um IC50 menos de 10 μmol L −1, conforme mostrado na Tabela 2. Esses compostos mostraram uma relação clara de dose-resposta (DRR), como pode ser visto na Figura S1 das Informações de Apoio. Já para Z1252403274 e Z275023406, que mostraram uma boa DRR, eles não foram definidos como compostos de sucesso devido à potência insuficiente. Os outros quatro compostos, Z50080378, Z57745307, Z50080181 e Z1283491630, não revelaram uma DRR, tendo "atividade de inibição" em torno de 50% em toda a faixa de concentrações, o que pode ser devido às suas interações não específicas com o alvo (promíscuo ligação de proteínas, agregação de proteínas) ou questões relacionadas à solubilidade. Por essas razões, esses compostos foram excluídos da consideração. Observe que confirmamos que o limite usado para a segunda triagem era razoável, como pode ser visto na Figura S2 das Informações de Apoio.

Os 10 compostos de sucesso foram comparados aos filtros de compostos de interferência de ensaio pan (PAINS), filtros A, B e C descritos na literatura 35, o que sugere grupos funcionais potenciais de hitters frequentes extraídos de ensaios de HTS. Descobrimos que os 10 compostos não têm esses grupos funcionais potenciais. Isso significa que todos os compostos de sucesso são promissores para uma investigação mais aprofundada. Deve-se notar que alguns compostos de sucesso têm quimiotipos "questionáveis" do ponto de vista da química medicinal, ou seja, hidrazonas (Z49895016, Z57745314, Z57745304, Z295464022) e um potencial aceptor de Michael (Z449737600), que pode apresentar um risco de reatividade / toxicidade . No presente estudo, não os excluímos porque apenas os ensaios bioquímicos, não baseados em células, foram usados ​​para a triagem neste estudo. Isso diminui fortemente a chance de obter falsos positivos com esses compostos durante a triagem primária. A ênfase também foi colocada em evitar a perda potencial de qualquer andaime ativo identificado pelos grupos computacionais concorrentes, ao invés da eliminação precoce de séries químicas menos desejáveis. Substituir hidrazonas por suas isósteras não reativas durante a otimização hit-to-lead é um esforço de química medicinal viável, conforme ilustrado por algumas publicações de pesquisa 36,37,38. Discutiremos esses compostos contendo hidrazona em mais detalhes na seção seguinte. O aceitador de Michael pode ser substituído por um grupo amida entre um ácido e uma amina secundária cíclica, para reter a rigidez molecular.


4 Análise Computacional das Propriedades Físico-Químicas e Estruturais de Produtos Naturais

A quiminformática tem desempenhado um papel fundamental na caracterização de NPs por suas propriedades físico-químicas e estruturais, e na comparação de NPs com drogas de moléculas pequenas, compostos semelhantes a drogas e outros tipos de moléculas (orgânicas). NPs cobrem um espaço químico muito mais amplo do que os compostos sintéticos e também povoam áreas no espaço químico que geralmente não são (ou têm grandes dificuldades) sinteticamente acessíveis. 6, 8, 19, 57, 58 A singularidade estrutural (e complexidade) de alguns NPs poderia permitir que eles alvejassem macromoléculas que, de outra forma, não seriam passíveis de remédio. 16

NPs são em média mais pesados ​​e mais hidrofóbicos do que drogas sintéticas e compostos sintéticos semelhantes a drogas. 59 Sua complexidade estrutural também é frequentemente maior, em particular no que diz respeito à estereoquímica (comumente quantificada pelo número de centros quirais, 57, 59-66 o número da fração de átomos Csp 3, 6, 8 e / ou o número de átomos da cabeça de ponte em sistemas de anel 67) e forma molecular 3D. 8, 68

NPs mostram uma enorme diversidade de sistemas de anéis, em particular de sistemas alifáticos. 6, 8, 57, 63, 65 Um estudo mostrou que 83% dos andaimes de anel central de NPs estão ausentes em bancos de dados de triagem disponíveis comercialmente. 69 Com relação à composição do átomo, duas das características mais discriminativas dos NPs em relação aos compostos sintéticos são o (em média) baixo número de átomos de nitrogênio e alto número de átomos de oxigênio. 57, 59, 62-64 No entanto, uma clara maioria dos NPs conhecidos, e ainda mais em bibliotecas físicas de NP, são semelhantes a drogas. 6

NPs de diferentes reinos têm propriedades físico-químicas e estruturais distintas. 66, 70-76 Por exemplo, NPs com macrociclos ou cadeias alifáticas longas são mais comumente para espécies marinhas do que espécies terrestres. 74 Também as bactérias produzem muitos NPs macrocíclicos. 75 Seus NPs são caracterizados por uma alta proporção de heteroátomos e, em relação a isso, uma grande diversidade de grupos funcionais. 76


Reconhecimentos

Agradecemos a Per Anders Enquist (Consórcio de Biologia Química da Suécia Umeå), Christa Testerink e Iko Koevoets (Universidade de Wageningen) pelos conselhos. Agradecemos a assistência técnica a Kamaleddin Hajmohammadebrahimtehrani, Colin Snoeker, Jan Orsel e Lennert Zorn (Universidade de Utrecht). Este trabalho foi apoiado pela Graduateschool Uitgangsmaterialen grant NWO # 831.13.002 para LvdW e MvZ pela Organização Holandesa de Pesquisa Científica (NWO), um acesso de facilidade e concessão de apoio para projetos de genômica química para LvdW e MvZ dos Laboratórios de Biologia Química (Química Biology Consortium Sweden Umeå), Umeå, Suécia, uma bolsa Erasmus Placement para LvdW, uma bolsa inicial do European Research Council (ERC) No. 258413 para MK, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) bolsa INST 20876 / 127-1 FUGG para MK e consolidador ERC concessão 616449 e BBSRC concessões BB / R017913 / 1 e BB / S003193 / 1 para RH. KL agradece o apoio da Fundação Sueca para Pesquisa Estratégica (VINNOVA), do Conselho de Pesquisa Sueco (VR), do Centro de Metabolômica Sueco para o Uso de Instrumentação e da Fundação Knut e Alice Wallenberg (KAW). ON foi apoiado financeiramente pelo Ministério da Educação, Juventude e Esportes da República Tcheca por meio do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional-Projeto ‘Plantas como uma ferramenta para o desenvolvimento global sustentável’ (CZ.02.1.01 / 0.0 / 0.0 / 16_019 / 0000827).


Discussão

O controle bem-sucedido e as estratégias de tratamento da malária atualmente dependem da disponibilidade de medicamentos antimaláricos eficazes. O surgimento de resistência à família de medicamentos da artemisinina, de importância crítica [7–9], destaca a necessidade de novos medicamentos em parceria e substituir as terapias atuais, e novas estratégias de desenvolvimento de medicamentos. Drogas que visam a invasão de merozoítos foram propostas como uma nova estratégia para o desenvolvimento de antimaláricos [11-14]. Aplicamos métodos robustos para a purificação de P. falciparum merozoítos e ensaios de invasão [13, 18] para a triagem de inibidores da invasão de merozoítos. O antibiótico azitromicina e compostos relacionados foram identificados como inibidores rápidos de P. falciparum invasão de merozoíta em eritrócitos. Esta é a primeira vez que um antimalárico em uso clínico é associado à inibição da invasão de merozoíta em vitro, e a primeira identificação clara de compostos antimaláricos com duplo mecanismo de ação contra a invasão de merozoítos e o desenvolvimento de parasitas intra-eritrocíticos. A microscopia de vídeo ao vivo revelou que a azitromicina atua na prevenção da etapa essencial da formação de junções herméticas durante a invasão. Além disso, a atividade inibitória da azitromicina foi amplamente eliminada pela remoção seletiva de grupos de glicano, e identificamos macrolídeos modificados com potência aumentada contra a invasão de merozoítos.

A azitromicina é um antibiótico macrolídeo com um anel de macrolactona de 15 membros que é bem tolerado e seguro para uso clínico por crianças e mulheres grávidas [28]. A azitromicina e os macrolídeos relacionados são conhecidos por inibir a síntese de proteínas ribossômicas no apicoplasto do parasita em estágio assexuado pela ligação à subunidade 50S do complexo ribossômico do apicoplasto (70S) [49, 50]. Normalmente, as concentrações clínicas de azitromicina com base nos regimes de dosagem atuais resultam em "morte retardada" do parasita em em vitro ensaios. A progênie de parasitas tratados com azitromicina não consegue formar apicoplastos funcionais nos merozoítos filhos, causando a morte da segunda geração de parasitas após o tratamento [31, 32]. A azitromicina foi considerada uma candidata para inclusão em terapias combinadas com artemisinina (ACT) e para a prevenção da malária na gravidez [51] devido à sua segurança e sua meia-vida longa (mais de 50 horas) [25, 27, 29].

Além de seu efeito de "morte retardada" no crescimento do parasita, foi relatado que a azitromicina mata os parasitas no primeiro ciclo de em vitro o crescimento do parasita em uma concentração de droga logo acima das concentrações plasmáticas máximas relatadas [29, 32]. Especula-se que a inibição do crescimento do parasita durante o primeiro ciclo de tratamento é o resultado da azitromicina ter um alvo secundário além do ribossomo do apicoplasto [32, 41]. Dada a inibição do crescimento por meio de "morte retardada" direcionada ao apicoplasto, é aproximadamente 150 vezes mais potente do que aquela alcançada para a inibição do crescimento de 1 ciclo em vitro, acredita-se que a azitromicina atue predominantemente por meio do direcionamento do apicoplasto quando usada clinicamente. Por causa do perfil de segurança da azitromicina, vários estudos investigaram modificações no medicamento com o objetivo de reduzir o IC50 de tratamento de curto prazo (1 ciclo de crescimento) para a faixa nanomolar baixa [42-44]. No entanto, apesar desse interesse na azitromicina, o alvo da inibição da droga durante o primeiro ciclo de crescimento é desconhecido, e o potencial desse novo mecanismo de ação como tratamento clínico permanece obscuro.

Várias linhas de evidência indicam que a azitromicina tem um mecanismo secundário e alvo (s) de ação para inibir a invasão, além de se ligar à subunidade ribossômica do apicoplasto 50S, conforme descrito para o fenótipo de "morte retardada" [31, 32]. A clindamicina, um antibiótico menor e estruturalmente não relacionado que tem locais de ligação sobrepostos à azitromicina no ribossomo do apicoplasto [39], bem como um modo de ação idêntico, teve muito pouca atividade inibidora de invasão. A seleção de uma linha D10 para resistência (sensibilidade reduzida em 57 vezes) à azitromicina nos ensaios de 'morte retardada' de 2 ciclos não resultou em um aumento semelhante na resistência aos ensaios de inibição de invasão da azitromicina quando comparado a um D10 parental ('morte retardada' sensível) linha. A comparação da azitromicina e seus análogos modificados (1j, 12e) mostrou que as modificações que aumentam a potência desses análogos sobre a azitromicina na inibição da invasão, em ensaios de ciclo (40 horas) e 1 ciclo (90 horas) não aumentaram significativamente a potência dos compostos em ensaios de 'morte retardada' em 2 ciclos, sugerindo que o mecanismo de atividade inibitória aumentada era independente da atividade anti-ribossomal.

A inibição quase instantânea da invasão de merozoítos causada pela azitromicina também sugere que essa droga pode matar parasitas rapidamente por meio de um mecanismo de ação secundário. A inibição típica de "morte retardada" por antibióticos macrolídeos resulta na perda da funcionalidade do apicoplasto [31, 32], com isso levando à perda da biossíntese do precursor isoprenóide, a única função essencial do apicoplasto durante o desenvolvimento do estágio sanguíneo [33]. Os longos períodos de tempo necessários para a inibição da tradução do apicoplasto e a resultante "morte retardada" causada por antibióticos macrolídeos contrastam com a inibição muito rápida da invasão de merozoítos em concentrações de drogas mais altas. Além disso, a remoção do apicoplasto nos experimentos de Yeh et al. [33] não foi relatado para resultar em um defeito de invasão.Combinados, a evidência disponível sugere que é muito improvável que o apicoplasto desempenhe algum papel ainda indefinido na invasão de merozoítos e implique um mecanismo de ação secundário da azitromicina contra merozoítos invasores. Se o mecanismo de inibição da invasão e inibição do crescimento do parasita em estágio assexuado intracelular (dentro de 1 ciclo na ausência de inibição da invasão) é o mesmo, resta ser elucidado. No entanto, o IC semelhante50 valores observados para ambos os fenótipos inibitórios aumentam a possibilidade intrigante de que este mecanismo de ação secundário possa ser direcionado ao longo da doença, causando o estágio sanguíneo de P. falciparum malária.

A capacidade da azitromicina de inibir rapidamente a invasão de merozoítos, além do mecanismo de ação de "morte retardada" direcionada ao apicoplasto, é uma perspectiva empolgante para o desenvolvimento de drogas à base de macrolídeos em terapias combinadas. Esta modalidade dupla poderia ver a azitromicina auxiliar na eliminação rápida de parasitas, bem como oferecer tratamento de longo prazo para o sangue de baixo nível remanescente e parasitas em estágio de fígado por meio de sua atividade contra o apicoplasto. Essa estratégia de tratamento medicamentoso tem o potencial de aumentar a eficácia do medicamento, ao mesmo tempo que reduz as chances de desenvolvimento de resistência.

Apesar de em vitro A atividade inibitória da invasão de merozoíta da azitromicina exigiu concentrações de drogas na extremidade superior do que é alcançado clinicamente [29, 32], demonstramos que a modificação dos macrolídeos pode levar a uma melhora substancial na atividade inibitória da invasão, o que sugere que macrolídeos inibidores da invasão podem ser desenvolvidos como terapêutica. A adição de um açúcar L-megosamina à eritromicina A por meio de um na Vivo processo de fermentação [41] produziu um composto com atividade inibitória de invasão 32 vezes maior do que eritromicina A. Além disso, uma seleção de análogos de azitromicina [42-44] reduziu o IC inibidor de invasão50 em até 5 vezes. Os derivados de azitromicina foram testados apenas quando solubilizados em DMSO devido a limitações na quantidade de material disponível. É importante ressaltar que o uso de DMSO como veículo para solubilização reduziu a potência do composto parental azitromicina 4 vezes em relação ao etanol como veículo. Se esta observação fosse verdadeira para os derivados, o IC inibidor de invasão50 do composto 1j (5) [44] estaria no intervalo de 1–2 μM.

O IC inibidor de invasão50 de azitromicina (10 μM) e análogos (1j, 7 μM 12e, 15 μM) é comparável ao alcançado para inibidores que visam especificamente a função de proteínas essenciais de merozoíta. Dois estudos recentes de prova de conceito identificaram compostos inibidores da invasão de moléculas pequenas que almejam interações entre ligantes de invasão essenciais RON4-AMA1 (intervalo inibitório 30-6 μM) e MSP1-19 (inibição da replicação 21,7 μM) [12, 14], e invasão relatada IC inibitória50 valores em uma faixa muito semelhante à da azitromicina e análogos. Outro inibidor de invasão altamente seletivo, o inibidor de peptídeo específico de 3D7-AMA1 R1 [52], tem um IC inibidor de invasão50 de 2,5 μM em ensaios usando merozoítos purificados [18]. A azitromicina, com modificação mínima, pode inibir rapidamente a invasão de merozoítos em concentrações comparáveis ​​a alguns dos melhores e mais seletivos inibidores de invasão disponíveis para o desenvolvimento e pesquisa de medicamentos. As melhorias encorajadoras evidentes na atividade inibidora de invasão da azitromicina de apenas um pequeno painel de derivados, combinadas com a segurança e eficácia comprovadas dos macrolídeos, apóiam o potencial para o desenvolvimento de tais compostos como terapêuticos.

A remoção dos grupos de glicano da azitromicina forneceu uma visão sobre os requisitos estruturais para a atividade inibidora de invasão. A remoção do açúcar cladinosil resultou em uma redução de 5 vezes na atividade inibidora da invasão. Surpreendentemente, a remoção de ambos os açúcares resultou na perda completa da atividade inibidora da invasão, sugerindo fortemente que o açúcar desosamina, ao invés do cladinosil, é crítico para a atividade inibidora da invasão. Curiosamente, o açúcar desosamina também é considerado o grupo glicosilado crítico na ligação dos macrolídeos aos ribossomos microbianos [39], com antibióticos macrolídeos usados ​​clinicamente, como a telitromicina, tendo dispensado o grupo cladinosila por completo. A triagem de um número maior de macrolídeos e análogos modificados ajudará a identificar outros com maior potência e permitirá a avaliação de quais modificações e grupos são mais importantes para a atividade.

O fato de que a azitromicina inibe a invasão do hospedeiro por Plasmodium merozoítos (de malária humana e de roedores) e T. gondii Parasitas taquizoítas sugerem que o alvo da inibição é compartilhado entre alguns estágios invasivos de apicomplexos. O fato de que a potência da azitromicina contra P. falciparum (humano) e P. berghei A malária (roedor) era muito semelhante levanta a possibilidade de que direcionar esta via pode ser uma estratégia eficaz para tratar outras espécies de malária. Os resultados do T. gondii os ensaios de invasão sugerem que a invasão da célula hospedeira deste parasita apicomplexano relacionado de forma mais distante também pode ser direcionada pela azitromicina, embora em concentrações mais altas. É importante ressaltar que o análogo 12e tinha potência inibitória de invasão igual ou melhor do que a azitromicina (em etanol ou DMSO, respectivamente) quando testado em uma concentração 6 vezes menor. Isso sugere fortemente que análogos da azitromicina podem ser desenvolvidos com atividade inibitória superior contra invasão de taquizoíta e confirma que a atividade inibidora de invasão da azitromicina e análogos é compartilhada entre parasitas apicomplexanos distantemente relacionados.

Os antibióticos macrolídeos têm sido associados a mecanismos de ação diferentes da ligação aos ribossomos microbianos, incluindo interferência com mecanismos de sinalização intracelular, como Ca 2+ e MAPK, por meio de um mecanismo ainda indefinido (revisado em [53]). Acredita-se que a sinalização intracelular de Ca 2+ desempenhe um papel importante na invasão (revisado em [54]), portanto, a interferência com esse mecanismo por antibióticos macrolídeos pode contribuir para a inibição da invasão. Também foi demonstrado que os antibióticos macrolídeos se ligam a bicamadas fosfolipídicas carregadas negativamente e interferem com a função normal da membrana [55, 56]. Curiosamente, a atividade relativa dos macrolídeos parecia estar em parte relacionada ao número de grupos catiônicos presentes no macrolídeo.


Fundo

O milho, uma das três principais culturas alimentares do mundo, é amplamente consumido. No entanto, a área útil para o cultivo do milho diminui gradualmente a cada ano. Diante do conflito, a principal solução é melhorar o rendimento por unidade de área, o que pode ser obtido cultivando novas variedades, aumentando a densidade de plantio e melhorando as condições de cultivo. Dentre essas abordagens, a maneira mais fácil é aumentar a densidade de plantio, mas traz o problema do alojamento. A redução moderada da altura da planta é uma estratégia eficaz para melhorar a resistência ao acamamento em milho cultivado em alta densidade. Enquanto isso, a chuva forte e os ventos fortes, levam diretamente às plantas de milho que ficam inundadas ou alojadas. O alojamento leva a vários impactos adversos, incluindo a redução do rendimento em 15-18%, maturação posterior, redução da qualidade, dificuldade de colheita, agravamento de doenças, pragas e ratos [66, 106].

A altura da planta é geralmente correlacionada positivamente com a taxa de acamamento. O estudo do mecanismo de crescimento e da regulação da altura da planta do milho tem grande significado para melhorar a tolerância ao acamamento [107]. A altura da planta do milho é determinada principalmente pelo número e comprimento dos entrenós, particularmente do 7º ao 9º internódios, que são a ocorrência usual de acamamento do colmo para o milho [68]. O entrenó pode ser dividido em três partes durante o estágio de alongamento, incluindo região meristema, região de alongamento e região fixa [120].

A extremidade inferior do internodo alongado é o meristema, a região com divisão celular ativa. A região de alongamento está localizada acima do meristema, onde a expansão celular e as paredes celulares primárias se formaram [51, 95]. A região fixa, também conhecida como região de maturação, está localizada na extremidade superior do internodo, na qual o crescimento prolongado das células é interrompido e a deposição da parede secundária é o processo principal [51]. A atividade do gene está intimamente associada a processos biológicos específicos nessas três regiões de tipo. Foi demonstrado que os genes relacionados à giberelina (GA) e auxina, expressam-se principalmente na região de alongamento de entrenós, como anão1, anão 3 e braquítico 2 [12, 54, 102]. E NACs e cafajeste os genes que envolvem a regulação da síntese da parede celular secundária são expressos principalmente em regiões fixas [15, 39]. No entanto, as informações sobre as diferenças transcricionais entre meristema, alongamento e regiões fixas estão longe de ser claras.

Os genes relacionados a vários hormônios têm se mostrado envolvidos na altura da planta, como os genes que participam da biossíntese, transporte e vias de sinalização do GA e do ácido jasmônico (JA) [16, 55, 97]. Alguns genes afetam a altura da planta regulando a síntese e transdução de GA, como anão1, anão 3, GA20oxs, GA3oxs, CPS, planta anã 8 e planta anã 9 [7, 73, 81, 83, 101, 102, 108]. O JA afeta a altura da planta principalmente por meio de um complexo crosstalk de fitohormônio com GA e auxina. Estudos mostraram que JA pode afetar a formação e distribuição de auxina, induzindo o ASA1 expressão e regulação dos PINs e PLETHORA [98], afetando assim o alongamento celular. Além disso, DELLAs, fator de regulação reversa do sinal de GA, pode interagir com a via de JA para coordenar o crescimento normal e a defesa a estresses bióticos [110]. Portanto, os fitormônios são de grande importância para controlar o desenvolvimento dos entrenós. No entanto, o alto custo de produção e a instabilidade da estrutura molecular no ambiente vitro tornam a aplicação direta de fitohormônios muito difícil no rendimento. Reguladores de crescimento de plantas, que são compostos com efeitos semelhantes aos fitormônios, superam essas dificuldades [105, 112]. Atualmente, o principal componente dos reguladores de crescimento de plantas usados ​​na agricultura é o cloreto de 1,1-dimetil-piperidínio (DPC) ou etefon [70, 121]. No entanto, o milho não é sensível ao DPC e o ethephon diminui o rendimento de grãos do milho [52, 71]. Com o aumento da densidade de plantio e do nível de mecanização, um novo regulador de crescimento de plantas mais eficiente e seguro é urgentemente necessário.

Coronatina (COR), secretada por Pseudomonas syingae pathovars, é uma fitotoxina [46, 50, 76], com função semelhante a JA [36, 115]. Foi demonstrado que o COR é um análogo do JA [100], e é 1000 vezes mais ativo do que o JAs [93]. O COR pode levar a efeitos adversos para as plantas, como clorose foliar e sintomas de doenças [94]. No entanto, COR de baixas concentrações pode aumentar a resistência ao estresse abiótico [40, 104, 124]. Atualmente, o COR pode ser produzido por fermentação microbiana e tem as vantagens de reduzir a poluição ambiental e os resíduos químicos. Portanto, como um novo regulador de crescimento de plantas que não agride o meio ambiente, espera-se que o COR seja amplamente utilizado na agricultura. Pesquisas anteriores mostraram que o COR pode inibir o alongamento da raiz de milho, hipocótilo e mesocótilo [62]. Nossos estudos anteriores mostraram que o COR teve certo efeito na redução da altura da planta [85, 99], enquanto o mecanismo molecular do COR na redução da altura da planta do milho não é bem conhecido.

Em nosso estudo, a altura da planta de ZD958 e XY335, dois híbridos de milho cultivados de forma selvagem, pode ser significativamente diminuída sob o tratamento COR através da redução do comprimento do entrenó e, assim, melhorar a resistência ao acamamento. Para pesquisar a expressão diferente do gene subjacente que conduz as respostas do internodo ao COR, o transcriptoma espaço-temporal do internodo endogâmico B73 foi produzido sob controle e tratamento COR, contendo as regiões de maturação, meristema e alongamento do internodo. As diferenças nos níveis de transcrição das três regiões em condição normal foram exibidas e, em seguida, foram comparadas com aquelas no tratamento COR. No total, 8.605 genes responsivos a COR (COR-RGs) foram relatados, e genes específicos de entrenós representaram 9,3% (802 genes). Para estes COR-RGs, 614, 870, 2123 dos quais mostraram alterações de expressão apenas na região fixa, meristema e de alongamento, respectivamente. A análise de enriquecimento de ontologia genética indicou que genes diferentes nas três regiões controlam seu crescimento. Além disso, descobrimos que 84% dos genes relacionados com GA e 80% dos genes relacionados com JA foram significativamente afetados sob o tratamento COR. Em resumo, o mapa de expressão diferencial da resposta de expressão gênica no internodo ao COR fornece um suporte teórico para estudos futuros do mecanismo molecular da altura da planta diminuída pelo COR.


Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer aos nossos muitos colegas e colaboradores que trabalharam conosco em inibidores de PI3K. Agradecemos à Dra. Swen Hoelder por sugerir a analogia do cubo de Rubik e ao Professor Keith Jones pela ajuda com as Figuras 1 e 2. Agradecemos a Val Cornwell pela ajuda na preparação do manuscrito e a Ann Ford pelo apoio administrativo. Pedimos desculpas aos autores de muitos relatórios excelentes que não puderam ser citados devido a restrições de espaço.

Apoio financeiro: O programa Cancer Research UK concede o número C309 / A8274 e o financiamento do National Health Service para o National Institute for Health Biomedical Research Center. Paul Workman é Cancer Research UK Life Fellow.


Assista o vídeo: FEIRA DO GADO 26 09 2021 (Janeiro 2022).