Em formação

O que controla a regulação da frutose nas plantas?


Os açúcares são encontrados de forma onipresente nas plantas e são regulamentados.

Para a sacarose é bastante simples - é basicamente mantida em um nível baixo e armazenada ou em outros compostos intermediários. Estes atuam para inibir ou promover outras partes do ciclo da calvina de produção de açúcar (frutose 2,6 bifosfato, especialmente iirc).

A frutose é um pouco mais obscura. Quais são os loops de feedback regulatório envolvidos?


Preâmbulo

Em suma, frutose quinases (como Fru6P, 2-quinase) e frutose fosfotases (como Fru2,6bisP) regulam e, por sua vez, são regulados pela frutose (especificamente Fru6P) níveis nas plantas. Existem também vários metabólitos que regulam a taxa em que essas enzimas de frutose funcionam, criando uma rede reguladora de frutose bastante complexa. Esta fosforilação pode tornar a frutose indisponível ou disponível para proteínas, bem como fornecer energia no processo (e aparentemente a taxa disso pode ser controlada de forma eficaz na Vivo (Stitt, 1990)).

Não encontrei nenhuma regulação de captação de células, mas lembre-se de que as plantas são fisiologicamente muito diferentes dos humanos e pode não haver um sistema de igual para igual neste caso. Embora eu suspeite que haverá, pois nas plantas a frutose pode estar concentrada nos corpos frutíferos. Talvez outra resposta, ou uma grande edição para esta resposta possa explicar isso.

A frutose é frequentemente referida como um metabólito regulador em plantas ou seja os níveis de frutose afetam outras vias devido ao seu estado fosforilado. No entanto, existem muitos sistemas reguladores de açúcar nas plantas. Embora este artigo se concentre mais na glicose e na galactose, ele enfatiza a ideia de uma rede regulatória em vez de um ciclo quando se trata de plantas e regulação do açúcar. Abaixo, os estudos são baseados em plantas como espinafre e outra vegetação folhosa, não em plantas frutíferas, infelizmente!

Controle de Quinase

3PGA, 2PGA, PEP, diidroxiacetona P e o glicolato-2-P intermediário de 2 carbonos são todos metabólitos que controlam a fosforilação que inibem a quinase, enquanto Pi ativa a quinase. Curiosamente, o PPi também inibe a quinase ao competir com o ATP. Como se pode imaginar, isso causa uma cinética de saturação sigmoidal de ATP e é claramente indicativo de regulação.

Fosforilação

Fru6P e Pi inibem a hidrólise de Fru2,6bisP por FRU2,6PASE.

Este artigo de 1996 tem uma figura que mostra como as vias do açúcar podem ser complexas. Para expandir sua pergunta, podemos ver como a fosforilação da frutose desempenha um papel na regulação da glicólise da sacarose e do amido (Plaxton, 1996).

Aviso: Eu não estudo isso desde o nível de graduação, então comentários construtivos são bem-vindos e eu encorajo as pessoas a editarem esta resposta para melhorá-la e ajudá-la a responder mais apropriadamente à pergunta!


Perguntas e respostas: como as redes reguladoras de genes controlam as respostas ambientais nas plantas?

Uma rede reguladora de genes (GRN) descreve a relação hierárquica entre fatores de transcrição, proteínas associadas e seus genes-alvo. O estudo de GRNs nos permite entender como o genótipo e o ambiente de uma planta são integrados para regular as respostas fisiológicas a jusante. Os esforços atuais em plantas têm se concentrado na definição dos GRNs que regulam funções como o desenvolvimento e a resposta ao estresse e têm sido realizados principalmente em espécies de plantas modelo geneticamente tratáveis, como Arabidopsis thaliana. Estudos futuros provavelmente se concentrarão em como os GRNs funcionam em plantas não-modelo e mudam ao longo do tempo evolutivo para permitir a adaptação a ambientes extremos. Esse entendimento mais amplo informará os esforços para projetar GRNs para criar características de cultura personalizadas.


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ANÁLISE DE CONTROLE METABÓLICO

A teoria da análise do controle metabólico foi desenvolvida no início dos anos 1970 (Kacser & Burns 1973 Heinrich & Rapoport 1974). A análise de controle metabólico quantifica a resposta das variáveis ​​do sistema (por exemplo, fluxos) a pequenas mudanças nos parâmetros do sistema (por exemplo, a quantidade ou atividade das enzimas individuais). A resposta do sistema é descrita por coeficientes de controle (C), enquanto os coeficientes de elasticidade (ɛ) são usados ​​para descrever propriedades locais que, em última análise, geram as propriedades do sistema. No estudo de caso apresentado aqui, vamos nos concentrar no coeficiente de controle de fluxo. O coeficiente de controle de fluxo (C) afirma que

onde dJ/J é a mudança fracionária de um fluxo de caminho que resulta da mudança fracionária dEeu/Ei da quantidade de enzima em questão. Se uma única enzima controla o fluxo através de uma via, há uma relação linear direta entre a quantidade de enzima e o fluxo da via (C = 1), e a inclinação de um gráfico normalizado de J contra Eeu será igual a unidade. Se a enzima não exercer controle, uma mudança na quantidade da enzima não terá efeito no fluxo da via (C = 0) e a inclinação de um normalizado J contra E plot será zero. Entre esses dois extremos estão as enzimas que exibem controle parcial ou compartilhado. Eles terão gráficos de controle em que a inclinação exibe um valor que está em algum lugar entre 0 e 1. Em uma via linear simples, os coeficientes de controle das enzimas constituintes somam-se à unidade (a teoria da Soma, mas veja abaixo para uma discussão mais aprofundada).

Embora várias outras estruturas, incluindo a teoria dos sistemas bioquímicos (Savageau 1971), a teoria orientada ao fluxo (Crabtree & Newsholme 1987) e a análise do fluxo elementar (Schuster, Fell & Dandekar 2000) tenham sido subsequentemente desenvolvidos, a análise do controle metabólico é provavelmente ainda a mais amplamente ferramenta matemática usada para o estudo de controle em sistemas vegetais (ap Rees & Hill 1994). A base teórica foi apresentada em outro lugar (ver por exemplo Stitt 1990 ap Rees & Hill 1994 Stitt & Sonnewald 1995 Poolman, Fell & Thomas 2000). As contribuições relativas das enzimas para o controle do fluxo em uma via podem ser avaliadas experimentalmente criando sistematicamente, para cada enzima na via, um conjunto de plantas com uma redução gradual na atividade da enzima. A mudança na expressão no nível de proteína / atividade e a mudança resultante no fluxo da via são então quantificados e representados um contra o outro para estimar o coeficiente de controle para essa enzima. Ao avaliar os resultados, é importante notar que quando a quantidade de uma enzima é marcadamente reduzida em relação a outras enzimas na via, seu coeficiente de controle tende a aumentar (Stitt 1994). Portanto, é importante incluir linhas com uma mudança relativamente pequena na atividade e estimar os coeficientes de controle a partir da inclinação do gráfico de quantidade de fluxo-enzima na vizinhança do valor de tipo selvagem. Também é importante verificar se o nível de outras enzimas na via não diminuiu significativamente (ap Rees & Hill 1994).


Discussão

Há muito tempo se pensa que o amadurecimento de frutos carnosos é controlado por um fator-chave ou sinal de que o amadurecimento de frutas climatéricas é considerado controlado por etileno, enquanto o amadurecimento de frutas não climatéricas é considerado controlado por ABA (Alexander & Grierson, 2002 Wheeler et al., Giribaldi 2009 et al., 2010 Koyama et al., 2010 Chai et al., 2011 Gagné et al., 2011 Jia et al., 2011). Como um hormônio vegetal, o envolvimento do ABA no desenvolvimento e amadurecimento dos frutos não é surpreendente. Em contraste com os fitormônios, o açúcar está geralmente presente em um alto teor e, portanto, tradicionalmente é considerado um fator importante na qualidade da fruta. Como tal, é difícil imaginar que o açúcar desempenhe um papel na regulação do amadurecimento dos frutos. Embora tenha sido cada vez mais sugerido que a sinalização do açúcar está envolvida em quase todos os processos de desenvolvimento das plantas, nenhuma evidência de um papel da sinalização do açúcar na regulação do desenvolvimento dos frutos foi relatada até agora. Este estudo demonstra, pela primeira vez, que um tipo de açúcar, a sacarose, desempenha um papel fundamental na regulação do desenvolvimento e amadurecimento dos frutos.

Para demonstrar o papel da sacarose na regulação do desenvolvimento e amadurecimento do morango, primeiro realizamos um experimento farmacológico. Conforme mostrado na Fig. 2 (a), o tratamento com sacarose promoveu dramaticamente o amadurecimento da fruta. Em comparação com a sacarose, a glicose teve um efeito menor, embora também tenha sido encontrado um papel óbvio na regulação do desenvolvimento e amadurecimento dos frutos. Se os sinais de açúcar funcionam apenas dentro das células, é possível que os diferentes efeitos dos açúcares testados possam ser o resultado das diferentes eficiências de transporte da fonte de carregamento para as células. Neste estudo, a diferença de potencial entre os açúcares em sua eficiência de transporte de longa distância não foi relevante, uma vez que todos os açúcares foram introduzidos simultaneamente na fruta por injeção. Se os açúcares injetados foram inicialmente infiltrados no espaço apoplástico das frutas, a única preocupação é uma possível diferença na taxa de carregamento dos açúcares do espaço apoplástico para as células. Para resolver esse problema, estudamos o processo cinético para o carregamento de sacarose e glicose em tecidos de frutas (Fig. S6). Conforme mostrado na Fig. S6 (a), o conteúdo de sacarose e glicose aumentou várias vezes imediatamente após a infiltração de vácuo, após o que a mudança no conteúdo de açúcar se conformava a um processo típico de cinética de saturação (Fig. S6b). Dado que o desenvolvimento e amadurecimento dos frutos de morango são processos relativamente longos (ou seja, várias semanas), o processo rápido de carregamento (apenas c. 3 h para saturação), bem como a pequena diferença na cinética de carregamento entre sacarose e glicose, sugere claramente que o efeito diferente observado para os açúcares testados não foi resultado de possíveis diferenças em sua eficiência de transporte. Deve-se notar que as evidências que sustentam o papel da sacarose como um sinal não vêm apenas da observação de que a sacarose exógena é capaz de promover o amadurecimento da fruta (Fig. 2), mas também da observação de que seu análogo estrutural não metabolizável, turanose, é também capaz de promover o amadurecimento dos frutos. Além disso, outros estudos demonstraram que a sacarose foi capaz de modular a expressão de uma série de genes relacionados ao amadurecimento (Fig. 4) e, da mesma forma, a turanose também foi capaz de modular a expressão dos genes responsivos à sacarose (Fig. S7) .

Embora o experimento farmacológico tenha demonstrado claramente que a sacarose exógena foi capaz de acelerar fortemente o desenvolvimento e amadurecimento da fruta (Fig. 2), para demonstrar conclusivamente o papel da sacarose, precisávamos modular as mudanças na sacarose endógena na fruta. Como a sacarose da fruta é conhecida por ser importada das folhas, identificamos e caracterizamos os transportadores de sacarose na fruta (Figs 6, S4, S5). Para manipular o gene que codifica o transportador de sacarose, adotamos a técnica de RNAi, que tem sido relatada como um bom método para a manipulação de genes em frutos de morango (Hoffmann et al., 2006). Como mostrado nas Figs 7 e 10, RNAi de FaSUT1 foi capaz de reduzir significativamente o nível de transcrição de FaSUT1 e o conteúdo de sacarose. Este resultado sugere que a sacarose endógena realmente desempenha um papel na regulação do desenvolvimento e amadurecimento do morango. A sinalização do açúcar tem sido cada vez mais sugerida como envolvida em uma ampla gama de processos no ciclo de vida da planta. No entanto, nos últimos anos, a maioria dos estudos sobre a sinalização do açúcar concentrou-se na sinalização da glicose. Há evidências de que a sacarose também pode funcionar como um sinal que desempenha um papel central em certos processos de biologia vegetal (Chiou & Bush, 1998 Vaughn et al., 2002 Yang et al., 2004 Teng et al., 2005 Martínez-Noël et al., 2009 Dalchau et al., 2011). Por exemplo, Chiou & Bush (1998) demonstraram que a sacarose pode atuar como um sinal na partição de assimilados e, além disso, foi relatado que a expressão de certos genes pode ser modulada especificamente pela sacarose (Vaughn et al., 2002 Teng et al., 2005). Consistente com esses relatórios, o presente estudo fornece fortes evidências de que a sacarose pode funcionar como um sinal na regulação do desenvolvimento e amadurecimento do morango.

Como foi sugerido que ABA desempenha um papel importante na regulação do amadurecimento dos frutos de morango (Chai et al., 2011 Jia et al., 2011), é de particular significado e importância determinar a relação entre ABA e a sinalização de sacarose. Conforme mostrado na Fig. 3, a sacarose foi capaz de regular a expressão de FaNCEDs que codificam uma enzima chave na via de biossíntese de ABA. É importante ressaltar que a expressão gênica regulada pela sacarose se mostrou um processo sensível e rápido, ou seja, a sacarose poderia promover significativamente a expressão de FaNCEDs em uma concentração tão baixa quanto 10 mM e 50 mM de sacarose podem promover significativamente a expressão de FaNCEDs dentro de 0,5 h após a aplicação. Mais importante, foi descoberto que a sacarose e a glicose podem desencadear respostas totalmente diferentes em termos de expressão gênica, por exemplo, embora a sacarose tenha promovido dramaticamente a expressão de FaNCED1, teve um efeito menor na expressão de FaBG1. Em contraste, embora a glicose tenha promovido dramaticamente a expressão de FaBG1, teve muito menos efeito na expressão de FaNCED1. Esses achados sugerem que a sacarose pode funcionar como um sinal direto e específico envolvido na regulação do amadurecimento do morango.

O açúcar é conhecido por ser um componente importante na fruta, o teor de açúcar solúvel no morango pode atingir até c. 500 mg g -1 DW (Kallio et al., 2000 Park et al., 2006). Em geral, o conteúdo de uma molécula biologicamente ativa, como um fitohormônio, é bastante baixo nas células ou nos tecidos. Não se sabe como a sacarose ou a glicose podem funcionar como um sinal com um teor tão alto. Uma possível explicação é que a molécula de sacarose ou glicose é compartimentada com seus sensores / receptores no tecido da fruta, células ou espaços subcelulares. Assim, se eles desempenham um papel regulador como um sinal depende de sua mudança no conteúdo em sites de ação (ou seja, em sites nos quais existem sensores / receptores), ao invés de seu conteúdo total em frutas inteiras. Um fenômeno semelhante foi bem estabelecido para a sinalização de fitohormônios. Por exemplo, em condições normais, as folhas das plantas são conhecidas por conterem altos níveis de ABA, no entanto, este ABA não é capaz de fazer estômatos fechados, pois é compartimentado em cloroplastos. Sob certas condições (por exemplo, durante estágios específicos de estresse hídrico), o ABA derivado da raiz pode ser capaz de regular o movimento estomático, embora a quantidade de ABA derivado da raiz seja muito menor do que o normalmente presente na folha (Hartung & Radin, 1989 Hartung et al., 2001 Jia & Davies, 2007). Tal como acontece com o transporte de longa distância de ABA, sacarose primária em frutas é conhecido por vir das folhas através do transporte de longa distância através do sistema vascular (Forney & Breen, 1986 Archbold, 1988 John & Yamaki, 1994), portanto, se a localização de os transportadores de sacarose estão relacionados com a compartimentação da sacarose e merece uma investigação mais aprofundada.

Foi relatado que a glicose pode regular a divisão celular, enquanto a sacarose regula a expansão celular e a deposição de reservas durante a embriogênese das leguminosas (Borisjuk et al., 2002, 2003). Além disso, o efeito do açúcar em muitos processos de desenvolvimento é dependente da concentração (Gibson, 2005). Por exemplo, verificou-se que baixas concentrações de sacarose (abaixo de 50 mM) podem estimular a formação de raízes adventícias nos hipocótilos de Arabidopsis, enquanto concentrações mais altas podem suprimir, em vez de estimular, a formação de raízes adventícias (Takahashi et al., 2003). Curiosamente, no presente estudo, descobrimos que as mudanças no teor de sacarose foram intimamente relacionadas com as transições de fase no processo de desenvolvimento, abrangendo o amadurecimento total dos frutos, ou seja, as concentrações de sacarose permaneceram baixas e relativamente estáveis ​​nos estágios iniciais da fase verde e aumentou acentuadamente quando os frutos começaram a entrar na fase branca (Fig. 1). Se supormos que a glicose e a sacarose têm os mesmos papéis reguladores no morango e na embriogênese das leguminosas, a estreita correlação entre a mudança no conteúdo de sacarose e a fase de transição do desenvolvimento do fruto também implica que pode ser a ação sinérgica da sacarose e da glicose que controla o desenvolvimento e o amadurecimento do morango.

Estudos têm sugerido que a glicose e ABA muitas vezes têm efeitos semelhantes ou antagônicos em diversos processos de desenvolvimento em plantas (preço et al., 2003 Dekkers et al., 2004). O isolamento de mutantes insensíveis ou hipersensíveis à glicose em Arabidopsis revelou que muitos dos mutantes de glicose são alélicos a Síntese ABA e Insensível a ABA mutantes. Esses estudos sugerem que a sinalização da glicose pode ser fortemente acoplada à sinalização ABA. Embora a estreita correlação entre a glicose e a sinalização ABA tenha sido estudada extensivamente, a maioria dos estudos enfocou os efeitos da glicose e ABA na germinação das sementes e no desenvolvimento inicial das plântulas. Curiosamente, no presente estudo, demonstramos que a sinalização da sacarose também está fortemente acoplada à sinalização ABA no desenvolvimento do morango: por exemplo, a sacarose exógena induziu dramaticamente a expressão de FaNCEDs, genes que codificam a enzima chave na via de biossíntese de ABA. Uma compreensão da associação entre a sacarose e a sinalização ABA aumentará muito nosso conhecimento dos mecanismos que governam o desenvolvimento e amadurecimento dos frutos. Para determinar se a sinalização da sacarose é dependente ou independente de ABA, examinamos a expressão dos genes responsivos à sacarose em associação com o bloqueio da biossíntese de ABA por NDGA. Conforme indicado na Fig. 4, o bloqueio da biossíntese de ABA com NDGA inibiu a expressão induzida por sacarose de alguns genes, tais como FaPG1, FaCHS e FaPAL, ao passo que teve pouco efeito sobre FaSPS e FaSS. Parece que a expressão da maioria dos genes que controlam diretamente eventos relacionados ao amadurecimento (ou seja, mudanças na textura, cor e sabor da fruta) é dependente de ABA e que a expressão de outros (como os genes associados ao metabolismo do açúcar) é independente de ABA. Essas observações indicam que o amadurecimento de frutas regulado pela sinalização de sacarose pode ocorrer por meio de vias ABA-dependentes e independentes de ABA, enquanto a via dependente de ABA parece desempenhar um papel importante na regulação do amadurecimento de frutas.

No presente estudo, demonstramos que, além do ABA, a sacarose pode funcionar como um sinal chave na regulação do amadurecimento do morango. Isso significa que a ação sinérgica de vários sinais, ao invés da atividade de um único sinal, é necessária para a regulação do desenvolvimento e amadurecimento dos frutos. A necessidade de múltiplos sinais sinérgicos está provavelmente correlacionada com a complexidade do mecanismo subjacente ao desenvolvimento e amadurecimento da fruta. O amadurecimento da fruta é o resultado de uma alteração ordenada de uma série de eventos fisiológicos e bioquímicos, como metabolismo de açúcar e ácido, metabolismo da parede celular e metabolismo de pigmento e sabor, e cada um desses sistemas ou processos metabólicos está envolvido na regulação de um número de genes. Não se sabe se cada sistema metabólico é regulado independentemente por uma via de sinalização única ou por uma rede de sinalização comum. É improvável que vários sistemas metabólicos em vários estágios de desenvolvimento sejam controlados por um único sinal. Assim, não é surpreendente que o desenvolvimento e o amadurecimento do morango possam ser controlados por múltiplos sinais. Outros sinais além de ABA e sacarose também podem estar envolvidos neste processo. Dado que alguns transportadores de sacarose desempenham um papel importante na acumulação de sacarose, é de particular interesse identificar os sinais a montante que controlam os transportadores de sacarose.

Em resumo (Fig. 12), este estudo demonstra que: (1) o teor de sacarose aumenta dramaticamente em um ponto chave no crescimento e desenvolvimento do morango (ou seja, na transição da fruta verde para a branca) (2) sacarose exógena, também como seu análogo estrutural não metabolizável, turanose (3-O-α- d-glucopiranosil-d-frutose), acelera muito o amadurecimento dos frutos, enquanto a glicose e a frutose têm um efeito muito menor ou negligente no amadurecimento dos frutos, sugerindo que o amadurecimento acelerado da sacarose não é resultado da manipulação do metabolismo da sacarose (3) da expressão de um transportador de sacarose altera o conteúdo endógeno de sacarose e o amadurecimento dos frutos, ou seja, a superexpressão de FaSUT1 leva a um aumento no conteúdo de sacarose e promove o amadurecimento da fruta, enquanto a inibição mediada por RNAi de FaSUT1 leva a uma diminuição no conteúdo de sacarose e atrasa o amadurecimento dos frutos, sugerindo que a sacarose endógena desempenha um papel central na regulação do amadurecimento dos frutos (4) a sacarose regula a expressão de uma série de genes relacionados ao amadurecimento, bem como de genes envolvidos na sacarose e metabolismo ABA, e o processo de expressão do gene regulado pela sacarose é sensível, específico e rápido, o que é consistente com um comportamento de sinalização e (5) a sacarose induz dramaticamente a expressão de FaNCEDs, genes que codificam enzimas-chave na via de biossíntese de ABA e, além disso, a manipulação do conteúdo de sacarose endógena altera o conteúdo de ABA endógeno. Além disso, a regulação positiva da maioria dos genes relacionados ao amadurecimento pela sacarose pode ser interrompida significativamente pelo bloqueio da biossíntese de ABA. Coletivamente, esses resultados sugerem fortemente que a sacarose funciona como um sinal que atua a montante da via de sinalização ABA e, portanto, desempenha um papel importante na regulação do amadurecimento do morango.

Os dados de sequência deste artigo podem ser encontrados nas bibliotecas de dados GenBank / EMBL sob os números de acesso: AB267869.1 (FaSPS), AB275666.1 (FaSS), AB275667.1 (FaAI), EF441273.1 (FaPT1), DQ458990.1 (FaPG1), AY048861.1 (FaGR), AF193789.1 (FaAT), AY997297.1 (FaCHS), AB360390.1 (FaPA), JX24461.1 (FaBG1) e AB116565.1 (FaACTIN).


Resultados

Sacarose exógena modula o amadurecimento do morango

Todo o processo de desenvolvimento do fruto do morango, abrangendo o fruto até o amadurecimento, pode ser dividido em três fases principais, ou seja, a fase do fruto verde, a fase da fruta branca e a fase da fruta vermelha (Fig. 1). Os estágios de frutas verdes e vermelhas podem ser divididos em vários subestágios, que carecem dos limites bem definidos dos estágios principais. Para descrever o desenvolvimento do fruto, dividimos o estágio verde em quatro subestágios (Fig. 1a, I-IV). No primeiro estágio ou no estágio inicial (estágio I), as sementes estão apenas totalmente formadas e o receptáculo ainda não é visível, como resultado da distribuição densa das sementes (ver canto inferior esquerdo da Fig. 1a). No estágio II, o receptáculo é apenas visível, mas a fruta ainda é bem pequena. No estágio III, o fruto começa a se expandir rapidamente e se torna muito maior (correspondendo a um fruto de tamanho médio). No estágio IV, o fruto começa a mudar de verde para branco. Além disso, dividimos o estágio vermelho em dois subestágios, ou seja, o estágio em que a fruta acaba de ficar vermelha e o estágio em que a fruta está totalmente vermelha. Denominamos esses estágios VI e VII, respectivamente. Assim, conforme mostrado na Fig. 1 (a), todo o processo de desenvolvimento do morango pode ser dividido em sete estágios. A Figura 1 (b) mostra as mudanças no conteúdo de açúcar durante o crescimento e desenvolvimento do fruto. O conteúdo dos três principais açúcares, ou seja, glicose, frutose e sacarose, aumentou significativamente durante o crescimento e o desenvolvimento. Notavelmente, nos estágios iniciais (ou seja, estágios I-III), o conteúdo de sacarose era muito menor do que o de glicose e frutose. Portanto, o aumento no conteúdo de sacarose é muito maior do que o da glicose e da frutose durante o crescimento e desenvolvimento dos frutos.

Para investigar se os açúcares regulam o amadurecimento do morango, um experimento farmacológico foi realizado no qual sacarose exógena, glicose e frutose foram introduzidas por injeção nos frutos no estágio verde-grande (correspondendo ao período tardio do estágio III). Conforme mostrado na Fig. 2 (a), as frutas começaram a ficar vermelhas apenas 4 dias após a suplementação de sacarose e, após 8 dias, quando as frutas fornecidas com manitol ainda estavam brancas, as frutas fornecidas com sacarose tornaram-se totalmente vermelhas. Curiosamente, um análogo não metabolizável da sacarose, turanose, teve um efeito semelhante à sacarose no amadurecimento dos frutos. Além disso, descobriu-se que a glicose também tinha um efeito óbvio no amadurecimento das frutas. Notavelmente, a frutose não teve nenhum efeito no amadurecimento da fruta. Para avaliar quantitativamente o efeito dos açúcares no amadurecimento dos frutos, examinamos o efeito da suplementação de açúcar no acúmulo de antocianina, o pigmento que torna os morangos vermelhos (Fig. 2b). Consistente com nossas observações do fenótipo da fruta durante a análise farmacológica, a suplementação de sacarose e seu análogo não metabolizável, turanose, acelerou muito o acúmulo de antocianina. Coletivamente, esses resultados sugerem fortemente que a sacarose desempenha um papel importante na regulação do amadurecimento do morango.

A associação entre o amadurecimento de frutas modulado por sacarose e a sinalização ABA

Como foi relatado que a sinalização ABA desempenha um papel importante no amadurecimento do morango, espera-se que a modulação do amadurecimento do morango pela sacarose esteja intimamente relacionada com a sinalização ABA. Durante a germinação das sementes de algumas plantas, foi proposto que a sinalização do açúcar pode regular a expressão dos genes envolvidos no metabolismo ABA. Assim, para explorar o mecanismo pelo qual a sacarose modula o amadurecimento dos frutos, investigamos o efeito da sacarose e da glicose na expressão dos genes que codificam as enzimas-chave no acúmulo de ABA, ou seja, 9-cis-epoxicarotenóide dioxigenase (NCED), que controla a biossíntese de ABA (Xiong & Zhu, 2003), e β-glucosidase (BG), que libera ABA de seu estado conjugado com glicose (Lee et al., 2006). Uma pesquisa no banco de dados do genoma de morango identificou três genes que codificam NCED e três que codificam BG, que foram designados como FaNCED1, FaNCED2 e FaNCED3, e FaBG1, FaBG2 e FaBG3, respectivamente. Uma árvore filogenética dos NCEDs de morango e outras plantas é mostrada na Fig. S1. Uma análise quantitativa preliminar de RT-PCR mostrou que a sacarose exógena e a glicose modulam a expressão de quase todos os genes envolvidos no acúmulo de ABA durante a fase de fruta verde, mas não afetam a expressão desses genes na fase de fruta vermelha (Fig. S2). Curiosamente, embora a sacarose tenha promovido dramaticamente a expressão de FaNCEDs, teve muito menos efeito na expressão de FaBGs. Em contraste, embora a glicose tenha promovido dramaticamente a expressão de FaBGs, teve muito menos efeito na expressão de FaNCEDs, sugerindo que a expressão gênica modulada por sacarose e glicose é mediada por duas vias de sinalização diferentes. Além disso, em comparação com outros membros da família FaNCED ou FaBG, o efeito da sacarose e da glicose na expressão de FaNCED1 e FaBG1, respectivamente, foi muito mais dramático. Como mostrado na Fig. 3 (a), a expressão modulada por sacarose de FaNCED1 é rápido, ou seja, o tratamento com sacarose induziu a expressão de FaNCED1 dentro de & lt 0,5 h, sugerindo que a expressão mediada por sacarose de FaNCED1 é provavelmente o resultado da sinalização direta da sacarose, em vez de um processo relacionado ao metabolismo da sacarose. A Figura 3 (b) mostra que a expressão de FaNCED1 é bastante sensível à concentração de sacarose, ou seja, a sacarose induziu significativamente a expressão de FaNCED1 a uma concentração de & lt 20 mM. Um exame adicional mostra que a sacarose é capaz de induzir o acúmulo de ABA (Fig. S3). Além disso, descobriu-se que a glicose era capaz de induzir o acúmulo de ABA, mas, em comparação com a sacarose, a concentração de glicose necessária para induzir o acúmulo de ABA era muito maior. Esses resultados sugerem que as concentrações fisiológicas de sacarose desempenham um papel importante na regulação do acúmulo de ABA durante o desenvolvimento e amadurecimento do morango.

Dado que a sacarose exógena demonstrou modular o acúmulo de ABA e o amadurecimento dos frutos, foi importante determinar se o amadurecimento dos frutos modulado pela sacarose é mediado por uma via dependente de ABA ou independente de ABA. Para resolver esta questão, examinamos o efeito de um inibidor da biossíntese de ABA, NDGA, na modulação da sacarose para alguns genes relacionados ao amadurecimento, como os genes que controlam a pigmentação (por exemplo, chalcona sintase, CHS fenilalanina amônia-liase, PAL), sabor formação (por exemplo, quinona oxidoredutase, QR) e a mudança na textura da fruta (por exemplo, poligalacturonase, PG pectato liase, PT) e metabolismo de açúcar (sacarose sintase, SS sacarose-fosfato sintase, SPS). Como mostrado na Fig. 4, o bloqueio da biossíntese de ABA inibiu significativamente a expressão modulada por sacarose de quase todos os genes relacionados ao amadurecimento selecionados, exceto para FaPT1 (um gene envolvido no metabolismo da pectina.) e FaNCED1 e FaNCED2 (dois genes envolvidos na biossíntese de ABA). Este resultado indica que o amadurecimento de frutos de morango modulado por sacarose pode ser mediado por uma via dependente de ABA e independente de ABA, mas que a via dependente de ABA provavelmente desempenha um papel importante no amadurecimento de frutas modulado por sacarose.

Identificação e caracterização de transportadores de sacarose em frutos de morango

Apesar da forte evidência de que a sacarose exógena modula o amadurecimento da fruta, o conteúdo de sacarose endógena deve ser manipulado diretamente para demonstrar conclusivamente que a sacarose é de fato um sinal na regulação do amadurecimento da fruta. Como a sacarose é conhecida por viajar das folhas para os frutos por meio de transporte de longa distância no sistema do floema, um transportador de sacarose provavelmente desempenha um papel fundamental na regulação do conteúdo de sacarose dos frutos. Pesquisamos o banco de dados do genoma do morango e identificamos sete homólogos do transportador de sacarose Arabidopsis AtSUT1 e designamos esses transportadores de sacarose putativos como FaSUT1–7. A árvore filogenética desses transportadores de sacarose e outros transportadores de sacarose selecionados de plantas é mostrada na Fig. S4. Outros experimentos mostraram que os transcritos de todos os sete transportadores de sacarose putativos foram expressos em diferentes estágios de desenvolvimento do fruto (Fig. 5a). Notavelmente, a expressão de FaSUT1 aumentou dramaticamente durante o crescimento e desenvolvimento do fruto (Fig. 5b). Para determinar se os transportadores de sacarose putativos de fato têm atividade de captação de sacarose, realizamos uma análise de atividade usando um sistema experimental de levedura e descobrimos que todos os sete membros têm atividade de captação de sacarose (Fig. S5). Como mostrado na Fig. 6, a atividade de absorção de sacarose variou muito entre os transportadores. Por exemplo, a atividade de absorção de sacarose de FaSUT1 foi aproximadamente cinco vezes maior do que a de FaSUT7. O aumento dramático em FaSUT1 a expressão durante o desenvolvimento do morango e sua atividade relativamente alta sugerem que esta proteína desempenha um papel importante no crescimento e desenvolvimento do fruto do morango.

Manipulação de FaSUT1 expressão altera o andamento do amadurecimento dos frutos

Para manipular o conteúdo de sacarose endógena, geramos um construto de RNAi em gancho contendo íntron que direcionou FaSUT1 usando um fragmento de 747 bp da parte 3 ′ do FaSUT1 região codificadora, e a colocou sob o controle do promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV). O RNAi transitório foi realizado pela injeção do FaSUT1 O RNAi se constrói na fruta no meio do estágio de fruta verde (correspondendo ao estágio III). O vetor pBI121 vazio foi injetado como um controle. Foram gerados dez transformantes RNAi independentes, juntamente com 10 controles independentes. A Figura 7 (a) apresenta um transformante representativo e seu controle, mostrando o efeito de FaSUT1 RNAi no fenótipo do fruto. Conforme mostrado nesta figura, FaSUT1 O RNAi levou a uma inibição significativa do amadurecimento da fruta, conforme refletido pela cor pálida da fruta. Embora todo o fruto do controle de vetor vazio tenha se tornado totalmente vermelho, o FaSUT1 Os frutos de RNAi não conseguiram ficar vermelhos na região em que o FaSUT1 A construção de RNAi foi introduzida. Para testar se a inibição da coloração da fruta está de fato correlacionada com a regulação negativa de FaSUT1 expressão, nós examinamos o FaSUT1 nível de transcrição no receptáculo não transformado (ou seja, a fruta com as sementes removidas). FaSUT1 RNAi levou a uma redução na FaSUT1 nível de mRNA por & gt 70% em relação ao controle de RNAi (Fig. 7b, c).

Para fornecer mais evidências da capacidade de FaSUT1 para regular o amadurecimento dos frutos, geramos um FaSUT1 construção de superexpressão por clonagem da região de codificação de FaSUT1 no site de restrição de Speeu e BstEII do vetor pCAMBIA1304, e colocou esta região sob o controle do promotor CaMV 35S. Nós expressamos transitoriamente FaSUT1 injetando o FaSUT1 construção de superexpressão em frutos no estágio final de fruta verde (correspondendo ao período final do estágio III ou no período inicial do estágio IV), usando o vetor pCAMBIA1304 vazio como controle. Conforme mostrado na Fig. 8 (a), a superexpressão de FaSUT1 acelerou significativamente o progresso do amadurecimento dos frutos. Apenas 3 d após a introdução do FaSUT1 construção de superexpressão nos frutos, eles começaram a ficar vermelhos e, em mais 5 d, eles estavam totalmente vermelhos, enquanto o fruto de controle estava apenas começando a ficar vermelho neste ponto. O RNA gel blot em combinação com a análise quantitativa mostrou que a superexpressão de FaSUT1 levou a um aumento significativo em FaSUT1 nível de transcrição (Fig. 8b, c).

Consistente com sua influência no fenótipo da fruta, a manipulação de FaSUT1 alterou fortemente a expressão de genes relacionados ao amadurecimento. Conforme mostrado na Fig. 9, FaSUT1 O RNAi suprimiu todos os genes selecionados envolvidos no amadurecimento da fruta, como FaCHS, FaBG1 e FaQR, ao passo que promoveu um pouco a expressão de FaSS. Notavelmente, FaSUT1 RNAi também suprimiu fortemente a expressão de FaNCED1, um gene que codifica a enzima chave na via de biossíntese de ABA. Por contraste, FaSUT1 a superexpressão promoveu significativamente a expressão de todos os genes selecionados envolvidos no amadurecimento dos frutos, e também de FaNCED1. Coletivamente, esses resultados demonstram que FaSUT1 desempenha um papel importante na regulação do desenvolvimento e amadurecimento do morango.

O efeito da manipulação de FaSUT1 expressão no conteúdo endógeno de sacarose e ABA

Este estudo tem como objetivo demonstrar o papel da sacarose na regulação do amadurecimento do morango. Para elucidar se FaSUT1- o amadurecimento modulado dos frutos está correlacionado com uma mudança na sacarose, analisamos o efeito da manipulação de FaSUT1 expressão no conteúdo endógeno de sacarose, bem como glicose e frutose. Conforme mostrado na Fig. 10 (a), FaSUT1 O RNAi levou a uma forte diminuição no conteúdo de sacarose em relação ao controle, mas não teve efeito significativo sobre o conteúdo de frutose e glicose. Por contraste, FaSUT1 a superexpressão levou a um aumento significativo no conteúdo de sacarose, mas teve pouco efeito no conteúdo de glicose e frutose (Fig. 10b). Esses resultados sugerem que FaSUT1o amadurecimento modulado dos frutos é o resultado de seu efeito sobre o teor de sacarose.

Modulação de FaSUT1 não apenas alterou o teor de sacarose, mas também afetou o teor de ABA. Conforme mostrado na Fig. 11, FaSUT1 RNAi causou uma diminuição significativa no conteúdo de ABA em relação ao controle de RNAi e, em contraste, FaSUT1 a superexpressão resultou em um aumento significativo no conteúdo de ABA em relação ao controle de superexpressão. Esses resultados são consistentes com os do experimento farmacológico descrito acima, ou seja, a sacarose foi capaz de modular dramaticamente a expressão de enzimas chave envolvidas no acúmulo de ABA (Fig. 3). Tomados em conjunto, esses resultados indicam fortemente que a sacarose pode funcionar como um sinal a montante da sinalização ABA e, portanto, pode desempenhar um papel central na regulação do amadurecimento do morango.


Em vitro estudos de mecanismos regulatórios

Mesmo quando uma enzima possui um grande coeficiente de controle, ela só poderá contribuir para a regulação se existirem mecanismos que alterem a quantidade ou atividade da enzima. A seção a seguir analisa nosso conhecimento sobre as propriedades regulatórias das enzimas envolvidas na conversão de sacarose em amido em tubérculos de batata. Propriedades regulatórias marcadas foram encontradas para a sacarose sintase e a frutocinase, que são as duas primeiras etapas na via de quebra da sacarose, e AGPase, que catalisa a primeira reação comprometida que leva ao amido. Todas essas enzimas estão sujeitas à regulação de vários níveis.

Regulação por produtos e efetores alostéricos

AGPase é um heterotetrâmero, consistindo em duas subunidades catalíticas (AGPB) e duas regulatórias (AGPS). É extremamente sensível à regulação alostérica em folhas e tubérculos de batata, sendo potentemente ativado por 3PGA e inibido por Peu (Sowokinos 1981 Sowokinos & Preiss 1982 Preiss 1988 ver Tabela 2). Mudanças de curto prazo no equilíbrio da síntese de sacarose e respiração (Geigenberger et al. 1997 Geigenberger, Geiger & Stitt 1998 Geigenberger et al. 2000) levam a mudanças recíprocas no nível de 3PGA e no nível de ADPGlc e na taxa de síntese de amido. Isso fornece evidências indiretas para o na Vivo importância das propriedades alostéricas de AGPase para a regulação da síntese de amido. A evidência genética foi fornecida por um estudo no qual a superexpressão heteróloga de uma forma modificada de E. coli AGPase sem propriedades alostéricas demonstrou ser uma estratégia mais eficaz para aumentar o amido do tubérculo do que a superexpressão da forma nativa (Stark et al. 1992 ).

Enzima Ativadores alostéricos Inibidores alostéricos Referências)
Sacarose sintase sacarose glicose, frutose Murata (1972) Schomburg, Chang & Shomburg 2002) Dancer, Hatzfeld & Stitt (1990))
UGPase WL. alto (não fisiológico) Sowokinos, Spycahalla & Desborough (1993)
concentrações de Pi, frutose 2,6-bifosfato, frutose 6-fosfato e 3PGA
Sintase de fosfato de sacarose glicose 6-fosfato Peu Murata (1972) Schomburg et al. (2002) Reimholz et al. (1994 )
Invertase palatinose WL Fernie, Roessner & Geigenberger (2001)
Hexokinase WL. ADP, glicose 6-fosfato Renz e Stitt (1993)
Frutocinase WL. ADP, frutose 6-fosfato Renz, Merlo & Stitt (1993)
Fosfoglucomutase citosólica WL. WL. Fernie et al. (2001 )
Fosfoglucose isomerase citosólica
Transportador de glicose-6-fosfato WL. 3PGA, PEP, acil-CoA Kammerer et al. (1998), Fox et al. (2001 )
Fosfoglucomutase plastidial WL. WL Fernie et al. (2001a) Fernie & Willmitzer (não publicado)
AGPase 3PGA Pi Sowokinos e Preiss (1982)
Sintase de amido Baba et al. (1990) Edwards et al. (1999 )
Enzima de ramificação de amido Blenow & Johansson (1991)
Translocador de adenilato Acil-CoA de cadeia longa Raposa et al. (2001 )
Transportador triose fosfato
  • As referências dadas em itálico indicam que a caracterização cinética é de uma enzima de um tecido de planta diferente do tubérculo da batata. WL. indicado não determinado, - indica enzimas para as quais não existem dados cinéticos na literatura.

As enzimas na via de degradação da sacarose no citosol também são reguladas alostericamente (Tabela 2). A sacarose sintase é inibida por seu produto frutose e pela glicose (Doehlert 1987 Dancer, Neuhaus & Stitt 1990). A frutocinase é inibida por seus produtos, ADP e frutose 6-fosfato (Renz & Stitt 1993). Essas propriedades permitiriam a inibição por feedback da fosforilação de hexose quando hexose-fosfatos ou ADP estão se acumulando. O aumento resultante nos níveis de glicose e frutose poderia então inibir a sintase da sacarose (ver acima) e diminuir a taxa de degradação da sacarose. Além disso, a sacarose fosfato sintase (SPS) é alostericamente ativada por Glc6P e inibida por Peu em folhas e tubérculos de batata (Doehlert & Huber 1983 Kalt-Torres, Kerr & Huber 1987 Reimholz, Geigenberger & Stitt 1994). Essas propriedades permitem que o SPS opere em um ciclo regulatório que modula a taxa líquida de decomposição da sacarose (Geigenberger & Stitt 1993). Em condições onde os níveis de Glc6P são altos e Peu baixo, a ressíntese de sacarose aumenta e a taxa líquida de degradação de sacarose é reduzida (Geigenberger et al. 1994, 1998, 2001 Geigenberger, Müller-Röber & Stitt 1999 Trethewey et al. 1999 ).

Menos se sabe sobre as propriedades regulatórias dos transportadores plastidiais (Tabela 2). Foi relatado que os translocadores Glc6P e ATP são inibidos por acil-CoA de cadeia longa nas raízes (Fox, Rawsthorne & Hills 2001), e foi proposto que isso fornece um mecanismo para coordenar o carbono plastidial e o suprimento de energia com o uso de ácidos graxos para síntese de lipídios. O transporte líquido também responderá às mudanças nos níveis dos substratos. Por exemplo, o AATPT catalisa uma troca de contador entre ATP e ADP. Os gradientes desses metabólitos entre o citosol e o amiloplasto são apenas ligeiramente removidos do equilíbrio (Tiessen et al. 2002). Além disso, o na Vivo concentrações de ATP e ADP (Tiessen et al. 2002) são semelhantes ao Km valores do AATPT (Tjaden et al. 1998). Segue-se que o ADP competirá com o ATP pela entrada no amiloplasto e que o ADP competirá com o ATP pela transferência do amiloplasto. Uma parte considerável da atividade do transportador será, portanto, ocupada em trocas homólogas (ATP para ATP ou ADP para ADP) ou reversas (importação de ADP e exportação de ATP), e essa proporção aumentará quando o ATP citosólico diminuir ou aumentar o ADP. Uma diminuição na razão ATP / ADP citosólica pode, portanto, levar a uma diminuição na taxa líquida de importação de ATP e exportação de ADP. Esta conclusão é reforçada pelo alto coeficiente de controle de fluxo observado do AATPT (pelo que isso implica, além disso, que a atividade AGPase deve reagir com sensibilidade a uma deficiência no fornecimento de ATP). A competição entre ATP e ADP para transporte via AATPT fornece um mecanismo simples para diminuir o consumo de ATP e carbono para processos de armazenamento no amiloplasto quando o ATP diminui, e para direcionar mais carbono para a respiração e uma proporção maior de ATP para processos de manutenção.

Regulação por modificação de proteína pós-tradução

Foi relatado que três enzimas envolvidas na conversão de sacarose em amido são reguladas por modificação de proteína pós-tradução: SuSy, SPS e AGPase.

A fosforilação reversível de SuSy em Ser-15 leva a pequenas mudanças nas propriedades alostéricas da enzima e regula a associação da proteína da enzima às membranas microssomais no milho (Huber et al. Inverno de 1995, Huber & Huber 1997). Foi sugerido que a associação de SuSy à sintase de celulose ligada à membrana leva ao aumento da partição de carbono na síntese da parede celular (ver Winter & Huber 2000 para revisão). SuSy também é fosforilado em Ser-170 (Hardin et al. 2003). Em folhas de milho, foi demonstrado que essa modificação está envolvida no controle do nível da proteína SuSy, pois ela tem como alvo a SuSy para a degradação mediada por proteassoma. Foi sugerido que uma proteína quinase dependente de cálcio pode fosforilar Ser-15 e Ser-170, enquanto as proteínas quinases relacionadas a SNF1 atuam mais especificamente em Ser-15 (Hardin et al. 2003). Mais estudos são necessários para esclarecer como a fosforilação dos dois locais é regulada e qual o impacto que ela tem na partição do carbono entre a síntese da parede celular, outros processos necessários para o crescimento e manutenção celular e a síntese de amido. Curiosamente, o baixo teor de oxigênio leva à inibição da síntese da parede celular (Geigenberger 2003b) e à dissociação da SuSy das membranas microssomais (Bologa et al. 2003 ).

A fosforilação reversível de SPS ocorre em vários resíduos de serina, dos quais três já são conhecidos por serem importantes para a regulação (Winter & Huber 2000). Em folhas de várias espécies de plantas, o SPS é ativado após a desfosforilação de Ser-158 durante as transições claro / escuro (Huber et al. Toroser 1995 et al. 1999), o SPS é ativado em resposta a déficits de água relativamente suaves (Quick et al. 1989) via fosforilação de Ser-424 (Toroser & Huber 1997), e a fosforilação de Ser-229 promove uma interação dependente de Mg 2+ com proteínas 14-3-3 (Toroser, Athwal & Huber 1998). O papel da associação 14-3-3 não é claro, mas pode estar especulativamente envolvido na regulação da atividade SPS ou na facilitação de interações entre SPS e outras proteínas, como SPPase ou UGPase (Winter & Huber 2000). Alternativamente, existem evidências que implicam mudanças na ligação de 14-3-3 na desestabilização de proteínas durante a fome de açúcar (Cotelle et al. 2000). PKIII (uma proteína quinase relacionada a SNF1) e PK4 estão implicados na fosforilação de Ser-158 e Ser-424, respectivamente (Winter & Huber 2000), e PP2A está envolvido na desfosforilação de Ser-158 (Siegl, MacKintosch & Stitt 1990 Reimholz et al. 1994 Geigenberger et al. 1997). Regulação de PK dependente de Glc6PIII (Weiner, McMichael & Huber 1992) pode explicar a forte correlação positiva observada entre o estado de ativação SPS e o na Vivo nível de Glc6P em tubérculos de batata (Geigenberger, Müller-Röber & Stitt 1999). Há evidências de que o SPS também é regulado pela fosforilação de proteínas em tubérculos de batata (Reimholz et al. 1994), e que isso desempenha um papel na estimulação da ressíntese de sacarose em resposta ao estresse hídrico (Geigenberger et al. 1997), e em resposta a um acúmulo de hexose-fosfatos quando, por exemplo, a síntese de amido é inibida (Geigenberger et al. 1994, 1998, 1999 Trethewey et al. 1999 ).

Um trabalho recente descobriu um novo mecanismo pós-tradução para a regulação do AGPase. Como já mencionado, a planta AGPase superior é um heterotetrâmero que consiste em duas subunidades ‘catalíticas’ (AGPB) e duas ligeiramente maiores ‘reguladoras’ (AGPS) (Okita et al. 1990). Quando o AGPB e o AGPS de batata são expressos de forma heteróloga em E. coli, uma ponte intermolecular é formada entre os resíduos Cys-82 das duas subunidades AGPB. Para obter a enzima ativa, é necessário incubar o complexo com ditiotreitol ou tioredoxina para quebrar esta ligação (Fu et al. Ballicora 1998 et al. 2000). Estudos recentes têm mostrado que um mecanismo análogo opera in planta em tubérculos de batata (Tiessen et al. 2002) e em folhas de várias espécies (Hendriks et al. 2003). Em tubérculos de batata, a redução da ponte intermolecular leva a um aumento dramático da atividade, devido a uma diminuição da KM(ATP) e aumento da suscetibilidade à ativação alostérica por 3PGA (Tiessen et al. 2002). Ativação redox pós-tradução de AGPase in planta correlacionado intimamente com o conteúdo de sacarose do tubérculo em uma ampla gama de manipulações fisiológicas e genéticas, indicando que este novo mecanismo é parte de um circuito regulatório que canaliza a entrada de sacarose para a síntese de amido (Tiessen et al. 2002). Crucialmente, ele permite que a taxa de síntese do amido seja modificada em resposta a insumos externos e independentemente de qualquer aumento nos metabólitos glicolíticos. Nas folhas, a AGPase é ativada pós-tradução pela luz, assim como pelos açúcares (Hendriks et al. 2003). A ativação redox dependente da luz da AGPase é provavelmente devido ao aumento da redução da tiorredoxina. O mecanismo pelo qual as mudanças nos níveis de açúcar no citosol influenciam esse processo é um problema intrigante. Estudos em tubérculos de batata indicam que pode haver duas vias de detecção de açúcar separadas, uma envolvida na detecção de sacarose e exigindo uma proteína quinase relacionada ao SNF, e uma que está envolvida na detecção de glicose e é independente da última proteína quinase, mas requer fosforilação de glicose por meio de uma hexoquinase endógena (Tiessen et al. 2003). No momento, não se sabe se a saída é um status redox aumentado no plastídio ou se os açúcares levam a alterações nos efetores de AGPase de baixo ou alto peso molecular que modulam e facilitam a redução da ponte de cisteína via tioredoxina. Também não se sabe quais isoformas de tioredoxina estão envolvidas.

Regulação por concentração de pool de nucleotídeos

Muitos cofatores representam o que a análise de controle denomina "porções fixas", que é um metabólito cuja concentração não pode ser alterada livremente, pelo menos a curto prazo. Por exemplo, o pool geral de nucleotídeos atua como uma restrição na quantidade total que pode estar presente como um nucleotídeo individual, porque um aumento em um membro (por exemplo, ATP) significa que os outros (ADP mais AMP) têm que diminuir. Para tais conjuntos de metabólitos, não apenas os níveis individuais e as proporções, mas também o conjunto total combinado podem influenciar o fluxo por meio de uma via. Estudos recentes mostraram que os pools gerais de cofatores de nucleotídeos de fato restringem os fluxos ao amido.

O ATP é necessário no citosol para a conversão de sacarose em amido via frutocinase, e também é importado para o plastídio via AATPT para uso na reação catalisada por AGPase (ver Fig. 1). Pequenas alterações na expressão do transportador levam a alterações correspondentes nos níveis de ADPGlc e na síntese de amido, indicando que AGPase é limitada por ATP na Vivo (Tjaden et al. 1998 Geigenberger et al. 2001). Esta conclusão é ainda reforçada pela análise subcelular da concentração plastidial de ATP, que se verificou estar na faixa do Km de tubérculo de batata AGPase para ATP (Farre et al. Tiessen 2001 et al. 2002). Recentemente, foi demonstrado que quando a adenina é fornecida aos discos de tubérculos de tipo selvagem, há um aumento do nível geral de ATP, e que isso é acompanhado por uma estimulação da síntese de amido (Loef, Stitt & Geigenberger 2001). Além disso, a inibição antisense da adenilato quinase plastidial foi acompanhada por níveis aumentados de ATP, o que é uma possível explicação para o aumento de ADPGlc e o maior conteúdo de amido no tubérculo (Regierer et al. 2002). Finalmente, a expressão heteróloga de apirase em tubérculos de batata para converter ATP em AMP dentro do plastídio levou a uma forte diminuição no conteúdo de amido de tubérculo (D. Riewe, P. Geigenberger, não publicado).

A degradação da sacarose por meio da reação reversível de SuSy requer nucleotídeos de uridina (Geigenberger & Stitt 1993, ver Fig. 1). o na Vivo concentração de UDP determinada no citosol de tubérculos de batata usando fracionamento não aquoso está bem abaixo do Km de tubérculo de batata SuSy para UDP (Farre et al. Tiessen 2001 et al. 2002), indicando que os níveis de UDP co-limitam a taxa de degradação da sacarose.De acordo, a degradação da sacarose foi estimulada quando o pool geral de nucleotídeos da uridina (e UDP) é aumentado em fatias de tubérculo de batata pela alimentação de orotato, um intermediário da de novo via de síntese de purinas (Loef, Stitt & Geigenberger 1999). Isso resultou em uma taxa mais alta de síntese de amido.

Regulação transcricional

As enzimas envolvidas na conversão de sacarose em amido também estão sujeitas à regulação da transcrição. A expressão de genes específicos SuSy é aumentada por sacarose, hipóxia e ferimentos (Salanobat & Belliard 1989 Zeng et al. Bolonha 1998 et al. 2003), enquanto os genes da invertase são reprimidos em condições de hipóxia (Zeng et al. Bolonha 1999 et al. 2003). A expressão de AGPase é aumentada por açúcares (Salanobat & Belliard 1989 Müller-Röber et al. 1990 Sokolov, Dejardin & Kleczkowski 1998 Tiessen et al. 2003) e diminuído por nitrato (Scheible et al. 1997) e fosfato (Nielsen et al. 1998). Isso pode permitir que o acúmulo de amido responda às mudanças no carbono e no estado nutricional e às restrições ambientais.

O mecanismo de detecção e sinalização que medeia esses processos é amplamente desconhecido. A descoberta de que a expressão de SuSy induzida por sacarose é atenuada em plantas de batata antisense SnRK1 indica que a proteína quinase do tipo SNF1 está envolvida (Purcell, Smith & Halford 1998). Há um paralelo interessante para o papel da proteína quinase SNF1-like na mediação do controle pós-tradução dependente de sacarose de AGPase (Tiessen et al. 2003 ).

Como já mencionado, para atingir um aumento substancial na taxa de síntese de amido não será suficiente aumentar a expressão de algumas enzimas selecionadas. Também será necessário aumentar a quantidade ou atividade de muitas outras enzimas e transportadores, que catalisam reações reversíveis e não possuem propriedades regulatórias alostéricas ou pós-tradução sofisticadas, mas têm coeficientes de controle significativos ou os desenvolvem quando sua atividade é alterada duas vezes em relação para o resto do caminho. Na verdade, a regulação da transcrição pode ser ainda mais importante para tais proteínas do que para enzimas "altamente reguladas", porque é mais difícil compensar um nível de expressão inadequado por ajustes pós-tradução (ver Haake et al. 1999 Stitt 1999). Será importante usar um perfil de expressão abrangente para analisar a regulação de toda a via da expressão de genes envolvidos nas interações sacarose-amido. Inspeção do genoma de Arabidopsis (Thimm et al. 2004) revela que muitas das enzimas e transportadores são provavelmente codificados por pequenas famílias de genes. O sequenciamento do genoma do tomate fornecerá um passo importante para auxiliar a identificação de todos os membros de tais famílias e uma análise sistemática de programas de expressão em todo o genoma nas Solanaceae.


Direções futuras

Os estudos resumidos nesta revisão estabelecem claramente que o relógio circadiano da planta está diretamente conectado com as modificações da cromatina. Apesar da riqueza de informações sobre a interação interativa entre os componentes da cromatina e os reguladores circadianos, ainda estamos longe de um entendimento completo da base molecular e celular subjacente a essa conexão. Muitas perguntas ainda precisam ser respondidas. Por exemplo, como as pistas ambientais acionam as interações relógio-cromatina, de forma espontânea ou sequencial? As flutuações diurnas na luz e na temperatura se correlacionam bem com os padrões oscilatórios das modificações das histonas nos locais do relógio. No entanto, não é totalmente conhecido se o relógio bloqueia assinaturas de cromatina específicas em resposta a tensões ambientais flutuantes. Da mesma forma, a ativação transcricional dependente do estresse ou a repressão dos genes do relógio dependem das mudanças na cromatina controlada? É possível que as assinaturas da cromatina bloqueada forneçam uma memória da atividade transcricional recente? Abordar essas questões é pertinente no contexto das mudanças climáticas e do aquecimento global, que representam uma ameaça real à produtividade agrícola. Com base no papel do relógio circadiano nas respostas das plantas aos estresses, uma compreensão completa dos fatores ambientais que coordenam a cromatina e as paisagens transcricionais seria fundamental para melhorar a aptidão e a produtividade da planta.

A intrincada conexão entre as oscilações circadianas e as modificações da cromatina também abre uma questão chave não resolvida sobre qual é a “causa” e qual é a “conseqüência”. Sabe-se que os componentes do relógio circadiano e os reguladores da cromatina formam complexos de proteínas funcionais que se correlacionam com mudanças na expressão do gene circadiano, metilação do DNA e modificações da cromatina. No entanto, permanece para ser definido se os componentes do relógio circadiano recrutam os fatores epigenéticos para alvos genômicos para saída circadiana ou as modificações epigenéticas facilitam o recrutamento do relógio e outros fatores para a regulação circadiana. Responder a esta pergunta não é trivial, mas fornecerá informações importantes sobre como as paisagens transcricionais epigenética e circadiana são coordenadas temporalmente. Além disso, a coordenação espacial da regulação circadiana e da cromatina é importante para o crescimento e desenvolvimento da planta. A pesquisa está avançando rápida e significativamente em nossa compreensão de como o relógio funciona em diferentes células e tecidos e em toda a planta. A especificidade de células e tecidos das paisagens transcricionais circadianas pode muito bem ser correlacionada com especificidades espaciais semelhantes de remodelação da cromatina. É possível que componentes específicos da cromatina e marcas conectadas com os loci do relógio funcionem apenas em células ou tecidos específicos, dependendo das especificidades das saídas do relógio nessas células e tecidos.

Outro aspecto interessante que ainda precisa ser totalmente explorado é a trajetória evolutiva da remodelação do relógio e da cromatina. Dos estudos iniciais no sistema modelo A. thaliana, a pesquisa está avançando cada vez mais nas análises da função do relógio e da cromatina em outras plantas não-modelo. O uso de abordagens multidisciplinares, incluindo cronobiologia, biologia da cromatina, modelagem matemática e evolução molecular, nos ajudará a definir as semelhanças e diferenças entre o reino vegetal e a evolução. Esses estudos também fornecerão informações sobre como a função do relógio circadiano é capaz de regular a diversidade fisiológica e de desenvolvimento de diferentes plantas, como monocotiledôneas e eudicotiledôneas. Por último, o desenvolvimento de novas ferramentas e métodos integrativos, incluindo, mas não se limitando a perfis de cromatina e transcriptômica no nível de uma única célula, irá revelar ainda mais a complexidade intrínseca da cromatina e das redes regulatórias circadianas em ambos os níveis celular e orgânico.


2. Transporte e metabolismo da frutose intestinal: implicações para a saúde e a doença

A homeostase da frutose em todo o corpo resulta de dois processos principais: Absorção e depuração intestinal, sendo esta última comumente considerada mediada principalmente pelo fígado (

55% & ndash71%) e, em menor grau, pelos rins (& lt20%) [16] A frutose dietética se move do lúmen intestinal para a circulação por meio de um transporte passivo facilitado [3] através das membranas de enterócitos por membros da família do transporte facilitador de glicose (GLUT Slc2a) [14] Após sua absorção intestinal, a frutose chega ao fígado através da veia porta hepática e sofre metabolização nos hepatócitos [16] O transporte e o metabolismo da frutose foram extensivamente revisados ​​(consulte as referências. [3,14,17]). A descrição exaustiva do metabolismo hepático da frutose está fora do escopo desta revisão. Aqui, descrevemos brevemente a regulação do transporte e dos transportadores intestinais de frutose e seu metabolismo intracelular. Nosso foco é revisitar o papel do fígado e do intestino delgado na depuração da frutose, a relevância da produção endógena de frutose em doenças humanas e os inibidores de extrato vegetal dos transportadores de frutose.

2.1. Transporte Intestinal de Frutose

A captação de frutose pelos enterócitos é um processo independente da insulina [18] Entre os membros da família GLUT capazes de transportar frutose (GLUT5, GLUT8 e GLUT11), GLUT5 (Slc2a5) é o principal responsável pela captação de frutose no enterócito no lado apical da membrana, enquanto o GLUT2 (Slc2a2) move a maior parte da frutose do citosol para os vasos sanguíneos no lado basolateral do enterócito [14,19,20,21] (figura 1) Embora o GLUT5 pertença à família do GLUT, ele transporta apenas frutose, sem a capacidade de transportar glicose ou galactose. Por outro lado, o GLUT2 pode transportar glicose e galactose, além de frutose, com uma afinidade (Km) para a frutose mais de cinco vezes maior do que a de GLUT5 [22,23].

Figura 1. Transporte de frutose no intestino delgado. Frutose (F) é transportado por GLUT5 através da membrana da borda em escova e entra no citosol dos enterócitos, onde é rapidamente fosforilado pela cetohexocinase (KHK), levando a uma rápida depleção dos níveis de ATP intracelular. Um pool de frutose fosforilada é parcial ou totalmente metabolizado produzindo metabólitos (M) que induzem Slc2a5 expressão genetica. A frutose restante é liberada através da membrana basolateral para a circulação portal descendo o gradiente de concentração pelo GLUT2. Nesse modelo conceitual, o intestino delgado transporta passivamente a frutose para a circulação portal e o fígado é o principal órgão para o metabolismo da frutose. Esta figura foi criada usando Servier Medical Art (disponível em https://smart.servier.com/).

O principal local de expressão do GLUT5 é a membrana apical das células epiteliais intestinais, embora em uma extensão muito menor também seja expressa nos rins, cérebro, gordura, testículos e músculos [24] No entanto, a relevância fisiológica da expressão de GLUT5 nesses tecidos humanos extra-intestinais é incerta. Por outro lado, o GLUT2, além das membranas basolaterais das células epiteliais intestinais, é altamente expresso nos hepatócitos, células pancreáticas e beta e nas membranas basolaterais das células epiteliais renais [22].

o Km de GLUT5 para frutose varia dependendo do modelo de estudo e das espécies utilizadas para sua avaliação. Assim, Burant et al. relatou um Km do

6 mM dentro Xenopus oócitos que expressam o GLUT5 de mamífero [19] Em contraste, Kane et al. relatou um Km de 11 & ndash15 mM usando o mesmo sistema de expressão para GLUT5 humano [25] Valores semelhantes (Km de 11 & ndash13 mM) foram encontrados para o transportador de GLUT5 de camundongo e coelho expresso em oócitos [26,27] Finalmente, Mate et al. relatou um Km do

8 & ndash11 mM em vesículas da membrana da borda em escova do íleo de ratos normotensos Wistar-Kyoto e seus ratos espontaneamente hipertensos [28] Assumindo um Km valor variando de 11 & ndash15 mM para GLUT5, este Km é semelhante ao relatado para as concentrações de frutose luminal intestinal (26 mM) em ratos alimentados com frutose dietética [29] Por outro lado, o Km de GLUT2 para frutose é

11 & ndash17 mM [22,23].

2.2. Metabolismo da frutose dietética

Altas concentrações de frutose na dieta em alimentos e bebidas levam a concentrações elevadas de frutose luminal intestinal, que são necessárias para conduzir o transporte facilitado de frutose através da membrana do enterócito e flutuar em torno do Km de GLUT5 para frutose [3] Ao contrário da alta concentração de frutose no intestino delgado luminal, as concentrações de frutose na circulação sistêmica são relativamente baixas como resultado da absorção intestinal e das taxas de depuração do fígado. Em humanos, as estimativas das concentrações de frutose no sangue sistêmico em jejum são baixas (& lt0,05 mM), mesmo em humanos saudáveis ​​que consomem dietas de alta frutose ou sacarose (

0,2 & ndash0,5 mM) [30,31,32,33], que ainda é muito baixo em comparação com os níveis de glicose no sangue em jejum (5,5 mM). Finalmente, os pacientes diabéticos tipo 1 e tipo 2 exibiram concentrações de frutose em jejum de 0,016 mM e 0,009 & ndash0,013 mM, respectivamente [34,35] As baixas concentrações de frutose no sangue periférico sustentam a noção de que o fígado e os rins são muito mais sensíveis a pequenas mudanças nos níveis circulantes de frutose do que o intestino delgado. No entanto, não está claro como os hepatócitos ou néfrons reabsorvem a frutose dos capilares sinusoidais ou filtrados glomerulares, respectivamente, contendo níveis muito baixos de frutose.

A metabolização da frutose alimentar no intestino delgado é um processo regulado em várias etapas. Na primeira etapa da via Hers clássica para o metabolismo da frutose, a frutose é mobilizada do lúmen intestinal para o citosol dos enterócitos por GLUT5, onde é rapidamente fosforilada pela cetohexocinase (KHK, Khk), também conhecido como frutocinase, para frutose-1-fosfato usando ATP como um doador de fosfato [36] o Khk gene codifica duas isoformas da enzima como resultado de splicing alternativo dos exons adjacentes 3A e 3C do gene levando às isoformas KHK-A e KHK-C, respectivamente [37,38] Estudos de análise de expressão em vários tecidos humanos e de rato indicaram que apenas uma variante de mRNA é expressa em cada tecido [38], mas o pâncreas é uma exceção a esse padrão porque, embora a expressão de KHK-C predomine, alguns KHK-A também são expressos. A variante do mRNA KHK-C é expressa em altos níveis no fígado, rins e duodeno, e é considerada mais fisiológica do que a variante KHK-A porque é Km para a frutose é & lt1 mM [39,40] Por outro lado, KHK-A é expresso em um nível baixo em uma ampla gama de tecidos, incluindo músculo esquelético e tecido adiposo [39,40] KHK-A Km para a frutose é de 8 mM, sugerindo que ela fosforila mal a frutose em concentrações fisiológicas e que pode ter um papel mais importante quando a ingestão de frutose é excessiva [41].

Na segunda etapa da via da frutose, a frutose-1-fosfato é dividida em gliceraldeído e fosfato de dihidroxiacetona pela aldolase B (ALDOB Aldob) [16] Na terceira e última etapa da via, a trioquinase (TKFC ATP: D-gliceraldeído 3-fosfotransferase) catalisa a fosforilação do gliceraldeído por ATP para formar gliceraldeído-3-fosfato [16,36] Ambos ALDOB e TKFC são altamente expressos no fígado, rins e intestino delgado, em relação a outros órgãos [42].

Ao contrário da glicólise, o catabolismo da frutose (frutólise) ignora as principais etapas regulatórias da glicólise e da gliconeogênese (ou seja, fosfofrutocinase e frutose-1,6-bisfosfatase) e não é regulado por inibição de feedback [16,43] Além disso, a frutólise ignora a produção de glicose-6-fosfato e frutose-6-fosfato da via da pentose fosfato para a síntese de novo de nucleotídeos e ácidos nucleicos [44] Assim, é plausível que em condições de consumo excessivo de frutose, a frutólise mediada por KHK leve ao aumento de gliceraldeído, dihidroxi-acetona-fosfato e produção de gliceraldeído-3-fosfato, que são a fonte de substratos gluconeogênicos e lipogênicos (por exemplo, piruvato, lactato, acetil-CoA e glicerol-3-fosfato), levando a taxas elevadas de gliconeogênese, glicogênese e / ou lipogênese. Outra consequência da frutólise é uma rápida depleção intracelular de ATP e Pi [45,46].

2.3. Regulamento de GLUT5

Além do catabolismo da frutose na dieta, o metabolismo da frutose compreende sua biossíntese da glicose através da via do poliol [16] Essa via de duas etapas torna-se ativa quando as concentrações de glicose intracelular são elevadas. Na primeira etapa, a glicose sofre redução por NADPH a sorbitol (poliol) pela enzima limitante da via, a aldose redutase (AR), seguida pela metabolização de sorbitol em frutose por sorbitol desidrogenase (SDH) na presença de NAD + como cofator [16].

O metabolismo intestinal da frutose não é importante apenas para o destino metabólico da frutose, mas também para a regulação positiva de GLUT5, KHK, ALDOB, TKFC, frutose-1,6-bisfosfatease e glicose-6-fosfato (figura 1) [47,48] Assim, foi amplamente demonstrado que a exposição crônica ou aguda à frutose aumenta os níveis e a atividade de GLUT5 em roedores e nas regiões do intestino proximal humano [3,17] A resposta do GLUT5 ao seu substrato requer metabolização parcial ou total da frutose porque o análogo da frutose não metabolizável 3-O-metilfrutose tem um efeito modesto na expressão de GLUT5 [49], e o bloqueio do metabolismo da frutose intracelular no modelo de camundongo HKH - / - evita a regulação positiva da frutose de GLUT5 [47] Além disso, esses efeitos da frutose na expressão de GLUT5 são muito específicos porque frutose, glicose e análogos de glicose não metabolizáveis ​​têm mudanças semelhantes na expressão de GLUT2 em células intestinais [49] Os mecanismos moleculares subjacentes à regulação mediada pela frutose de GLUT5 em enterócitos permanecem incompletamente compreendidos. Em ratos, o cAMP induzido por frutose estimula a captação de frutose sem afetar a regulação da transcrição de Slc2a5 [50], enquanto nas células Caco-2 humanas, a frutose aumenta Slc2a5 Estabilidade do mRNA mediada pela via do cAMP [51] Por outro lado, o uso de inibidores ou ativadores da fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) e / ou proteína quinase B (PKB) demonstrou que esta via de sinalização medeia o aumento induzido por frutose no transporte de frutose sem afetar a regulação transcricional de GLUT5 [52] Como a via de sinalização PI3K / AKT medeia os efeitos da frutose na regulação positiva de GLUT5? Sabe-se que as PI3Ks de Classe II controlam o tráfego endocítico de transportadores por meio da produção de fosfatidilinositol 3-fosfato (PtdIns3P) Este segundo mensageiro é necessário para a ativação do Rab11, uma pequena GTPase da família Rab que coordena a reciclagem do endossomo para a membrana plasmática [53] A ablação Rab11a & DeltaIEC específica de enterócitos (modelo de camundongo Rab11a-KO) diminuiu a regulação positiva induzida por frutose de GLUT5 no intestino delgado, provavelmente por prejudicar o tráfego endossomal do transportador de frutose em direção à membrana apical do enterócito [47].

A expressão de GLUT5 no intestino também pode ser regulada pela proteína de ligação ao elemento de resposta a carboidratos (ChREBP), um fator de transcrição de zíper de hélice-alça-hélice-leucina básico responsivo à glicose do fígado [54] A alimentação com dieta rica em frutose aumenta os níveis de proteína ChREBP intestinal, acompanhados por aumento do transporte de frutose (GLUT5), expressão do gene frutolítico (frutocinase, ALDOB, TKFC e lactato desidrogenase) e gluconeogênico (glicose-6-fosfata e frutose-1,6-bisfosfatase) Em ratos [55] Por outro lado, a ablação genética de ChREBP (camundongos ChREBP-KO) leva à intolerância à frutose devido à indução insuficiente desses genes envolvidos no transporte e metabolismo da frutose [55,56,57,58,59] O mecanismo molecular pelo qual a frutose medeia a indução de ChREBP de Slc2a5 a expressão do gene envolve a interação direta de ChREBP com o promotor de Slc2a5 [55] em camundongos, enquanto a co-expressão ectópica de ChREBP e seu parceiro heterodímero Max-like proteína X (MLX) se liga a elementos de resposta a carboidratos (ChoREs) e ativa Slc2a5 promotor em células humanas Caco-2BBE [55] Mais trabalhos são necessários para confirmar se, da mesma forma que a glicose, a frutose pode regular a atividade de ChREBP por modificações pós-tradução, como O-glicosilação, fosforilação e mudanças conformacionais nas células intestinais [57].

Outra proteína reguladora do transporte intestinal de frutose identificada é a proteína que interage com a tiorredoxina (TXNIP, Txnip), uma proteína semelhante à arrestina que pode se ligar à proteína tiorredoxina que regula o metabolismo celular e o estado redox [60,61] Em resposta à glicose, o complexo transcricional ChREBP / MLX e MondoA / MLX se liga ao ChoRE no Txnip promotor para induzir a expressão de mRNA [62,63] TXNIP induzido por glicose inibe o transporte de glicose por meio da interação com GLUT1 e induzindo sua internalização por meio de fossos revestidos de clatrina, além de reduzir a expressão de GLUT1, enquanto o estresse energético leva à degradação de TXNIP por fosforilação por proteína quinase dependente de AMP (AMPK), resultando no aumento da função GLUT1 e expressão de mRNA [61,64] Dotimas et al. demonstraram que TXNIP regula a absorção de frutose no intestino delgado [65] Embora os mecanismos precisos permaneçam elusivos, TXNIP é regulado positivamente em resposta ao consumo de frutose e co-imunoprecipita com GLUT2 e GLUT5. Pode ser possível que a ligação entre o transporte de frutose e TXNIP possa ser mediada pela fosforilação da proteína mediada por AMPK, semelhante ao que descrevemos acima para GLUT1 [65].

A expressão de GLUT5 e sua atividade também é regulada pelo desenvolvimento inicial no intestino de mamíferos (isto é, rato, coelho e humanos). Em ratos, em condições normais (amamentação e desmame), o transporte intestinal de frutose e os níveis de mRNA de GLUT5 são muito baixos devido ao fato de que o leite materno é livre de frutose, a menos que haja uma exposição precoce ao sinal de frutose do intestino luminal, que por sua vez estimula Expressão e atividade de GLUT5 [17] O mecanismo pelo qual a frutose aumenta a expressão e a atividade de GLUT5 durante o desmame é complexo e envolve níveis sistêmicos de glicocorticóides, mas não de tiroxina [17,66,67,68] Além disso, o ritmo diurno regula o mRNA de GLUT5 e a expressão de proteínas em ratos adultos, mas essa regulação não está presente em neonatos [69] Independentemente da captação de frutose, 3 & ndash4 h antes do início do pico de alimentação, os níveis de GLUT5 aumentam quatro vezes. Este ritmo diurno também é acompanhado por regulação positiva de GLUT2 [8].

2.4. Metabolismo da frutose em doenças humanas

As principais vias do metabolismo da frutose são a conversão em glicose e lipídios [16] Portanto, a ingestão excessiva de frutose resultaria no aumento das concentrações de frutose portal que estimula a produção de glicose endógena e a síntese de lipídios no fígado, que está associada à síndrome metabólica (SM) [70,71,72], doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD) [73,74,75,76,77,78,79,80,81], obesidade e diabetes mellitus tipo 2 (DM2) [9,10,11,82,83,84,85,86,87,88] Embora haja cada vez mais evidências epidemiológicas e experimentais ligando o consumo de frutose a doenças metabólicas, a contribuição relativa da frutose a essas doenças humanas permanece controversa [87,89,90,91].

2,5. Revisitando o papel do fígado e do intestino delgado na eliminação da frutose

Tradicionalmente, o fígado é considerado o principal órgão que metaboliza a frutose antes de entrar na circulação sistêmica [16] Esta suposição é baseada nas seguintes evidências: (1) A absorção intestinal de frutose é dirigida principalmente para o fígado através da circulação portal (2) os tecidos periféricos, como o músculo esquelético, têm baixa capacidade para o metabolismo da frutose e (3) a isoforma KHK da cetohexocinase -C é expresso no nível mais alto no fígado em relação aos tecidos extra-hepáticos, levando a uma alta capacidade de fosforilação da frutose e extração do sangue. Desta forma, o fígado evitaria que altas doses de frutose se espalhem pelos tecidos periféricos [16].

A noção atual de que o fígado é o principal local do metabolismo e depuração da frutose dietética foi recentemente contestada por Jang et al. [92] Eles usaram técnicas sofisticadas e elegantes de rastreamento isotópico e coleta de sangue arterio-venoso para demonstrar que a maior parte da frutose ingerida é metabolizada pelo intestino delgado em camundongos. Em baixas doses de frutose (& lt0,5 g kg e menos 1),

90% da fosforilação da frutose ocorre no jejuno, duodeno ou íleo. A maior parte dessa frutose é metabolizada no intestino delgado, aparecendo na circulação portal como glicose e lactato (

60%), e o restante como frutose (& lt20%). Em contraste, altas doses de frutose (& ge1 g kg & minus1) saturam a absorção e o catabolismo da frutose no intestino delgado, levando ao derramamento de frutose no fígado (& gt30%) e na microbiota colônica em camundongos [92] (Figura 2) Este trabalho desafia nosso conhecimento atual sobre o papel do intestino delgado no metabolismo da frutose dietética e estimula a noção de que o intestino delgado protege o fígado da exposição à frutose tóxica. No entanto, várias questões surgem a partir deste trabalho e ainda precisam ser totalmente respondidas: (1) Uma limitação do estudo diz respeito à dose-resposta à frutose, que pode variar entre camundongos e humanos. Os humanos podem saturar a capacidade do metabolismo da frutose no intestino delgado em doses relativamente mais baixas do que os ratos. É necessário compreender o padrão de dose-resposta associado em humanos. (2) O papel do intestino delgado no metabolismo da frutose em camundongos e humanos pode ter divergido ao longo da evolução. Na verdade, os humanos têm um intestino relativamente mais curto e uma área intestinal menor do que os roedores [93] (3) A visão de longa data é que o fígado e os rins são os únicos órgãos gliconeogênicos em humanos, mas não o intestino delgado, porque não expressa glicose-6-fosfatase (G-6-Pase) [16] Esta questão crítica é importante para traduzir evidências experimentais de ratos para humanos. Nessa linha, um estudo demonstrou a expressão de G-6-Pase no intestino delgado de humanos [94], e outro mostrou algumas evidências da existência de uma conversão de frutose em glicose no jejuno humano [95].

Figura 2. Visão atual do metabolismo intestinal da frutose em camundongos. Sob condições de frutose na dieta de baixa dosagem (F) consumo, a maior parte da frutose é metabolizada pela via Hers aparecendo na circulação portal principalmente como glicose (G), e o restante como frutose não metabolizada. Por outro lado, sob o consumo de frutose na dieta de altas doses, a capacidade intestinal é sobrecarregada, fazendo com que a maior parte da frutose se espalhe para o fígado. Mais trabalho é necessário para validar ou refutar este modelo em humanos. G-6-Pase glicose-6-fosfatase. Esta figura foi criada usando Servier Medical Art.

2.6. Relevância da produção de frutose endógena em doenças humanas

Além da frutose exógena, a frutose pode ser sintetizada a partir da glicose através da via do poliol [16,96], que chamou a atenção para o papel potencial da produção endógena de frutose nas doenças metabólicas.

A via biossintética da frutose é constituída por duas enzimas, a aldose redutase, que converte a glicose em sorbitol, e a sorbitol desidrogenase, que converte o sorbitol em frutose [16] Em condições fisiológicas, esta via é principalmente inativa na maioria dos tecidos e órgãos do corpo, o que tem sido associado a níveis mais baixos de frutose circulante em jejum e pós-prandial [97] No entanto, esta via pode ser ativada após a ingestão de uma bebida contendo glicose (

30 g) em indivíduos saudáveis. A análise de diluição do traçador estimou a produção de frutose endógena

55 canecas kg e menos1 e middotmin e menos1. Este trabalho evidenciou, pela primeira vez, a capacidade de produção endógena de frutose em humanos [97] Outras pesquisas demonstraram a presença de uma via de poliol ativa em tecidos diferentes daqueles envolvidos na metabolização da frutose dietética, como o cérebro humano [98,99,100] Numerosos estudos usando modelos animais ligaram a via do poliol a alterações metabólicas, como obesidade, resistência à insulina, diabetes, nefropatia diabética, doença renal crônica, lesão renal aguda, pressão arterial e SM [101,102,103,104] No entanto, embora a presença de uma via de poliol ativa tenha sido descrita em humanos e as evidências crescentes obtidas em modelos animais da importância dessa via nas doenças, seu significado nas doenças metabólicas humanas espera uma confirmação adicional.

2.7. Inibidores de extratos vegetais de transportadores de frutose

Conforme descrito acima, vários estudos em humanos e modelos animais relacionaram o consumo de frutose com doenças, o que estimulou a noção do uso potencial de inibidores de GLUT5 para prevenir doenças induzidas por frutose. Até agora, nenhum inibidor potente e específico de GLUT5 foi descoberto, embora a floretina e a citocalasina B sejam usadas para inibir o GLUT2 para avaliar o transporte de frutose in vitro, enquanto o GLUT5 é insensível a ambos os inibidores [22,25].

Na última década, extratos de plantas têm sido usados ​​para rastrear compostos com efeitos inibitórios nos transportadores intestinais de GLUT5. Assim, as catequinas do chá verde inibiram o transporte de D-frutose em Xenopus laevis oócitos que expressam o GLUT5 de mamífero. A inibição do transporte de D-frutose via GLUT5 foi mais eficiente por catequinas contendo um grupo de galato [aparente Ki valores entre

117 & muM para (& minus) -epigalocatequina-galato e (& minus) -epicatequina-galato, respectivamente] do que por catequinas sem este grupo [aparente Ki valores & gt500 & muM para (& menos) -epicatequina e (& menos) -epigalocatequina] [105] Nesta linha de evidência, foi demonstrado que o chá de camomila e o chá verde [contendo (e menos) -epigalocatequina galato (240 mg / g de extrato), (e menos) -epigalocatequina (70 mg / g de extrato), (e menos) -epicatequina (Extrato de 40 mg / g) e (+) - catequina (extrato de 17 mg / g)] inibiu efetivamente o transporte de frutose através de GLUT2 em células Caco-2 diferenciadas [106] Além disso, a camomila também inibe o transporte de D-frutose via GLUT5 em células Caco-2 e em Xenopus oócitos que expressam o GLUT5 de mamífero [106] Da mesma forma, Satsu et al. demonstraram que o galato de epicatequina inibiu a captação de frutose em células Caco-2. Curiosamente, esta redução na captação de frutose não foi relacionada a mudanças na afinidade (Km) de GLUT5 para frutose, mas com uma diminuição na velocidade máxima (Vmax) [107] Além disso, os autores demonstraram que o galato de epicatequina suprimiu a permeação de frutose nas células Caco-2, sugerindo que esse composto suprimiu o transporte transepitelial de frutose através de monocamadas de células epiteliais, além de seu efeito na captação de frutose. Por último, os autores relataram que efeitos semelhantes na captação e permeação de frutose foram observados com nobiletina, outro fitoquímico testado neste estudo [107].

Um composto adicional extraído do chá de amora-preta chinesa (rubusosídeo) inibiu o transporte de frutose mediado por GLUT5 em lipossomas reconstituídos com GLUT5 humano purificado a partir de células de inseto transduzidas com baculovírus [18] Da mesma forma, astragalin-6-glucoside (um derivado glicosilado de astragalin) inibiu o transporte de frutose mediado por GLUT5 nestes proteolipossomas [18] O mesmo grupo realizou uma triagem virtual (in silico) para potenciais inibidores de GLUT5 usando um modelo de GLUT5 3D voltado para dentro contra uma biblioteca de & gt600.000 produtos químicos [108] A capacidade dos compostos mais bem classificados para inibir o transporte de frutose mediado por GLUT5 foi testada em proteolipossomas GLUT5, identificando o N- [4- (metilsulfonil) -2-nitrofenil] -1,3-benzodioxol-5-amina (MSNBA) como um inibidor específico, que não afetou o transporte de frutose de GLUT2 humano ou o transporte de glicose de GLUT1-4 humano [108] Além disso, sistemas de células inteiras para triagem de alto rendimento de inibidores e ativadores de GLUT5 potenciais foram desenvolvidos usando uma cepa de levedura deficiente na captação de frutose [109].

A capacidade de extratos de plantas culinárias contendo fitoquímicos para inibir o transporte de frutose também foi avaliada em células Caco-2. Lee et al. descobriram que a desmetoxicurcumina e a curcumina de extratos de cúrcuma inibiram o transporte de frutose por captação de frutose mediada por GLUT2 e GLUT5, respectivamente [110] Da mesma forma, a catequina da folha de goiaba (Psidium guajava) inibiu a captação de frutose mediada por GLUT5, enquanto a quercetina inibiu o transporte de frutose mediado por GLUT5 e GLUT2 [110] Além disso, a capacidade da folha de goiaba e dos extratos da goiaba de inibir o transporte de glicose também foi demonstrada por M & uumlller et al. em células Caco-2 e camundongos (C57BL / 6N) [111] O efeito desses extratos na captação de glicose nas células Caco-2 foram relacionados à inibição de GLUT2, embora os efeitos na captação de frutose não tenham sido avaliados [111] Mais recentemente, K & oumlnig et al. demonstraram que extratos de frutas preparados a partir de goiaba inibiram a reabsorção intestinal de glicose em um ensaio clínico [112].

Os efeitos da hesperidina, um flavonóide presente no suco de laranja, na captação de frutose em monocamadas de células Caco-2 foram estudados por Kerimi et al. [113] Eles mostraram que a hesperidina inibiu a captação de frutose nessas células usando frutose (130 mM) como a única fonte de açúcares. Digno de nota, o efeito inibitório da hesperidina na captação de frutose foi abolido na presença de outros açúcares, como glicose e sacarose, em altas concentrações (120 mM e 130 mM, respectivamente). Usando Xenopus laevis oócitos que expressam GLUT2 ou GLUT5 humano, eles obtiveram insights sobre os mecanismos moleculares pelos quais a hesperidina inibiu o transporte de frutose. Assim, a hesperidina inibiu a captação de frutose por GLUT5 expressa em Xenopus oócitos. Além de seus efeitos na captação de frutose, a hesperidina reduziu a captação de glicose nas células Caco-2 e inibiu os transportadores de GLUT2 e GLUT5 quando expressa em Xenopus oócitos. Por último, em uma tentativa de reproduzir in vivo esses efeitos previamente observados da hesperidina, os autores conduziram três estudos separados de intervenção humana em voluntários saudáveis ​​usando suco de laranja com diferentes quantidades de hesperidina e uma bebida de controle contendo quantidades equivalentes de glicose, frutose e sacarose, e mediu a resposta glicêmica pós-prandial como biomarcador para o efeito da hesperidina. Eles observaram que a maior diferença na glicemia pós-prandial entre o suco de laranja e a bebida controle era quando o suco era diluído [113] Os efeitos inibitórios de outros flavonóides, como a apigenina, na captação de frutose também foram investigados por Gauer et al. no Xenopus oócitos. A apigenina, bem como (e menos) -epigalocatequina galato, inibiu a captação de frutose em oócitos que expressam GLUT5 [114].

Finalmente, acarbose, um inibidor da alfa-glicosidase que melhora a sensibilidade à insulina e diminui a hiperglicemia pós-prandial [115], não inibe o transporte de frutose em células Caco-2 humanas ou em Xenopus oócitos que expressam o GLUT2 e o GLUT5 de mamíferos [106] Esses resultados sugerem que os efeitos da acarbose na absorção da frutose seriam mediados por seus efeitos bem conhecidos na atenuação da digestão da sacarose [116], em vez de efeitos diretos no transporte de frutose através do epitélio intestinal.


Resumo

A concentração de Mg 2+ necessária para a atividade ótima do cloroplasto frutose 1,6-bisfosfatase (FBPase) diminui quando um dissulfeto, localizado em uma alça flexível contendo três cisteínas conservadas, é reduzido pelo sistema ferredoxina / tioredoxina. A mutação de qualquer uma das duas cisteínas regulatórias neste loop (Cys155 e Cys174 na FBPase do espinafre) produz uma enzima com um S0.5 para Mg 2+ (0,6 mM) idêntico ao observado para a enzima WT reduzida e significativamente menor do que o S0.5 de 12,2 mM de enzima WT oxidada. Em para o dissulfeto regulatório em FBPase de espinafre WT é −305 mV em pH 7,0, com um Em vs dependência do pH de -59 mV / unidade de pH, de pH 5,5 a 8,5. O armazenamento aeróbio do mutante C174S produz um dissulfeto Cys155 / Cys179 não fisiológico, tornando a enzima parcialmente dependente da ativação pela tiorredoxina. Os espectros de dicroísmo circular e as titulações de tiol fornecem evidências de suporte para a formação de ligações dissulfeto não fisiológicas. A mutação de Cys179, a terceira cisteína conservada, produz FBPase que se comporta muito como a enzima WT, mas que é mais rapidamente ativada pela tiorredoxina f, talvez porque o Em do dissulfeto regulatório no mutante foi aumentado para -290 mV (isopotencial com tiorredoxina f) Mudanças estruturais no circuito regulatório inferior S0.5 para Mg 2+ a 3,2 mM para o mutante C179S oxidado. Estes resultados indicam que a abertura da ponte dissulfeto regulatória, seja por redução ou mutação, produz mudanças estruturais que diminuem muito S0.5 para Mg 2+ e que apenas duas das cisteínas conservadas desempenham um papel fisiológico na regulação da FBPase.


Assista o vídeo: A regulação da glicólise e gliconeogênese (Janeiro 2022).