Em formação

Por que o íon magnésio é necessário para a atividade das proteínas G?


Eu estava estudando sobre o sistema de sinalização acoplado à proteína G, em algum lugar que eles mencionaram sobre a necessidade de Mg$^{2+}$ para a atividade da proteína G e relacionou-a com o aumento da produção de AMP cíclico. Em outras leituras, descobri que o referido íon está relacionado à atividade GTPase da proteína G, mas como isso se relaciona ao aumento da produção de AMP cíclico?


O íon pode alterar a estrutura secundária de uma enzima. O íon magnésio é coordenado dentro de certos domínios (por exemplo, o motivo da mão EF) e os torna mais ordenados. Normalmente isso acontece por meio de conchas hidrofílicas de resíduos incorporados em uma hidrofóbica (https://www.pnas.org/content/87/15/5648).

Você pode reverter isso adicionando um quelante (EDTA, por exemplo) e a proteína fica mais desordenada, o que pode afetar sua atividade.


Por que precisamos de magnésio?

O magnésio é um mineral importante, desempenhando um papel em mais de 300 reações enzimáticas no corpo humano. Suas muitas funções incluem ajudar nas funções musculares e nervosas, regular a pressão sanguínea e apoiar o sistema imunológico.

Um corpo adulto contém cerca de 25 gramas (g) de magnésio, 50–60% do qual o sistema esquelético armazena. O resto está presente nos músculos, tecidos moles e fluidos corporais.

Muitas pessoas nos Estados Unidos não consomem magnésio suficiente em sua dieta, embora os sintomas de deficiência sejam incomuns em pessoas saudáveis.

Os médicos associam a deficiência de magnésio a uma série de complicações de saúde, portanto, as pessoas devem procurar atingir os níveis diários recomendados de magnésio.

Amêndoas, espinafre e castanha de caju são alguns dos alimentos mais ricos em magnésio. Se uma pessoa não conseguir obter magnésio suficiente por meio de sua dieta, o médico pode recomendar a ingestão de suplementos.

Neste artigo, examinamos a função e os benefícios do magnésio, o que ele faz no corpo, as fontes dietéticas e os possíveis riscos à saúde que os médicos atribuem ao excesso.

Compartilhe no Pinterest Muitos tipos de nozes e sementes são ricos em magnésio.

O magnésio é um dos sete macrominerais essenciais. Esses macrominerais são minerais que as pessoas precisam consumir em quantidades relativamente grandes - pelo menos 100 miligramas (mg) por dia. Microminerais, como ferro e zinco, são igualmente importantes, embora as pessoas precisem deles em quantidades menores.

O magnésio é vital para muitas funções corporais. Obter o suficiente desse mineral pode ajudar a prevenir ou tratar doenças crônicas, incluindo doença de Alzheimer, diabetes tipo 2, doenças cardiovasculares e enxaqueca.

As seções a seguir discutem a função do magnésio no corpo e seus efeitos na saúde de uma pessoa.

1. Saúde óssea

Embora a maioria das pesquisas tenha se concentrado no papel do cálcio na saúde óssea, o magnésio também é essencial para a formação óssea saudável.

Pesquisas de 2013 relacionaram a ingestão adequada de magnésio com maior densidade óssea, melhor formação de cristais ósseos e menor risco de osteoporose em mulheres após a menopausa.

O magnésio pode melhorar a saúde óssea direta e indiretamente, pois ajuda a regular os níveis de cálcio e vitamina D, que são dois outros nutrientes vitais para a saúde óssea.

2. Diabetes

A pesquisa relacionou dietas com alto teor de magnésio a um risco menor de diabetes tipo 2. Isso pode ser porque o magnésio desempenha um papel importante no controle da glicose e no metabolismo da insulina.

Uma revisão de 2015 no World Journal of Diabetes relata que a maioria, mas não todas, as pessoas com diabetes têm baixo teor de magnésio e que o magnésio pode desempenhar um papel no controle do diabetes.

A deficiência de magnésio pode piorar a resistência à insulina, que é uma condição que geralmente se desenvolve antes do diabetes tipo 2. Por outro lado, a resistência à insulina pode causar baixos níveis de magnésio.

Em muitos estudos, os pesquisadores associaram dietas com alto teor de magnésio ao diabetes. Além disso, uma revisão sistemática de 2017 sugere que tomar suplementos de magnésio também pode melhorar a sensibilidade à insulina em pessoas com baixos níveis de magnésio.

No entanto, os pesquisadores precisam reunir mais evidências antes que os médicos possam usar rotineiramente o magnésio para o controle glicêmico em pessoas com diabetes.

3. Saúde cardiovascular

O corpo precisa de magnésio para manter a saúde dos músculos, incluindo o coração. A pesquisa descobriu que o magnésio desempenha um papel importante na saúde do coração.

Uma revisão de 2018 relata que a deficiência de magnésio pode aumentar o risco de uma pessoa de problemas cardiovasculares. Em parte, isso se deve às suas funções no nível celular. Os autores observam que a deficiência de magnésio é comum em pessoas com insuficiência cardíaca congestiva e pode piorar seus desfechos clínicos.

Pessoas que recebem magnésio logo após um ataque cardíaco têm menor risco de mortalidade. Os médicos às vezes usam magnésio durante o tratamento para insuficiência cardíaca congestiva (ICC) para reduzir o risco de arritmia ou ritmo cardíaco anormal.

De acordo com uma meta-análise de 2019, aumentar a ingestão de magnésio pode diminuir o risco de uma pessoa de derrame. Eles relatam que para cada aumento de 100 mg por dia no magnésio, o risco de derrame é reduzido em 2%.

Algumas pesquisas também sugerem que o magnésio desempenha um papel na hipertensão. No entanto, de acordo com o Office of Dietary Supplements (ODS), com base na pesquisa atual, tomar suplementos de magnésio reduz a pressão arterial "em apenas uma pequena extensão".

O ODS pede uma investigação “ampla e bem elaborada” para entender o papel do magnésio na saúde do coração e na prevenção de doenças cardiovasculares.

4. Enxaqueca

A terapia com magnésio pode ajudar a prevenir ou aliviar dores de cabeça. Isso ocorre porque a deficiência de magnésio pode afetar os neurotransmissores e restringir a constrição dos vasos sanguíneos, fatores que os médicos associam à enxaqueca.

Pessoas que sofrem de enxaqueca podem ter níveis mais baixos de magnésio no sangue e nos tecidos do corpo em comparação com outras pessoas. Os níveis de magnésio no cérebro de uma pessoa podem ser baixos durante uma enxaqueca.

Uma revisão sistemática de 2017 afirma que a terapia com magnésio pode ser útil para prevenir a enxaqueca. Os autores sugerem que tomar 600 mg de citrato de magnésio parece ser uma estratégia de prevenção segura e eficaz.

A American Migraine Foundation relata que as pessoas freqüentemente usam doses de 400–500 mg por dia para a prevenção da enxaqueca.

As quantidades que podem ter um efeito são provavelmente altas e as pessoas só devem usar essa terapia sob a orientação de seu médico.

5. Síndrome pré-menstrual

O magnésio também pode desempenhar um papel na síndrome pré-menstrual (TPM).

Estudos em pequena escala, incluindo um artigo de 2012, sugerem que tomar suplementos de magnésio junto com vitamina B-6 pode melhorar os sintomas da TPM. No entanto, uma revisão mais recente de 2019 relata que a pesquisa é mista e são necessários mais estudos.

O Colégio Americano de Obstetras e Ginecologistas sugere que tomar suplementos de magnésio pode ajudar a reduzir o inchaço, os sintomas de humor e a sensibilidade mamária na TPM.

6. Ansiedade

Os níveis de magnésio podem desempenhar um papel nos transtornos do humor, incluindo depressão e ansiedade.

De acordo com uma revisão sistemática de 2017, níveis baixos de magnésio podem ter ligações com níveis mais elevados de ansiedade. Isso se deve em parte à atividade no eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA), que é um conjunto de três glândulas que controlam a reação de uma pessoa ao estresse.

No entanto, a revisão aponta que a qualidade das evidências é baixa e que os pesquisadores precisam fazer estudos de alta qualidade para descobrir como os suplementos de magnésio podem funcionar na redução da ansiedade.

A tabela a seguir mostra a dose diária recomendada (RDA) para ingestão de magnésio por idade e sexo, de acordo com o ODS.

EraMasculinoFêmea
1-3 anos80 mg80 mg
4-8 anos130 mg130 mg
9–13 anos240 mg240 mg
14-18 anos410 mg360 mg
19-30 anos400 mg310 mg
31-50 anos420 mg320 mg
51+ anos420 mg320 mg

As pessoas devem aumentar a ingestão de magnésio em cerca de 40 mg por dia durante a gravidez.

Os especialistas baseiam a ingestão adequada para bebês menores de 1 ano nas quantidades encontradas no leite materno.

Muitos alimentos contêm altos níveis de magnésio, incluindo nozes e sementes, vegetais verde-escuros, grãos inteiros e leguminosas. Os fabricantes também adicionam magnésio a alguns cereais matinais e outros alimentos fortificados.

As melhores fontes de magnésio incluem:

FontePor porçãoPorcentagem do valor diário
Amêndoas (1 onça ou onça)80 mg20%
Espinafre (meia xícara)78 mg20%
Cajus torrados (1 onça)74 mg19%
Amendoim torrado em óleo (um quarto de xícara)63 mg16%
Leite de soja (1 xícara)61 mg15%
Feijão preto cozido (meia xícara)60 mg15%
Feijão edamame cozido (meia xícara)50 mg13%
Manteiga de amendoim (2 colheres de sopa)49 mg12%
Pão de trigo integral (2 fatias)46 mg12%
Abacate (1 xícara)44 mg11%
Batata com pele (3,5 onças)43 mg11%
Arroz integral cozido (meia xícara)42 mg11%
Iogurte desnatado (8 onças)42 mg11%
Cereais fortificados para o café da manhã40 mg10%
Farinha de aveia instantânea, 1 pacote36 mg9%
Feijão enlatado (meia xícara)35 mg9%
Banana (1 meio)32 mg8%

Os produtos de trigo perdem magnésio quando o trigo é refinado, por isso é melhor escolher cereais e produtos de panificação feitos com grãos inteiros. A maioria das frutas, carnes e peixes comuns contém baixo teor de magnésio.

Embora muitas pessoas não atendam à ingestão recomendada de magnésio, os sintomas de deficiência são raros em pessoas saudáveis. A deficiência de magnésio é conhecida como hipomagnesemia.

A inadequação ou deficiência de magnésio pode resultar do consumo excessivo de álcool, um efeito colateral de certos medicamentos e alguns problemas de saúde, incluindo distúrbios gastrointestinais e diabetes. A deficiência é mais comum em adultos mais velhos.

Os sintomas de deficiência de magnésio incluem:

Os sintomas de deficiência de magnésio mais avançada incluem:

  • cãibras musculares
  • dormência
  • formigamento
  • apreensões
  • mudanças de personalidade
  • alterações do ritmo cardíaco ou espasmos

A pesquisa relacionou a deficiência de magnésio com uma série de condições de saúde, incluindo doença de Alzheimer, diabetes tipo 2, doenças cardiovasculares e enxaqueca.

Uma overdose de magnésio através de fontes dietéticas é improvável porque o corpo eliminará qualquer excesso de magnésio dos alimentos pela urina.

No entanto, uma alta ingestão de magnésio por meio de suplementos pode causar problemas gastrointestinais, como diarreia, náuseas ou cólicas.

Doses muito grandes podem causar problemas renais, pressão arterial baixa, retenção de urina, náuseas e vômitos, depressão, letargia, perda de controle do sistema nervoso central (SNC), parada cardíaca e possivelmente morte.

Pessoas com distúrbios renais não devem tomar suplementos de magnésio, a menos que seu médico assim o aconselhe.

A suplementação de magnésio também pode causar algumas interações medicamentosas. Os medicamentos que podem interagir com suplementos de magnésio ou afetar os níveis de magnésio incluem:

  • bifosfonatos orais que tratam a osteoporose, como o alendronato (Fosamax)
  • Antibióticos de tetraciclina, incluindo doxiciclina (Vibramicina) e demeclociclina (Declomicina)
  • antibióticos quinolonas, incluindo levofloxacina (Levaquin) e ciprofloxacina (Cipro)
  • diuréticos, como furosemida (Lasix)
  • inibidores da bomba de prótons prescritos, incluindo esomeprazol magnésio (Nexium)

Suplementos de magnésio estão disponíveis para compra online, mas é melhor obter qualquer vitamina ou mineral através dos alimentos porque os nutrientes funcionam melhor quando as pessoas os combinam com outros nutrientes.

Muitas vitaminas, minerais e fitonutrientes funcionam sinergicamente. Esse termo significa que tomá-los juntos traz mais benefícios à saúde do que tomá-los separadamente.

É melhor se concentrar em uma dieta saudável e equilibrada para atender às necessidades diárias de magnésio e usar suplementos como reserva, mas sob supervisão médica.

O magnésio é um macronutriente essencial que desempenha um papel fundamental em muitos processos do corpo, incluindo músculos, nervos e saúde óssea e humor.

A pesquisa relacionou as deficiências de magnésio com uma série de complicações de saúde. Se uma pessoa não conseguir atender às suas necessidades diárias com a dieta, o médico pode recomendar a ingestão de suplementos de magnésio.


Reações e doenças da GTPase

Conceitos: Ligação entre GTPases e doença, crescimento de células cancerosas

00: 00: 00.14 Olá. Meu nome é Fred Wittinghofer.
00: 00: 02.18 Sou um líder de grupo emérito no Instituto Max Planck de Fisiologia Molecular em Dortmund, Alemanha.
00: 00: 11.08 E este é o meu segundo seminário
00: 00: 14.01 e na primeira eu apresentei a vocês os interruptores moleculares chamados proteínas de ligação a GTP ou proteínas G.
00: 00: 21.15 E nesta segunda parte irei me concentrar mais em um aspecto particular de nossa pesquisa que é
00: 00: 28.20 que lida com o mecanismo das reações da GTPase e como elas levam a uma série de doenças diferentes.
00: 00: 34.09 E obviamente irei me concentrar principalmente nas proteínas do tipo Ras, das quais falei no meu primeiro seminário.
00: 00: 42,23 Então, novamente, apenas brevemente, o ciclo mecanístico para essas proteínas:
00: 00: 49.25 Eles vêm em dois sabores, essas proteínas, no estado ligado ao GDP e no estado ligado ao GTP.
00: 00: 55.13 Eles têm nucleotídeos fortemente ligados.
00: 00: 58.03 Eles precisam de um fator de troca de nucleotídeo de guanina para liberar GDP para GTP
00: 01: 03.23 porque na célula há mais GTP do que GDP.
00: 01: 06.11 É por isso que a proteína fica carregada com GTP quando o PIB é desativado.
00: 01: 10.06 Eles têm um efeito a jusante na forma ligada ao GTP interagindo com algumas proteínas parceiras.
00: 01: 15.10 E para que a chave seja desligada novamente, você tem a reação GTPase
00: 01: 20,27 em que a proteína divide o GTP em GDP e Pi.
00: 01: 24.29 E essa reação é muito lenta e é catalisada por proteínas chamadas Proteínas Ativadoras de GTPase
00: 01: 31.06 que obviamente será a principal coisa sobre a qual falaremos.
00: 01: 36,24 Então, o que estamos falando, na verdade, é uma reação bioquímica realmente básica
00: 01: 43.23 ou seja, a hidrólise de fosfoanidridos e é semelhante à hidrólise de fosfoésteres.
00: 01: 53.08 Por exemplo, quando você tem proteínas fosforiladas que são fosforiladas na treonina, serina ou tirosina,
00: 01: 57.24 você tem um ataque nucleofílico semelhante ao fosfato pela água.
00: 02: 05.04 E, obviamente, as pessoas têm falado muito sobre essa reação porque é muito
00: 02: 12.15 reação lenta porque os fosfatos são altamente carregados negativamente
00: 02: 19.16 e a abordagem de um nucleófilo, por exemplo, uma água que também está parcialmente carregada negativamente,
00: 02: 25.06 é muito, muito desfavorecido. E é por isso que essa reação normalmente é muito lenta.
00: 02: 30.25 Portanto, embora a reação forneça energia,
00: 02: 33.17 é muito lento porque você tem que superar a energia de ativação muito alta
00: 02: 38.16 que depende do que acabei de dizer - as cargas negativas.
00: 02: 42.04 E quanto maior a energia de ativação, você deve saber a partir de seus cursos de biofísica,
00: 02: 46.13 que quanto maior a energia de ativação, mais lenta é a reação,
00: 02: 51.00 porque a taxa de reação é diretamente proporcional à energia de ativação.
00: 02: 54.18 Então, a natureza, então, usa enzimas para diminuir a energia do estado de transição
00: 03: 00.27 e, assim, tornar a reação mais rápida.
00: 03: 03.15 E tem um artigo interessante que chamo a atenção dos meus alunos o tempo todo
00: 03: 07.21 de Francis Westheimer que escreveu um artigo há muitos anos:
00: 03: 12.01 Por que a natureza escolhe os fosfatos.
00: 03: 13.25 Porque os químicos nunca usam fosfato como um grupo abandonante
00: 03: 17.13 mas em biologia é um grupo de saída muito frequente
00: 03: 21.16 Então, apenas por causa deste propósito aqui, apenas por causa do que mostrei aqui
00: 03: 26.17 a ligação fosfoanidrido ou fosfoéster é cineticamente estável
00: 03: 32.06 em outras palavras, você pode ter seu ATP ou GTP na água e ele permanece para sempre ou hidrolisa muito lentamente.
00: 03: 39,22 Mas termodinamicamente é principalmente instável.
00: 03: 43.00 Se você usar uma enzima, ela diminui a energia de ativação - você pode fazer essa reação muito rápida.
00: 03: 47.14 Esse é um artigo interessante que eu recomendo que você leia.
00: 03: 50.27 Por exemplo, é por isso que o DNA é estável e é por isso que o ATP é uma fonte de energia tão maravilhosa
00: 03: 57.12 porque, em princípio, fornece energia, mas é estável em solução aquosa.
00: 04: 03.28 Então, vamos começar com Ras e sua reação GTPase mediada por GAP porque
00: 04: 10.25 que é realmente o paradigma para muitas das coisas que foram desenvolvidas posteriormente.
00: 04: 15,24 Portanto, esta é a Ras molecular. É uma representação em fita da estrutura
00: 04: 21,29 do domínio G de Ras.
00: 04: 24.16 Você vê seu formato de coração porque.
00: 04: 27.17 obviamente gostamos muito e resolvemos a estrutura em Hiedelberg.
00: 04: 32.00 O anúncio da cidade de Hiedelberg, Ich hab mein Herz em Hiedelberg verloren
00: 04: 36.04 o que significa que perdi o meu coração em Hiedelberg.
00: 04: 37.27 Mas o motivo mais importante de ter a forma de um coração é porque
00: 04: 41.13 as pessoas o chamam de coração pulsante da transdução de sinal.
00: 04: 44.06 E então é uma das moléculas mais importantes que regula
00: 04: 48.14 processos de transdução de sinal importantes, como crescimento, diferenciação e às vezes até apoptose.
00: 04: 54.17 E você provavelmente conhece um pouco sobre o processo de transdução de sinal porque
00: 04: 59.07 todo livro didático possui essa versão, um dos paradigmas da cadeia de transdução de sinal
00: 05: 04.01 em que, por exemplo, um fator de crescimento se liga à membrana celular
00: 05: 08.27 e se liga ao seu receptor do fator de crescimento RTK (receptor tirosina quinase)
00: 05: 14.22 pelo que se torna fosforilado. Recruta o fator de troca SoS
00: 05: 19.04 que ativa o Ras para a forma vinculada ao PIB.
00: 05: 22.16 E então, agora, Ras interage com o componente downstream que é Raf quinase
00: 05: 26.15 que é a quinase inicial para o que é chamado de módulo de quinase MAP.
00: 05: 30,24 Lá, uma quinase ativa a próxima quinase downstream, que é chamada de quinase quinase de MAP.
00: 05: 36.29 MAP quinase quinase quinase ativa MAP quinase quinase e isso ativa MAP quinase
00: 05: 40.28 que então vai para o núcleo e ativa a transcrição.
00: 05: 45.03 Portanto, esta é uma versão muito simplificada do que o Ras está realmente fazendo.
00: 05: 48.16 e este é o primeiro a ser descoberto (a primeira transdução de sinal).
00: 05: 54.15 Mas, agora fica cada vez mais complicado.
00: 05: 57.26 Esta ainda é uma versão muito simplificada, mas já mostra
00: 06: 00.27 a principal coisa sobre a transdução de sinal via Ras é que muitos componentes upstream vêm e ativam o Ras.
00: 06: 09.18 São receptores de tirosina quinase ou receptores acoplados à proteína G
00: 06: 13.09 ou receptores de células T. Todos eles podem ativar o Ras.
00: 06: 16.08 E o Ras pode ativar, a jusante, muitos componentes, não apenas Raf quinase
00: 06: 20.18 mas também uma molécula chamada Ral GEF, PI (3) quinase, PLC epsilon e outros.
00: 06: 26.22 E eles medeiam uma série de reações de transdução de sinal
00: 06: 32.12 que de alguma forma estão integrados em algum lugar, digamos no núcleo,
00: 06: 38.00 por um fator de transcrição e iniciar, quando o limite estiver certo, quando o número de reações estiver certo,
00: 06: 46.15 ele inicia uma resposta celular que pode ser proliferação ou diferenciação ou qualquer outra coisa.
00: 06: 52.03 E não vou tratar de nenhum aspecto disso porque quero me concentrar na reação de desligamento.
00: 06: 57,28 Portanto, a reação de desligamento é novamente o esquema que você viu, agora, muitas vezes
00: 07: 03.25 mas o que acontece no Ras também é um oncogene
00: 07: 06.26 um oncogene que tem dois tipos de mutações, a glicina 12 mutada para qualquer outro aminoácido
00: 07: 13,10 ou glutamina 61 mutada para qualquer outro aminoácido.
00: 07: 16.21 E o que isso faz bioquimicamente é, bloqueia a reação de GTPase mediada por GAP.
00: 07: 23,21 Então você pode imaginar o que acontece, você bloqueou o retorno ao estado inativo
00: 07: 29.13 e é por isso que agora você acumula Ras na forma ligada ao GTP.
00: 07: 33.09 Você não precisa mais de nenhuma sinalização upstream porque o Ras já está no estado vinculado ao GTP.
00: 07: 39.03 E agora tem um efeito que não é mais regulado e é por isso que leva ao câncer.
00: 07: 44,14 Então, essas mutações simples. e é por isso que, obviamente, como bioquímicos estruturais
00: 07: 49,23 é um projeto muito interessante fazer a pergunta:
00: 07: 52.00 Como pode ser que uma única mutação pontual tenha consequências tão dramáticas?
00: 07: 58.19 E também. obviamente, já que Ras é o oncogene mais frequente.
00: 08: 02.28 Cerca de 25% das pessoas que chegam à clínica com diagnóstico de tumor,
00: 08: 09.07 eles têm uma mutação Ras, uma das que te mostrei. Pelo menos esses são os mais frequentes.
00: 08: 15.00 Então, obviamente, todas as empresas farmacêuticas também estão trabalhando para tentar inibir a via Ras
00: 08: 20.29 e a sinalização de Ras como forma de tratamento de cânceres mediados por Ras.
00: 08: 25.28 E há muitas abordagens em que se pode pensar.
00: 08: 30.17 Acabei de indicar alguns aqui. Por exemplo, você pode pensar em Ras. é farnesilado
00: 08: 36.25 na cisteína C-terminal e há uma enzima chamada farnesil transferase que medeia essa reação.
00: 08: 44.18 Há inibidores da farnesil transferase que estão na clínica sendo testados quanto à sua eficácia.
00: 08: 50.00 Mas você também pode pensar em talvez inibir a interação com os efetores downstream.
00: 08: 54.15 Esta é, por exemplo, uma estrutura que determinamos: o complexo entre Ras e Raf quinase (ou parte da Raf quinase).
00: 09: 00.10 Ou você pode até pensar. e é nisso que ainda estamos trabalhando.
00: 09: 04.21 Nossa abordagem de sonho é. a característica básica do Ras oncogênico é que ele não pode hidrolisar o GTP.
00: 09: 12.09 Podemos pensar em fazer pequenas moléculas que induziriam a hidrólise do GTP no Ras oncogênico?
00: 09: 18.21 Este é provavelmente um projeto dos sonhos e ainda estamos trabalhando nele para torná-lo viável.
00: 09: 25.05 Mas vou mostrar, no decorrer da minha apresentação do seminário, que a razão pela qual ainda pensamos ser possível
00: 09: 32,23 é que a química disso não deve ser tão difícil.
00: 09: 36.14 E espero poder te convencer e que você irá comigo nesse ponto no final.
00: 09: 40.26 Então, estamos falando, aqui, de um ataque nucleofílico da água ao fosfato gama do GTP
00: 09: 49.03 mediado por RasGAP e produz Ras-GDP e Pi. Uma reação bioquímica simples
00: 09: 56.09 mas se não funcionar pode ter consequências muito drásticas, nomeadamente o cancro.
00: 10: 00.21 Portanto, antes de mais nada (e você também viu essa imagem várias vezes.
00: 10: 05.24 Este é o meu slide introdutório, sempre)
00: 10: 08.09 é que os dois aminoácidos mais frequentemente mutados
00: 10: 13.16 (qualquer um deles) em versões oncogênicas do Ras, eles estão muito próximos do sítio ativo.
00: 10: 18.07 Então você vê o nucleotídeo aqui: é o fosfato gama
00: 10: 22.07 E você vê que esta é a glutamina 61 e esta é a glicina 12 estão muito perto do sítio ativo
00: 10: 28.10 obviamente, como você provavelmente previu ou pensou antes,
00: 10: 32.06 é que eles estão de alguma forma envolvidos na reação GTPase.
00: 10: 35,22 Agora, obviamente mostraremos o que eles realmente fazem e por que a mutação leva a um bloqueio na hidrólise do GTP.
00: 10: 43.08 E você também pode ver aqui a partir de uma representação de superfície do site ativo Ras
00: 10: 49,12 que se este GTP. então fica. está ligado à superfície
00: 10: 53.26 e você vê que o gama fosfato ainda é acessível de fora
00: 10: 57.03 e isso será importante no contexto do que irei falar
00: 11: 01.12 e você vê também, eu falei, da última vez sobre o magnésio ser importante.
00: 11: 05.20 Se não houver magnésio ao redor, você também não terá reação de hidrólise de GTP.
00: 11: 09.24 Então, como sempre no genoma de um mamífero, não há apenas um RasGAP, mas sim 12 ou 13.
00: 11: 19.08 E indiquei aqui alguns destes.
00: 11: 24.06 E você vê que todos eles contêm um domínio particular de cerca de 330 resíduos.
00: 11: 28.09 Este é o domínio RasGAP que por si só é capaz de iniciar a reação rápida de hidrólise do GTP.
00: 11: 36.17 E você vê que todas essas proteínas são compostas de domínios diferentes.
00: 11: 43.03 E alguns são semelhantes, alguns são muito diferentes.
00: 11: 45.20 E eles obviamente estão regulando o Ras em diferentes contextos da célula
00: 11: 50.04 devido aos diferentes domínios que eles possuem.
00: 11: 53.15 E estarei falando sobre um, o primeiro RasGAP a ser descoberto por Frank McCormick que é o P120GAP.
00: 12: 02.06 E falarei mais tarde sobre NF1
00: 12: 05.05 que é outro elemento importante para a formação de tumor porque é um gene supressor de tumor.
00: 12: 12.04 Então, antes de mais nada, e novamente para lembrá-lo, a hidrólise intrínseca do GTP é muito lenta.
00: 12: 17.23 Mas, se você adicionar a proteína ativadora de GTPase, é rápido.
00: 12: 21.08 Então, o que tenho feito aqui é pegar GTP radioativo (marcado com gama, por exemplo)
00: 12: 25,27 e então mede a produção de Pi ao longo do tempo.
00: 12: 29,26 Veja, lá embaixo, essa reação (isso é em temperatura ambiente) é quase desprezível.
00: 12: 35.14 Quase não há hidrólise do Ras normal à temperatura ambiente sem GAP.
00: 12: 40.12 E se você adicionar uma determinada quantidade de RasGAP, verá que há uma reação muito rápida.
00: 12: 44.23 Muito, muito mais rápido.
00: 12: 46.04 E sob condições limitadas, é na verdade cerca de 10 ^ 5 vezes a estimulação dessa reação.
00: 12: 53,10 Então essa é a maneira que queremos ver.
00: 12: 57,05 Queremos analisar como o GAP medeia essa rápida reação de hidrólise do GTP.
00: 13: 03.14 Então, inicialmente, obviamente, você se pergunta: Qual poderia ser o mecanismo de hidrólise
00: 13: 10.11 e qual é a etapa que é catalisada pelo GAP?
00: 13: 14.02 Você pode pensar em Ras-GTP sendo, em princípio, uma enzima de hidrólise de GTP rápida
00: 13: 20.14, mas precisa entrar em um estado competente de GTPase por uma reação de isomerização.
00: 13: 26.15 E isso é muito lento e é catalisado pelo GAP.
00: 13: 28.29 Ou você pode pensar que a reação de clivagem real, indo de GTP para GDP Pi,
00: 13: 35.02 é muito lento e é catalisado por GAP.
00: 13: 38.01 Ou você pode até pensar que tudo isso ainda é muito rápido
00: 13: 41.09 mas a liberação de Pi para o produto é muito lenta e isso é catalisado por GAP.
00: 13: 47.08 Por exemplo, se você se lembra de ter ouvido falar sobre a hidrólise de ATP na miosina,
00: 13: 53.26 miosina é, por exemplo, uma GTPase muito rápida, mas a liberação de Pi é muito lenta
00: 13: 59.00 e precisa ser catalisada pela actina.
00: 14: 01.04 Então, em outras palavras, qual é a etapa real que é catalisada pelo GAP neste caso específico?
00: 14: 07.10 E devo dizer que é a própria reação de clivagem
00: 14: 11.12 que é o principal ponto de ataque pela proteína ativadora de GTPase
00: 14: 16.21 e que apenas na presença de GAP as outras reações
00: 14: 20.18 tornam-se pelo menos parcialmente limitantes da taxa, pelo menos a liberação de Pi.
00: 14: 24.10 E vou mostrar isso mais tarde, também.
00: 14: 27,29 E embora eu já tenha mostrado isso antes, vou repetir isso novamente.
00: 14: 32.12 Então, o que usamos muito em nossos estudos onde fazemos bioquímica com nucleotídeo fluorescente,
00: 14: 38.20 usamos um mant- ou mGDP ou mGTP analógico
00: 14: 42.29 onde você tem, na ribose, um grupo repórter fluorescente.
00: 14: 46.24 Então, isso seria desoxi ribose ou ribose e na ribose que você vinculou
00: 14: 52.17 essas ligações éster, o grupo mant, que é muito sensível ao ambiente em que se encontra.
00: 14: 59.19 E é por isso que sempre dá mudanças estruturais muito bonitas, como vou mostrar a vocês em um minuto.
00: 15: 07.10 Usamos o fluxo de parada para medir reações rápidas porque, lembre-se, a reação de GTPase,
00: 15: 13.29 que é lento na ausência de GAP torna-se muito rápido
00: 15: 17.15 e, portanto, para analisá-lo em detalhes, precisamos usar a cinética de stop-flow.
00: 15: 21.16 Então, o que você, por exemplo, fará: você rotulou Ras com
00: 15: 25.10 mant-GTP (portanto, é a versão fluorescente do GTP)
00: 15: 28.16 e você tem GAP e você os filmou juntos em uma cubeta de detecção fluorescente
00: 15: 34.02 e você tem o fluxo de parada aqui, a fim de
00: 15: 37.17 certifique-se de colocar apenas uma certa quantidade de líquido dessas duas seringas em sua câmara de reação.
00: 15: 44.07 Então, quando fazemos isso, quando filmamos essas duas coisas juntas, vemos que há
00: 15: 50.09 um aumento fluorescente se você usar Ras-mantGTP e um decréscimo.
00: 15: 54,09 O aumento, novamente, é muito rápido.
00: 15: 56.25 Significa que as duas proteínas formam um complexo.
00: 15: 58.27 E então, com o tempo, o complexo se dissocia porque, após a hidrólise, a neurofibromina não se liga mais ao Ras.
00: 16: 07.18 E tudo isso acabou, como você pode ver, após um segundo.
00: 16: 10.09 Então, reação de fosfo-transferência muito rápida na presença de quantidades saturantes de GAP.
00: 16: 15.07 E como um controle, usamos Ras vinculado a um analógico, GppNHp,
00: 16: 21.25 onde você que entre o beta e o gama fosfato você tem um grupo NH
00: 16: 25.16 que não pode mais ser hidrolisado e agora você tem, também, um aumento muito rápido
00: 16: 30.17 (que é a formação do complexo), mas sem dissociação porque isso não pode ser hidrolisado.
00: 16: 35.05 Então essa também é a prova de que a dissociação é devido à hidrólise do GTP.
00: 16: 40.21 Então, pode-se perguntar: "Nesta reação aqui, o que no GAP, que resíduos no GAP,
00: 16: 50.01 estão envolvidos na mediação desta reação rápida de hidrólise de GTP, que estimula 10 ^ 5 vezes a reação? "
00: 16: 58.17 E, obviamente, você estava pensando em quais resíduos, quais aminoácidos poderiam fazer o trabalho.
00: 17: 03.16 Ou é mais de um aminoácido?
00: 17: 05.16 E como um bom candidato, estávamos pensando em uma arginina
00: 17: 08.16 porque se você olhar para outra proteína G, proteína G-alfa (das proteínas G heterotriméricas)
00: 17: 15.02 sabe-se que consiste em dois domínios
00: 17: 18.25 então este domínio azul é o domínio G e o material vermelho aqui é um domínio extra helicoidal.
00: 17: 24.21 Mas nesse domínio helicoidal você tem uma arginina que fica bem, bem no site ativo
00: 17: 29,24 e foi demonstrado que a arginina é importante para a reação.
00: 17: 33.29 E isso foi mostrado em um experimento muito antigo
00: 17: 37.20 porque existe um patógeno bacteriano chamado Vibrio cholera que induz cólera
00: 17: 45,29 e o que ela faz é realmente modificar essa arginina nesta proteína G-alfa.
00: 17: 51.16 Veja, você tem NAD e a toxina da cólera transfere ADP-ribose para
00: 17: 58.03 uma arginina de G-alfa que é mostrada aqui. Isso é realmente do livro aqui.
00: 18: 02.26 Portanto, esta é uma reação muito antiga. Foi analisado há muitos, muitos anos.
00: 18: 07.10 E isso mostra, quando você faz essa reação, quando você bloqueia
00: 18: 10.16 a reação de GTPase na proteína G-alfa, não há mais hidrólise de GTP
00: 18: 16.10 e a proteína agora está produzindo AMP cíclico,
00: 18: 19.14 ele abre canais (canais de íons dependentes de AMP cíclico) e então você obtém todos esses sintomas de cólera.
00: 18: 26,19 Então, novamente a questão é: a arginina seria uma boa candidata?
00: 18: 29.29 Então, procuramos arginina conservada em todos os RasGAPs que mostrei
00: 18: 33.24 e de fato, encontramos vários, a maioria deles não fez nenhuma diferença.
00: 18: 38.06 Mas havia apenas uma arginina que, quando sofreu mutação, mostrou o seguinte padrão na reação.
00: 18: 43.19 Então você, novamente, tem na versão verde (esta é a versão do tipo selvagem)
00: 18: 47,23 aumento rápido devido à formação do complexo, diminuição rápida devido à dissociação após a hidrólise do GTP.
00: 18: 53.16 E com esses mutantes aqui, arginina sofreu mutação para lisina ou alanina
00: 18: 58.11 ou qualquer coisa que você gostaria de transformar,
00: 19: 00.03 há novamente um aumento na reação, mas depois ela fica lá em cima, sem hidrólise alguma.
00: 19: 06.13 Ou, pelo menos nessas circunstâncias, até um segundo, não há hidrólise.
00: 19: 10.16 O que já diz a você, obviamente, que essa arginina deve ser essencial para a reação.
00: 19: 18.02 Até aqui tudo bem. A bioquímica era clara
00: 19: 21.09, mas obviamente você não sabe realmente o que a arginina está fazendo no contexto.
00: 19: 24.05 Você acha que tem uma ideia de que ela pode estar indo para o site ativo
00: 19: 28.02 mas, novamente, temos que esperar que a estrutura nos diga realmente o que ela faz.
00: 19: 33.21 Antes de mais nada, deixe-me apresentar outro conceito importante para analisar a reação de transferência de fosfo.
00: 19: 40.12 E isso está usando complexos de fluoreto de alumínio.
00: 19: 43.02 Você pode se perguntar por que tal molécula inorgânica seria importante
00: 19: 47.14 mas acontece que se você olhar para a natureza do estado de transição,
00: 19: 51.20 então este seria o GTP sendo atacado por água.
00: 19: 55.18 Você tem um estado de transição em que o fosfato agora faz uma coisa triginal, plana
00: 20: 00.26 onde o oxigênio nucleofílico e o oxigênio do grupo de saída do outro lado
00: 20: 08.22 são os ligantes axiais deste fosfato coordenado penta
00: 20: 12.11 e este estado de transição pode ser muito restrito (que é então chamado de associativo)
00: 20: 18.16 ou muito solto, dependendo da distância aqui entre o fosfato e os dois ligantes axiais.
00: 20: 25.26 E então você acaba com, novamente, fosfato tetragonal (este fosfato livre de Pi).
00: 20: 32.08 E acontece que o fluoreto de alumínio
00: 20: 36.05 (que tem uma distância entre o alumínio e o flúor muito semelhante a
00: 20: 39.23 entre fosfato e oxigênio e eles também são altamente negativos para elétrons)
00: 20: 44.26 que esta é uma imitação muito boa do estado de transição da reação de fosfo-transferência.
00: 20: 51.02 O único problema era que, por exemplo, cinesina ou miosina ou
00: 20: 56.28 muitas outras enzimas de transferência de fosfo usam fluoreto de alumínio como um mimetizador do
00: 21: 02.07 gama-fosfato no estado de transição,
00: 21: 04.17 Ras ou Rho e todas essas proteínas semelhantes a Ras, nunca mostraram isso.
00: 21: 08.25 Aqui você vê esse experimento.
00: 21: 11.19 Você pega Ras-mantGDP (tem um certo espectro de emissão fluorescente com um máximo em torno de 440)
00: 21: 19.03 e agora você adiciona o GAP e com um não há nenhuma mudança no espectro.
00: 21: 24.12 Portanto, nada acontece.
00: 21: 25.11 Mas se você adicionar agora fluoreto de alumínio, verá que agora obtém um deslocamento para o azul antes de tudo
00: 21: 31.00 e, em seguida, um aumento na absorção.
00: 21: 37.11 Isso significa que há um complexo trimérico entre Ras, NF1 e fluoreto de alumínio
00: 21: 42.07 onde o fluoreto de alumínio fica no local de ligação do fosfato gama.
00: 21: 47.10 E isso foi muito instrumental.
00: 21: 48.25 e, a propósito, se você fizer isso agora em mutantes oncogênicos
00: 21: 52.02 que sabemos não hidrolisar GTP e fazer o mesmo experimento,
00: 21: 55.15 você vê, na presença de fluoreto de alumínio e Ras, não há mudança fluorescente.
00: 22: 00.06 E agora você adiciona NF1 e não há aumento na fluorescência
00: 22: 04.12 porque você tem uma mutação (Q61L) que não hidrolisa.
00: 22: 08.13 Você também pode obter uma mutação de NF1, por exemplo, com a mutação de arginina,
00: 22: 13,22 e, novamente, não haveria nenhuma mudança.
00: 22: 16.05 Então, em outras palavras, o que esses experimentos nos dizem é que o Ras é uma enzima de transferência de fosfo incompleta.
00: 22: 22.22 É necessária a presença de um GAP para se parecer com uma enzima de transferência de fosfo
00: 22: 28.05 e se houver alguma mutação que bloqueie a reação da GTPase, seja no Ras ou no NF1,
00: 22: 33.22 também não temos nenhum complexo de fluoreto de alumínio.
00: 22: 37.09 Então, obviamente, tudo isso é bom em termos de bioquímica
00: 22: 42.00 mas o que realmente medeia a reação da GTPase, a rápida,
00: 22: 47.22 pensamos que só pode ser verificado olhando para a estrutura do complexo Ras e RasGAP.
00: 22: 55,29 Isso é mostrado aqui. Então esse foi o paradigma para analisar esse tipo de reação.
00: 23: 02.06 Então você vê, por exemplo, em vermelho você vê Ras e abaixo em verde está o domínio RasGAP (P120 GAP).
00: 23: 09.13 E o que você vê então, aqui. se você olhar com muito cuidado
00: 23: 12.04 você vê que há um resíduo de GAP indo para o site ativo.
00: 23: 17,14 Você vê isso quando ele volta. você vê isso aí.
00: 23: 21.01 Há um resíduo de arginina apontando para o sítio ativo de Ras
00: 23: 26.04 e o que ele faz é mostrado no próximo slide.
00: 23: 29.06 Em primeiro lugar, neste slide, ele mostra que o fluoreto de alumínio é realmente o triângulo achatado
00: 23: 34.00 que fica entre o grupo de saída e a água nucleofílica.
00: 23: 38.07 Portanto, há uma imitação do estado de transição.
00: 23: 39,28 E você vê então, também, quais são os resíduos que medeiam a hidrólise rápida de GTP.
00: 23: 45.17 Então este seria o fosfato,
00: 23: 48.14 então pensamos agora que se retirarmos o fluoreto de alumínio e
00: 23: 52.06 pense em como seria o estado de transição real
00: 23: 55.06 você tem a água nucleofílica e você tem o estado de transição
00: 23: 58.29 onde estão ligados ao fosfato gama
00: 24: 00.25 e a glutamina está fixando a água em relação ao fosfato
00: 24: 05.07 por um aceitador e uma interação doador de ligação de hidrogênio.
00: 24: 09.17 E a arginina (o que chamamos de dedo de arginina) é, antes de mais nada, estabilizadora
00: 24: 13.29 a posição dessa glutamina e também entrega essa carga positiva
00: 24: 18.03 do grupo amino para neutralizar cargas no fosfato gama.
00: 24: 22.28 Então, esses são os dois resíduos que são realmente cruciais para a reação
00: 24: 27.08 glutamina 61 do Ras e o dedo de arginina do RasGAP.
00: 24: 32.05 E isso já explica, por exemplo, porque as mutações da glutamina 61 no Ras oncogênico
00: 24: 37.19 atrapalham a reação de hidrólise porque você pode imaginar se tiver, por exemplo,
00: 24: 42.09 uma leucina ou qualquer coisa aqui, se não puder fazer esse tipo de interação aqui.
00: 24: 47.00 Portanto, qualquer mutação da glutamina 61 é oncogênica porque é um resíduo catalítico direto.
00: 24: 53.16 Portanto, a estrutura também explica por que as mutações da glicina 12 são oncogênicas.
00: 24: 58,22 E isso também pode ser facilmente visto aqui neste slide.
00: 25: 02.04 Você tem glicina 12 que, quando transformada em qualquer resíduo, a torna um oncogene.
00: 25: 06.25 E então você vê o fluoreto de alumínio sendo este triângulo plano.
00: 25: 11.08 Você vê a glutamina 61 lá e você vê o dedo de arginina aqui embaixo.
00: 25: 16.09 E estão todos muito próximos, indicados por estas linhas tracejadas azuis
00: 25: 20.04 que indicam que estão a uma distância de quase VanDerWaals.
00: 25: 24.04 E agora, se você transformar, por exemplo, a glicina no menor aminoácido possível,
00: 25: 28.11 seria alanina, você vê que iria bagunçar imediatamente todos esses resíduos no sítio ativo.
00: 25: 34.01 Portanto, por razões estéricas, não pode haver outro resíduo
00: 25: 36,24 no sítio ativo no estado de transição, exceto para a glicina.
00: 25: 43.08 Então, a mensagem de tudo isso foi, obviamente, que há uma arginina
00: 25: 49.00 que chamamos de dedo de arginina que puxa o gatilho da reação GTPase.
00: 25: 54.00 Sem ele, é muito lento e, com ele, torna-se 10 ^ 5 vezes mais rápido.
00: 26: 01.01 Também usamos. portanto, voltando à questão: o que é agora um fator limitante de taxa em todo o processo?
00: 26: 07.00 Portanto, a principal etapa de regulação da hidrólise intrínseca do GTP é a etapa química muito lenta, a hidrólise lenta.
00: 26: 14.29 Mas, usando uma técnica diferente, agora descobrimos que
00: 26: 17.25 há outra etapa que se torna parcialmente limitadora da taxa e vou mostrar isso em um minuto.
00: 26: 23,29 Portanto, usamos a espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier resolvida no tempo.
00: 26: 28.10 E com isso podemos fazer uma resolução quase atômica.
00: 26: 33.11 Podemos olhar para os átomos no sítio ativo em uma escala de tempo de milissegundos.
00: 26: 37,27 Então, se você vir um espectro infravermelho de uma proteína, que tem bandas amida I e amida II,
00: 26: 47.20 que não é uma informação muito estruturada porque é uma mistura de informações sobre
00: 26: 54.26 hélices alfa, folhas beta e assim por diante e nenhum grande detalhe pode ser tirado de tal foto.
00: 27: 02.26 Mas o que fazemos é observar, para ver uma reação. digamos que uma proteína vai de A para B
00: 27: 09.05 observamos os diferentes espectros que pelo menos nesta escala de absorção
00: 27: 16.19 não mostra muita diferença, mas se você olhar em mais detalhes.
00: 27: 20.15 então você vê que a absorção lá é 0,0 e a absorção aqui é 0,02,
00: 27: 25.14 então vemos mudanças muito pequenas, mas muito reproduzíveis
00: 27: 29,21 no curso da reação quando A vai para B.
00: 27: 33.02 E vemos picos negativos que significam que A vai embora e vemos picos positivos se B subir.
00: 27: 40.22 Para que possamos observar as coisas que se perdem e as que surgem
00: 27: 43.29 no curso da reação e podemos acompanhá-los por FTIR.
00: 27: 49.25 E então se você fizer. então, em primeiro lugar, precisamos acionar a reação em um determinado momento
00: 27: 56.25 a fim de observar mudanças estruturais de segunda escala de tempo.
00: 28: 03.04 E para fazer isso usamos, novamente, um análogo diferente
00: 28: 07.00 e o análogo diferente é o GTP enjaulado que foi desenvolvido por Roger Goody
00: 28: 10.22 que é um colega meu no Instituto.
00: 28: 14.05 E este GTP enjaulado é bloqueado no fosfato gama pelo que é chamado de grupo da gaiola.
00: 28: 20.22 Portanto, não permite a hidrólise, mas agora, com um flash de luz, você pode separar aquele grupo de gaiolas
00: 28: 26.21 e agora você tem Ras-GTP, que pode hidrolisar em GDP e Pi.
00: 28: 31.19 Se você fizer isso com, digamos, Ras sem GAP,
00: 28: 39.11 o que você vê é que você tem um. por exemplo, você vê a absorção.
00: 28: 44.22 então qualquer absorbância que você possa conhecer do infravermelho mostra uma vibração atômica nas ligações.
00: 28: 51.09 Por exemplo, você vê vibrações para o
00: 28: 53.15 alfa, o beta, o gama, que diminuem no final e se tornam zero após 2 horas e 5 minutos.
00: 29: 00.29 Portanto, o espectro de diferença (subtraia o espectro final do espectro inicial)
00: 29: 06.16 e então você vê apenas as mudanças que estão ocorrendo durante a reação.
00: 29: 11,23 E isso é perfeitamente normal. Há um único decaimento exponencial quando Ras hidrolisa o GTP.
00: 29: 18,21 Não é grande coisa.
00: 29: 20.15 Mas o que é interessante é que quando você analisa a reação mediada por GAP
00: 29: 24.26 porque agora você não vê uma única queda exponencial, mas de repente você vê intermediários aparecerem.
00: 29: 30.14 Você vê picos que sobem e descem e o mais importante é
00: 29: 35,04 indicado por este número 1113. Esta é a frequência para essa mudança específica.
00: 29: 39.28 Então obviamente você tem que analisar o que cada banda está fazendo, a que pertence.
00: 29: 47.06 Então, o que estamos fazendo em ordem. nós desenvolvemos essas técnicas
00: 29: 52.17 ou nossos colegas da Universidade de Bochum com quem colaboramos
00: 29: 56.03 eles desenvolveram técnicas para descobrir o que é cada largura de banda,
00: 30: 01.01 qual é cada frequência. mudança de absorbância. a que isso se deve.
00: 30: 03.28 Por exemplo, você encontra para GTP que há uma mudança de absorbância chegando com
00: 30: 10,13 uma constante de taxa k2. Então k1 é a fotoisomerização, k2 é uma reação e k3 é a próxima.
00: 30: 17,18 E se você fizer isso, você obtém um aumento e uma diminuição com k3.
00: 30: 21.12 E então há um intermediário que está chegando em 1113.
00: 30: 26,12 Ele vem com k2 e decai com k3.
00h30: 30.01 Há Pi grátis vindo com k3. De tudo isso, podemos obviamente concluir
00: 30: 35.18 que existe um Pi intermediário com esta frequência de absorção aqui, 1113 cm ^ -1
00: 30: 44.02 que aparece com a constante de taxa k2 e decai com uma constante de taxa k3.
00: 30: 50.03 Então, em outras palavras, a liberação de Pi agora está se tornando visível.
00: 30: 54.25 Portanto, vemos a hidrólise quando esse pico de Pi surge.
00: 30: 58,21 E vemos a decadência quando ele vai embora.
00: 31: 01.01 E você vê isso aqui, por exemplo, em tempo real.
00: 31: 03.25 Portanto, a absorção muda com a constante de velocidade k2. você vê o esquema aqui:
00: 31: 09.05 Ras quando está no estado ligado vai para o estado Pi e você vê que há um Pi ligado à proteína
00: 31: 17,13 que sobe e a banda Pi diminui no decorrer da reação.
00: 31: 21.20 E isso é repetido várias vezes.
00: 31: 23.07 E você também para que haja um dedo de arginina entrando e saindo da câmara de reação.
00: 31: 30.00 Portanto, podemos seguir não apenas as bandas de proteínas,
00: 31: 32.16 podemos seguir as bandas de fosfato em resolução atômica em uma escala de tempo de milissegundos.
00: 31: 40.26 E isso nos diz agora, todos juntos, essa é a mensagem de tudo isso,
00: 31: 46.01 que, embora você tenha uma alta energia de ativação para a reação de hidrólise intrínseca de 92kJ / mol
00: 31: 54.01 agora você separa a reação em duas reações parciais,
00: 31: 57.16 que tem uma energia de ativação mais baixa e é por isso que o torna muito mais rápido.
00: 32: 01.08 Então você tem a primeira energia de ativação para a reação de clivagem. o que leva a Ras-PIB-Pi.
00: 32: 08.03 E você tem a segunda etapa em que libera o Pi e agora tem o produto.
00: 32: 12.14 Então, esse é, novamente, um tema geral da enzimologia
00: 32: 15.12 que uma reação catalisada por enzima reduz a energia de ativação
00: 32: 20.00 não apenas reduzindo uma reação, mas também subdividindo-a em etapas parciais
00: 32: 24.28 cada um dos quais tem uma energia de ativação diferente.
00: 32: 29.22 E aqui você vê que esta energia de ativação é 59 kcal / mol e 66, o que significa
00: 32: 36.04 que isso é um pouco mais alto e é por isso que esta é a etapa parcialmente limitadora de taxa da reação geral.
00: 32: 45,12 Então deixe-me dar-lhe agora. então esse era o Ras e como isso leva à formação de tumor
00: 32: 50.14 e analisamos em detalhes como essa função, mesmo em um nível biofísico
00: 32: 55.02, mas agora deixe-me voltar ao motivo pelo qual certas reações de GTPase, quando não funcionam,
00: 33: 03.00 como eles levam a diferentes tipos de doenças.
00: 33: 05.20 A neurofibromatose é uma delas.
00: 33: 07.27 Já mostrei para vocês que a neurofibromina, o produto gênico do gene, é um Ras GAP.
00: 33: 15.09 E há uma doença chamada Neurofibromatose Tipo I. É o que as pessoas têm manchas café com leite na pele,
00: 33: 22.21 às vezes pequenos tumores na pele que às vezes podem ser bastante grandes e muito desfigurantes
00: 33: 28.16 que são causados ​​por mutação ou deleção do gene da neurofibromatose.
00: 33: 35.21 E, por exemplo, quando trabalhamos no mecanismo de hidrólise do GTP, por GAP e NF1,
00: 33: 43.00 um colega da Clínica Charite em Berlim veio até nós e nos disse que tinha
00: 33: 48.03 uma paciente que morre aos 35 anos e tem três filhos indicados lá
00: 33: 55.20 que também tem a doença. E ele analisou o sangue do paciente e depois o próprio tumor.
00: 34: 04.22 Ele descobriu que há uma mutação na sequência da neurofibrobromina
00: 34: 11,29 em que a arginina é transformada em prolina. Você vê que lá embaixo a arginina é transformada em prolina.
00: 34: 17.13 E obviamente eu não diria isso, se não fosse a arginina catalítica.
00: 34: 21.19 Acontece que eles têm uma mutação na arginina catalítica
00: 34: 25.23 e quando você fizer a reação GTPase que mostrei antes,
00: 34: 30.09 você vê que você tem, com NF1 normal você tem a curva azul aqui,
00: 34: 37.17 significa um aumento na fluorescência e uma diminuição com a hidrólise
00: 34: 43.03 e agora se você tomar essa mutação, R para P, você tem aumento, o que significa formação de complexo
00: 34: 48.03 mas sem hidrólise e há outro paciente que analisamos entretanto
00: 34: 53.16 novamente arginina para qualquer outra coisa, Q neste caso particular,
00: 34: 58.09 leva a um bloqueio de sua capacidade de hidrolisar GTP em Ras.
00: 35: 02.17 Portanto, a mutação da arginina essencial leva à neurofibromatose.
00: 35: 08.16 Além disso, devo salientar que existem muitas outras mutações na neurofibromina
00: 35: 13.22 que também causam a doença que é fenotipicamente muito diferente em muitos pacientes diferentes.
00: 35: 20.26 Deixe-me apresentá-lo agora a um sistema diferente que é
00: 35: 24.06 interessante tanto do ponto de vista bioquímico, mas também do ponto de vista de uma doença diferente
00: 35: 29.11 que irei abordar no devido tempo.
00: 35: 33.03 Então, vou falar de uma molécula chamada Rap que, obviamente, tem um RasGAP cognato.
00: 35: 40.16 E Rap é homólogo próximo de Ras e o nome deriva de
00: 35: 44.05 o fato de ser altamente homólogo a Ras porque Rap significa Ras Proximate.
00: 35: 49.07 Mesmo sendo considerado um homólogo próximo do Ras, ele faz algo completamente diferente.
00: 35: 55.14 Obviamente, tem o mesmo ciclo entre o PIB e o GTP. Portanto, funciona como um interruptor molecular.
00: 36: 02.00 Mas não tem a ver com proliferação, como Ras, ou diferenciação, mas sim
00: 36: 06.10 está envolvido na ativação da integrina, ou ativação das plaquetas ou outras coisas.
00: 36: 11.19 Portanto, a biologia do Rap é completamente diferente.
00: 36: 14.17 Por que a bioquímica é tão interessante é que o Rap é o único homólogo
00: 36: 22.12 ou o único membro da superfamília Ras que não tem glutamina na posição
00: 36: 27.18 onde a glutamina 61 de Ras está envolvida na hidrólise do GTP.
00: 36: 33.01 Então, falta o resíduo que pensávamos ser absolutamente crucial a hidrólise do GTP e aqui, não está lá.
00: 36: 39.18 E, obviamente, a questão é por que isso acontece e como o RapGAP
00: 36: 42.25 então trabalhe neste sistema e como ele estimula a reação.
00: 36: 48.29 Então, antes de mais nada, deixe-me apresentá-lo aos RapGAPs.
00: 36: 52.24 São indicados aqui cinco deles, mas há mais no genoma humano
00: 36: 57.23 mas todos esses cinco RapGAPs contêm um domínio que é altamente homólogo
00: 37: 04.02 que é indicado aqui pela coloração azul claro e azul escuro
00: 37: 08.09 onde o material azul claro é um pouco diferente do azul escuro.
00: 37: 12.05 E vou explicar isso quando olharmos para a estrutura.
00: 37: 13.21 Então, novamente, a organização do domínio de todos esses cinco RapGAPs é um pouco diferente.
00: 37: 17.25 Isso significa que provavelmente estão fazendo o seu trabalho em um contexto biológico diferente.
00: 37: 23.04 O motivo pelo qual também é interessante é que a região de homologia em azul escuro é
00: 37: 28.10 também conservado em uma proteína chamada Tuberin
00: 37: 30.17 que representa uma doença da qual irei falar no final.
00: 37: 34.03 É por isso que também foi interessante observar essa reação.
00: 37: 37.06 E a terceira razão pela qual é interessante observar essa reação é indicada no próximo slide.
00: 37: 42.19 Mas antes de fazer isso, deixe-me mostrar-lhe, em primeiro lugar, que fazemos, novamente, um ensaio de fluorescência de fluxo interrompido.
00: 37: 48.23 Desenvolvemos um sistema onde podemos olhar para esta reação de uma forma bioquímica
00: 37: 53.12 e analisar mutações e a velocidade de reação e assim por diante.
00: 37: 58.13 Então, aqui novamente, temos Rap-GTP interagindo com RapGAP
00: 38: 03.20 Você obtém um grande e rápido aumento fluorescente que é devido à formação do complexo
00: 38: 07,28 e uma diminuição devido à hidrólise do GTP e dissociação do produto.
00: 38: 12,25 E está tudo acabado, novamente, após um segundo.
00: 38: 16.03 enquanto sem RapGAP, toda a reação levaria horas.
00: 38: 19.25 Então, em outras palavras, temos novamente 10 ^ 5 estimulação da reação.
00: 38: 23.15 Mas a razão pela qual este também é um sistema interessante bioquímica e mecanicamente,
00: 38: 29.09 é que há uma série de argininas conservadas em RapGAPs e, obviamente,
00: 38: 35.00 pensamos que um deles estaria envolvido no fornecimento de um dedo de arginina ao sistema.
00: 38: 39.06 Na verdade, transformamos todos eles em alanina
00: 38: 42.06 e nenhum deles tem qualquer efeito dramático na atividade como se pode ver aqui.
00: 38: 48,02 Portanto, a pior reação ainda está perto de 0,5 / segundo.
00: 38: 52.02 Então, em outras palavras, não há um efeito dramático quando você muda uma das argininas
00: 38: 55.29 o que torna improvável que haja um dedo de arginina envolvido na reação.
00: 39: 00.23 Assim, os dois resíduos, a glutamina intrínseca e o dedo de arginina em trans
00: 39: 09.04 que é Ras e Rho e outros fazem a catálise importante não estão aqui neste sistema.
00: 39: 17.05 Isso significa que toda a química deve ser totalmente diferente.
00: 39: 21.15 Então, olhamos para o FTIR do sistema novamente e
00: 39: 26.07 mostra basicamente as mesmas características, mesmo que suas estruturas sejam um pouco diferentes.
00: 39: 31.16 As características básicas são que existe um intermediário Pi cuja diminuição é limitante da taxa
00: 39: 37,23 para a reação e, embora seja quimicamente um pouco diferente,
00: 39: 41,27 como mostram os diferentes espectros de absorção, é, de fato, cineticamente um intermediário mais importante.
00: 39: 50.11 Mas o que foi interessante, e encontramos neste caso particular, no caso RapGAP,
00: 39: 56.10 e também foi encontrado em outros sistemas nesse ínterim,
00: 39: 58,27 é que a reação da GTPase é reversível,
00: 40: 01.29 o que parece meio maluco, porque é uma reação descendente.
00: 40: 05.06 Se você pegar o GDP e Pi e todo o sistema, você nunca criaria o GTP.
00: 40: 09.22 Mas o que acontece é que se você analisar a reação
00: 40: 13.05 usando, em vez de água normal, água O18, que é indicada por este ponto preto,
00: 40: 17.23 você esperaria que na reação obtivesse hidrólise e, em seguida, obtivesse PIB e Pi
00: 40: 23.27 que tem um fosfato rotulado como oxigênio O18, em vez, um oxigênio rotulado como oxigênio O18.
00: 40: 30.12 Mas em vez de obter um Pi com um oxigênio O18, você obtém Pi com dois oxigênios O18,
00: 40: 36.24 com três oxigênios O18 e com quatro oxigênios O18 conforme analisado aqui por um espectro de massa.
00: 40: 42.11 Veja onde você consegue todos esses quatro produtos, analisados ​​por espectroscopia de massa.
00: 40: 49,27 Então, como isso acontece?
00: 40: 51.09 Acontece porque na proteína você tem esse intermediário de longa vida
00: 40: 56.00 com GDP e Pi, sentado no site ativo antes de entrar no produto que também pode
00: 41: 03.10 fazem uma reação reversa para fazer GTP com um oxigênio agora no fosfato gama.
00: 41: 08.15 Agora, se ele reage novamente com água O18, você obtém a incorporação de um segundo O18 no produto.
00: 41: 15,27 E se acontecer de novo, um terceiro e um quarto.
00: 41: 18.16 Portanto, embora a reação geral seja descendente,
00: 41: 22.12 na enzima, você está tendo uma reação inversa.
00: 41: 24.15 E você nunca pode obtê-lo depois que o Pi for lançado
00: 41: 28,21 porque então a energia de ativação para a reação reversa é muito alta.
00: 41: 33.18 Então, resolvemos a estrutura do RapGAP também.
00: 41: 37,06 Esta é uma estrutura de dois domínios onde um domínio, que você vê agora à esquerda,
00: 41: 44.07 é o domínio catalítico - a região azul escura no diagrama de homologia que mostrei
00: 41: 49.01 e o azul claro é o domínio de dimerização que não é importante para a catálise
00: 41: 53.08 mas existe para dimerizar a proteína
00: 41: 56.18 por qualquer motivo que realmente não sabemos.
00: 42: 00.13 Então, ao analisar o domínio catalítico, obviamente, você se pergunta:
00: 42: 03.10 Quais são os resíduos conservados e quais deles desempenham um papel importante na catálise?
00: 42: 08.04 A hélice roxa que indiquei aqui é a região mais altamente conservada.
00: 42: 12.00 Portanto, é provável que os resíduos nesta hélice estejam de alguma forma envolvidos na catálise.
00: 42: 18.05 E, de fato, você pode transformar muitos deles e ver certos efeitos.
00: 42: 21.12 Mas o efeito mais dramático acontece quando você muda
00: 42: 25.01 N290, então uma asparagina, assentada nesta hélice catalítica.
00: 42: 29.08 Quando você modifica isso, obtém o seguinte resultado.
00: 42: 33.00 A propósito, chamamos-lhe Asn-Thumb para fazer a diferença no dedo de arginina.
00: 42: 39.03 Então é um Asn-Thumb e você verá em um minuto porque o chamamos de Asn-Thumb.
00: 42: 44.26 Então, em primeiro lugar, se você olhar agora para a mutação de que falei,
00: 42: 48,27 então se você pegar a mutação N290A e analisar a reação, novamente,
00: 42: 55.09 este ensaio fluorescente de fluxo interrompido, você vê que, embora o tipo selvagem faça um complexo
00: 43: 00.25 e, em seguida, decompõe-se em produto,
00: 43: 02.26 a mutação aqui torna um complexo, isso é ainda, a propósito, mais apertado do que no caso do tipo selvagem,
00: 43: 09.15 mas não há absolutamente nenhuma hidrólise.
00: 43: 11,07 A reação continua indefinidamente. Ele fica lá em cima e nunca desce.
00: 43: 14.21 Considerando que, se você fizer uma mutação como H287 para alanina,
00: 43: 20.22 você vê que não há formação de complexo porque a fluorescência fica aqui embaixo.
00: 43: 24.04 Então essa reação está morta porque não pode ligar
00: 43: 27.08 mas a reação vermelha é boa porque pensamos que este é o resíduo catalítico importante.
00: 43: 32.12 Achamos isso olhando apenas para a bioquímica.
00: 43: 35.15 Obviamente, para saber o que ele faz, precisamos novamente resolver a estrutura,
00: 43: 38,26 que fizemos. Este é o complexo Rap-RapGAP.
00: 43: 43.15 E você vê aqui o vermelho e o verde é RapGAP e o azul é Rap.
00: 43: 49.20 E você vê o GTP. Mas o que você também verá se olhar em detalhes,
00: 43: 54.02 é que há, novamente, algo apontando do domínio catalítico vermelho do RapGAP
00: 43: 59.06 no site ativo e isso é uma asparagina.
00: 44: 01.17 Obviamente, é a asparagina de que falei.
00: 44: 04.20 que cutuca o site ativo do Rap. É por isso que o chamamos de Asn-Thumb
00: 44: 08.28 em relação ao dedo de arginina nos outros sistemas.
00: 44: 12.27 E se você olhar em detalhes o que acontece no site ativo,
00: 44: 17.02 e se você comparar com três outras estruturas da proteína Ras e seus GAPs cognatos,
00: 44: 26.19 tomando Ran e RanGAP, Ras e RasGAP, e Rho e RhoGAP,
00: 44: 31.18 onde Rho e RhoGAP são de Rittinger et al. e as outras estruturas são nossas,
00: 44: 35.14 você vê que as outras três, essas três estruturas aqui,
00: 44: 40.12 tem uma glutamina apontando para a água catalítica,
00: 44: 44.29 que ataca o fosfato gama indicado aqui,
00: 44: 47.09 que é o fluoreto de alumínio,
00: 44: 50.01 um estado de transição que imita o fosfato gama que é transferido.
00: 44: 54.08 E a estrutura vermelha aqui tem, em vez da glutamina 61, tem uma treonina
00: 45: 00.19 que aponta para longe do sítio ativo não tem nada a ver com catálise.
00: 45: 04.01 Em vez disso, o que você vê é que a hélice roxa aqui insere esta asparagina
00: 45: 09.19 no sítio ativo exatamente na posição onde os outros têm a glutamina.
00: 45: 14,23 Então, as diferenças aqui: as três outras estruturas têm uma glutamina, que está em cis
00: 45: 19,29 e Rap e RapGAP têm uma asparagina em trans
00: 45: 23.17 que faz a mesma coisa, a saber, estabilizar a água catalítica.
00: 45: 30.04 E se você olhar para a superfície da proteína,
00: 45: 34.01 esta é a superfície Rap mostrada como uma representação de superfície,
00: 45: 39.07 e adicionada a ela é apenas a hélice do RapGAP.
00: 45: 43.09 Ele fica na superfície e insere esta asparagina no sítio ativo.
00: 45: 48.13 Então, o gama de fosfato sai desse buraco.
00: 45: 50.08 E tudo o que o RapGAP realmente faz é colocar na hélice este Asn, colocá-lo no site ativo,
00: 45: 57.17 e só isso parece ser, pelo menos no sentido químico,
00: 46: 03.03 responsável por estimular a reação da GTPase em 10 ^ 5 vezes
00: 46: 07.10 porque se você transformar essa coisa, ainda se liga bem, mas não há absolutamente nenhuma hidrólise.
00: 46: 11,22 Então, isso nos faz pensar, novamente, no futuro do desenvolvimento de medicamentos anti-Ras.
00: 46: 18.02 Se tudo o que for necessário for inserir tal resíduo no sítio ativo,
00: 46: 22.11 do ponto de vista da química, deve ser factível,
00: 46: 24.24, mas obviamente temos que desenvolver moléculas que se liguem de forma correta
00: 46: 28.12 para a superfície, o que não é tão fácil e ainda estamos pensando que talvez possamos fazer isso.
00: 46: 35.15 Isso é, novamente, voltando a isso.
00: 46: 38.00 Então, como uma abordagem para o alvo de drogas anticâncer,
00: 46: 42.03 vamos encontrar moléculas que induzem a hidrólise do Ras oncogênico.
00: 46: 46.20 E pelo que observamos com RapGAP, pensamos, temos esperança de que pode ser feito.
00: 46: 54.26 E a terceira razão pela qual trabalhar com o sistema Rap-RapGAP é que
00: 47: 03.05 está ligado a uma doença chamada Esclerose Tuberosa, um tumor benigno.
00: 47: 06.19 As pessoas chegam com hamartomas em muitos órgãos.
00: 47: 09.16 Mas a característica mais óbvia e de onde vem o nome é que
00: 47: 14.07 as pessoas têm, quando fazem uma RMN do cérebro, elas têm
00: 47: 16.29 essas coisas escleróticas e tuberosas no cérebro que você vê na RMN do cérebro.
00: 47: 24.17 As pessoas têm mutação em duas proteínas chamadas Tuberin e Hamartin.
00: 47: 30.22 E Tuberin, como eu mostrei antes, tem alta homologia
00: 47: 34.22 para RapGAP nesta região azul escuro, isso significa a região catalítica.
00: 47: 39.07 E se você olhar agora, por exemplo, onde as mutações do paciente na Esclerose Tuberosa,
00: 47: 44.23 em Tuberin, onde estão ocorrendo.
00: 47: 47.00 E este é um alinhamento de diferentes sequências RapGAP e elas se alinham com a sequência de Tuberina.
00: 47: 53.27 Você vê que a região mais altamente conservada é, novamente,
00: 47: 57.09 essa coisa aqui (a coisa vermelha) onde você tem a hélice catalítica.
00: 48: 01.08 E uma das mutações em um paciente com Esclerose Tuberosa
00: 48: 04.22 (e muitos realmente têm essa mutação) está ativado
00: 48: 07.06 esta asparagina que sabemos é o resíduo catalítico importante.
00: 48: 11.08 Portanto, esta é outra versão do que vimos antes
00: 48: 14.21 um importante resíduo catalítico sofre mutação na doença Esclerose Tuberosa.
00: 48: 21,19 Então deixe-me, nos últimos cinco minutos, apenas dar-lhe outra doença,
00: 48: 25.22 apenas para ter certeza de que não é apenas o sistema Ras e Rap,
00: 48: 28.28 que existem muitas doenças em que a incapacidade de hidrolisar GTP leva a muitas doenças diferentes.
00: 48: 35.07 Então, isso é Retinite pigmentosa.
00: 48: 38.28 As pessoas têm pigmentos na retina. É daí que vem o nome.
00: 48: 42.28 E eles perdem a visão, eles perdem a visão periférica.
00: 48: 47.00 Então esta é uma pessoa normal vendo aquele prédio e este é um paciente com a doença
00: 48: 52.15 que vai perdendo cada vez mais, progressivamente, a visão periférica.
00: 48: 56.00 E então perde a visão completa depois que a doença se desenvolve totalmente.
00: 49: 01.19 E há uma série de genes mutados na retinite pigmentosa
00: 49: 06.12 que são chamados de RP12x e outros.
00: 49: 09,28 E há uma forma chamada RP2.
00: 49: 13.03 É uma doença ligada ao X em que as pessoas têm mutações em. Muitas mutações pontuais numa proteína.
00: 49: 21.16 Determinamos a estrutura da proteína, que se parece com isso.
00: 49: 24,24 Este é um domínio de hélice beta e este é outro domínio.
00: 49: 27.20 E você vê muitas das mutações que então analisa.
00: 49: 31.06 Você descobre que o que você vê é que a maioria das mutações
00: 49: 37.16 determinar ou bagunçar, provavelmente, a estrutura porque eles estão dentro
00: 49: 41.24 o núcleo hidrofóbico da proteína e você pode imaginar que
00: 49: 45.04 eles não fazem nada para a catálise ou a interação desta proteína.
00: 49: 50.19 Mas existem algumas mutações, indicadas aqui, por exemplo,
00: 49: 54,01 E138G ou R118 para H, K ou C. Portanto, esses resíduos apontam para a solução.
00: 50: 03.27 Então você pensaria que eles fazem algo importante para a interação da proteína
00: 50: 08.20 ou em algo - que eles estão envolvidos no que essas proteínas estão fazendo normalmente.
00: 50: 14.20 Assim, resolvemos, novamente, a estrutura do complexo entre Arl3.
00: 50: 19.13 Portanto, sabíamos que RP2 interage com Arl3, outra proteína semelhante a Ras.
00: 50: 24.26 Chama-se Arl porque é uma proteína relacionada com Arf.
00: 50: 28.04 E resolvemos a estrutura disso. Então você vê que esse material aqui seria o RP2 em roxo.
00: 50: 37.25 E você vê em verde seria Arl3 em um formulário vinculado a GTP.
00: 50: 41.25 E o que você vê então, se você, novamente, olhar bem de perto,
00: 50: 44.26 você vê que há um resíduo de RP2, bem aqui, que aponta para o sítio ativo do Arl.
00: 50: 52.10 Então não se sabia o que RP2 estava fazendo, mas quando resolvemos a estrutura,
00: 50: 55.17 pudemos ver imediatamente que cheira a GAP porque
00: 50: 59.18 ele coloca um dedo de arginina no sítio ativo da outra proteína.
00: 51: 05.08 E se você olhar o site ativo em detalhes, verá que seria o PIB, de novo,
00: 51: 10.28 isto é fluoreto de alumínio, isto é glutamina de Arl3,
00: 51: 15,14 e estes são três resíduos de RP2 - Q116, R118, E138.
00: 51: 21.26 E, obviamente, todos esses resíduos são mutados na retinite pigmentosa.
00: 51: 27.15 E você pode ver que a arginina está fazendo a mesma coisa que você já viu muitas vezes antes.
00: 51: 32.22 E é estabilizado por esses outros resíduos e todos os três resíduos, quando mutado,
00: 51: 38,10 atrapalham a atividade GAP de RP2.
00: 51: 41.26 Então, aqui, a estrutura realmente nos disse o que a proteína está fazendo.
00: 51: 44.19 Não havia ideia sobre a função e a estrutura nos dizia, exatamente, que este é um GAP para Arl3.
00: 51: 53.17 Deixe-me agora tirar as conclusões do que tenho falado.
00: 52: 00.12 Em primeiro lugar, talvez, conclusões sobre o próprio Ras porque é o oncogene mais importante.
00: 52: 06.14 É uma enzima incompleta, não pode hidrolisar o GTP muito rápido.
00: 52: 11.09 Mas então vem o RasGAP que estabiliza o switch II e a glutamina 61,
00: 52: 16.10 que é o elemento catalítico estrutural importante e também fornece um dedo de arginina para o sítio ativo.
00: 52: 23.04 Você tem mutação Gln1 - qualquer mutação da glutamina 61 é um oncogene
00: 52: 28.29 porque falta, então, o resíduo catalítico (o sistema).
00: 52: 33.00 Você tem mutantes de glicina que estão estericamente comprometidos para fazer a hidrólise de GTP.
00: 52: 38.21 Não há como o dedo de arginina
00: 52: 42.06 pode ir para a posição adequada quando há uma mutação da glicina 12.
00: 52: 46.04 Também mostrei que existe um intermediário PIB-Pi fortemente ligado.
00: 52: 50.02 E a liberação de Pi no sistema torna-se limitante da taxa.
00: 52: 54.28 Enquanto sem GAP, a reação de clivagem química é a etapa limitadora da taxa.
00: 53: 00.23 A segunda conclusão - mais geral para a superfamília Ras.
00: 53: 05.01 As proteínas Ras são todas enzimas incompletas.
00: 53: 07.20 Todos eles hidrolisam o GTP muito, muito lentamente.
00: 53: 09,27 Eles têm GAPs cognatos.
00: 53: 12.02 Então, cada uma das proteínas da subfamília e às vezes até proteínas dentro da subfamília,
00: 53: 16.24 têm um GAP cognato específico que é necessário para a hidrólise rápida de GTP, para a catálise.
00: 53: 22.17 Alguns GAPs fornecem um dedo de arginina
00: 53: 25.02 e eu mostrei a vocês agora muitos exemplos diferentes - Ras e Ran e Rho.
00: 53: 30.15 RabGAPs entregam um agrinine e um Gln.
00: 53: 34.23 Alguns GAPs fornecem um polegar Asn.
00: 53: 37.00 Mostrei o exemplo do RapGAP e o Tuberin provavelmente faz a mesma coisa.
00: 53: 41.03 A liberação de Pi é muitas vezes limitadora de taxa.
00: 53: 44.10 E o que é ainda mais importante, e esta é a minha mensagem para toda a palestra,
00: 53: 47.19 é que a reação da GTPase perturbada está envolvida em uma série de doenças:
00: 53: 53.24 câncer, neurofibromatose, esclerose tuberosa,
00: 53: 58.03 retinite pigmentosa e muitas outras que não falei.
00: 54: 01.07 Obrigado pela atenção. Mas eu faria.
00: 54: 03.00 Antes de parar, gostaria de agradecer às pessoas que fizeram o trabalho.
00: 54: 07.18 A história mais antiga que lhes contei é a do Ras e do RasGAP,
00: 54: 11.22 que foi feito por três pós-doutores no laboratório, Reza Ahmadian, Klaus Scheffzek e Robert Mittal.
00: 54: 17.23 A história do RapGAP foi feita pelos alunos Oli Daumke, Astrid Kramer,
00: 54: 23.14 Partha Chakrabarti e Andrea Scrima.
00: 54: 26.18 E a história do RP2 foi feita por Stefan Veltel e Karin Kuhnel.
00: 54: 32.04 E muitos dos filmes que tenho mostrado a vocês são feitos por Ingrid Vetter
00: 54: 36.20 que também dirige meu laboratório de cristalografia.
00: 54: 38.15 E ela foi muito, muito útil em quase todos os projetos.
00: 54: 42.13 E nós temos. no FTIR, temos colaborações com
00: 54: 46.03 nossos colegas da Universidade de Bochum que é Klaus Gerwert e Carsten Kotting.
00: 54: 51,03 Obrigado pela sua atenção.
00:54:52.10


Sobre o papel dos íons magnésio na estabilidade do RNA

Os cátions divalentes, como o magnésio, são cruciais para a integridade estrutural e a atividade biológica do RNA. Neste artigo, apresentamos uma imagem de como o magnésio estabiliza uma forma dobrada particular de RNA. A estabilização geral do RNA pelo Mg 2+ é dada pela energia livre de transferência do RNA de uma solução de sal univalente de referência para uma solução de sal misto. Este termo tem contribuições energéticas favoráveis ​​de dois modos distintos de ligação: ligação difusa e ligação local. Na ligação difusa, os íons de Mg totalmente hidratados interagem com o RNA por meio de interações eletrostáticas inespecíficas de longo alcance. Na ligação local, o Mg 2+ desidratado interage com ligantes aniônicos especificamente arranjados pela dobra do RNA para atuar como ligantes de coordenação para o íon metálico. Cada um desses modos tem uma forte contribuição coulômbica para a ligação, no entanto, a ligação no local também é caracterizada por mudanças substanciais na solvatação de íons e outras contribuições não eletrostáticas. Mostraremos como essas diferenças energéticas podem ser exploradas para distinguir experimentalmente entre essas duas classes de íons usando análises de polinômios de ligação. Nós pesquisamos uma série de sistemas específicos nos quais as interações Mg 2+ –RNA foram estudadas. Em sistemas bem caracterizados, como certos tRNAs e alguns fragmentos de rRNA, esses estudos mostram que os íons ligados ao local podem desempenhar um papel importante na estabilidade do RNA. No entanto, o papel crucial dos íons com limites difusos também é evidente. Enfatizamos que a ligação difusa só pode ser descrita rigorosamente por um modelo que leva em conta as forças eletrostáticas de longo alcance. Para compreender totalmente o papel dos íons de magnésio na estabilidade do RNA, modelos teóricos que descrevem as forças eletrostáticas em sistemas com estruturas complicadas devem ser desenvolvidos. © 1999 John Wiley & Sons, Inc. Biopoly 48: 113–135, 1998


Biologia 171

Ao final desta seção, você será capaz de fazer o seguinte:

  • Descreva o papel das enzimas nas vias metabólicas
  • Explique como as enzimas funcionam como catalisadores moleculares
  • Discuta a regulação da enzima por vários fatores

Uma substância que ajuda a ocorrer uma reação química é um catalisador, e as moléculas especiais que catalisam as reações bioquímicas são as enzimas. Quase todas as enzimas são proteínas, compostas por cadeias de aminoácidos, e desempenham a tarefa crítica de reduzir as energias de ativação de reações químicas dentro da célula. As enzimas fazem isso ligando-se às moléculas do reagente e prendendo-as de forma a fazer com que os processos de quebra e formação de ligações químicas ocorram mais prontamente. É importante lembrar que as enzimas não alteram a reação & # 8217s ∆G. Em outras palavras, eles não mudam se uma reação é exergônica (espontânea) ou endergônica. Isso ocorre porque eles não alteram a energia livre dos reagentes & # 8217 ou produtos & # 8217. Eles apenas reduzem a energia de ativação necessária para atingir o estado de transição ((Figura)).


Local ativo da enzima e especificidade do substrato

Os reagentes químicos aos quais uma enzima se liga são os substratos da enzima. Pode haver um ou mais substratos, dependendo da reação química particular. Em algumas reações, um substrato de reagente único se divide em vários produtos. Em outros, dois substratos podem se unir para criar uma molécula maior. Dois reagentes também podem entrar em uma reação, ambos se modificam e saem da reação como dois produtos. O local dentro da enzima onde o substrato se liga é o sítio ativo da enzima. É aqui que a “ação” acontece. Uma vez que as enzimas são proteínas, existe uma combinação única de resíduos de aminoácidos (também cadeias laterais, ou grupos R) dentro do sítio ativo. Propriedades diferentes caracterizam cada resíduo. Estes podem ser grandes ou pequenos, fracamente ácidos ou básicos, hidrofílicos ou hidrofóbicos, carregados positiva ou negativamente ou neutros. A combinação única de resíduos de aminoácidos, suas posições, sequências, estruturas e propriedades, cria um ambiente químico muito específico dentro do sítio ativo. Este ambiente específico é adequado para se ligar, embora brevemente, a um substrato químico específico (ou substratos). Devido a essa combinação semelhante a um quebra-cabeça entre uma enzima e seus substratos (que se adapta para encontrar o melhor ajuste entre o estado de transição e o sítio ativo), as enzimas são conhecidas por sua especificidade. O "melhor ajuste" resulta da forma e da atração do grupo funcional de aminoácidos para o substrato. Há uma enzima especificamente combinada para cada substrato e, portanto, para cada reação química, no entanto, também há flexibilidade.

O fato de os locais ativos serem perfeitamente adequados para fornecer condições ambientais específicas também significa que estão sujeitos às influências ambientais locais. É verdade que o aumento da temperatura ambiente geralmente aumenta as taxas de reação, catalisadas por enzimas ou não. No entanto, aumentar ou diminuir a temperatura fora de uma faixa ótima pode afetar as ligações químicas dentro do sítio ativo de tal forma que elas são menos adequadas para ligar substratos. As altas temperaturas eventualmente farão com que as enzimas, como outras moléculas biológicas, se desnaturem, um processo que altera as propriedades naturais da substância. Da mesma forma, o pH do ambiente local e # 8217s também pode afetar a função enzimática. Os resíduos de aminoácidos do local ativo têm suas próprias propriedades ácidas ou básicas que são ideais para a catálise.Esses resíduos são sensíveis a mudanças no pH que podem prejudicar a forma como as moléculas do substrato se ligam. As enzimas são adequadas para funcionar melhor dentro de uma determinada faixa de pH e, como ocorre com a temperatura, valores extremos de pH ambientais (ácidos ou básicos) podem causar a desnaturação das enzimas.

Ajuste induzido e função enzimática

Por muitos anos, os cientistas pensaram que a ligação enzima-substrato ocorria de uma forma simples de “chave e fechadura”. Este modelo afirmava que a enzima e o substrato se encaixavam perfeitamente em uma etapa instantânea. No entanto, a pesquisa atual apóia uma visão mais refinada que os cientistas chamam de ajuste induzido ((Figura)). Este modelo expande o modelo de chave e fechadura, descrevendo uma interação mais dinâmica entre a enzima e o substrato. À medida que a enzima e o substrato se unem, sua interação causa uma leve mudança na estrutura da enzima que confirma um arranjo de ligação ideal entre a enzima e o estado de transição do substrato & # 8217s. Esta ligação ideal maximiza a capacidade da enzima de catalisar sua reação.

Quando uma enzima se liga ao seu substrato, ela forma um complexo enzima-substrato. Este complexo reduz a energia de ativação da reação e promove sua rápida progressão de várias maneiras. Em um nível básico, as enzimas promovem reações químicas que envolvem mais de um substrato, trazendo os substratos juntos em uma orientação ideal. A região apropriada (átomos e ligações) de uma molécula é justaposta à região apropriada da outra molécula com a qual ela deve reagir. Outra maneira pela qual as enzimas promovem a reação do substrato é criando um ambiente ideal dentro do sítio ativo para que a reação ocorra. Certas reações químicas podem ocorrer melhor em um ambiente ligeiramente ácido ou apolar. As propriedades químicas que emergem do arranjo particular de resíduos de aminoácidos dentro de um sítio ativo criam o ambiente perfeito para os substratos específicos de uma enzima reagirem.

Você aprendeu que a energia de ativação necessária para muitas reações inclui a energia envolvida na manipulação ou ligeira contorção das ligações químicas para que possam se quebrar facilmente e permitir que outras se reformem. A ação enzimática pode ajudar neste processo. O complexo enzima-substrato pode diminuir a energia de ativação contorcendo as moléculas do substrato de forma a facilitar a quebra da ligação, ajudando a atingir o estado de transição. Finalmente, as enzimas também podem reduzir as energias de ativação, participando da própria reação química. Os resíduos de aminoácidos podem fornecer certos íons ou grupos químicos que realmente formam ligações covalentes com moléculas de substrato como uma etapa necessária do processo de reação. Nesses casos, é importante lembrar que a enzima sempre retornará ao seu estado original na conclusão da reação. Uma das propriedades marcantes das enzimas é que elas permanecem inalteradas pelas reações que catalisam. Depois que uma enzima catalisa uma reação, ela libera seu (s) produto (s).


Controle do metabolismo através da regulação enzimática

Pareceria ideal ter um cenário em que todas as enzimas codificadas no genoma de um organismo existissem em abundância e funcionassem de maneira ideal em todas as condições celulares, em todas as células, em todos os momentos. Na realidade, isso está longe de ser o caso. Vários mecanismos garantem que isso não aconteça. As necessidades e condições celulares variam de célula para célula e mudam dentro das células individuais ao longo do tempo. As enzimas necessárias e as demandas energéticas das células do estômago são diferentes daquelas das células de armazenamento de gordura, da pele, do sangue e das células nervosas. Além disso, uma célula digestiva trabalha muito mais para processar e quebrar os nutrientes durante o período que se segue a uma refeição, em comparação com muitas horas após uma refeição. Como essas demandas e condições celulares variam, também variam as quantidades e a funcionalidade de diferentes enzimas.

Uma vez que as taxas das reações bioquímicas são controladas pela energia de ativação, e as enzimas diminuem e determinam as energias de ativação para as reações químicas, as quantidades relativas e o funcionamento da variedade de enzimas dentro de uma célula determinam, em última instância, quais reações ocorrerão e em quais taxas. Essa determinação é rigidamente controlada. Em certos ambientes celulares, fatores ambientais como pH e temperatura controlam parcialmente a atividade enzimática. Existem outros mecanismos pelos quais as células controlam a atividade enzimática e determinam as taxas nas quais várias reações bioquímicas ocorrerão.

Regulação molecular de enzimas

As enzimas podem ser reguladas de forma a promover ou reduzir sua atividade. Existem muitos tipos diferentes de moléculas que inibem ou promovem a função enzimática e existem vários mecanismos para isso. Por exemplo, em alguns casos de inibição enzimática, uma molécula inibidora é semelhante o suficiente a um substrato que pode se ligar ao sítio ativo e simplesmente bloquear a ligação do substrato. Quando isso acontece, a enzima é inibida por meio de inibição competitiva, pois uma molécula inibidora compete com o substrato pela ligação do sítio ativo ((Figura)). Alternativamente, na inibição não competitiva, uma molécula inibidora se liga à enzima em um local diferente de um local alostérico, um local de ligação distante do local ativo, e ainda consegue bloquear a ligação do substrato ao local ativo.


Algumas moléculas de inibidor se ligam a enzimas em um local onde sua ligação induz uma mudança conformacional que reduz a afinidade da enzima por seu substrato. Este tipo de inibição é uma inibição alostérica ((Figura)). Mais de um polipeptídeo compreende a maioria das enzimas reguladas alostericamente, o que significa que elas têm mais de uma subunidade de proteína. Quando um inibidor alostérico se liga a uma enzima, todos os locais ativos nas subunidades da proteína mudam ligeiramente, de modo que se ligam a seus substratos com menos eficiência. Existem tanto ativadores alostéricos quanto inibidores. Os ativadores alostéricos se ligam a locais em uma enzima longe do sítio ativo, induzindo uma mudança conformacional que aumenta a afinidade do (s) sítio (s) ativo (s) da enzima para seu (s) substrato (s).



Descoberta de drogas procurando inibidores de enzimas-chave em vias específicas As enzimas são componentes-chave das vias metabólicas. Compreender como as enzimas funcionam e como podem ser reguladas é um princípio fundamental por trás do desenvolvimento de muitos medicamentos ((Figura)) no mercado hoje. Os biólogos que trabalham neste campo colaboram com outros cientistas, geralmente químicos, para projetar drogas.

Considere as estatinas, por exemplo - que é uma classe de medicamentos que reduz os níveis de colesterol. Estes compostos são essencialmente inibidores da enzima HMG-CoA redutase. A HMG-CoA redutase é a enzima que sintetiza o colesterol a partir dos lipídios do corpo. Ao inibir essa enzima, a droga reduz os níveis de colesterol sintetizado no corpo. Da mesma forma, o paracetamol, popularmente comercializado sob a marca Tylenol, é um inibidor da enzima ciclooxigenase. Embora seja eficaz no alívio da febre e da inflamação (dor), os cientistas ainda não entendem completamente seu mecanismo de ação.

Como as drogas são desenvolvidas? Um dos primeiros desafios no desenvolvimento de drogas é identificar a molécula específica que a droga se destina a atingir. No caso das estatinas, a HMG-CoA redutase é o alvo da droga. Os pesquisadores identificam os alvos por meio de pesquisas meticulosas em laboratório. Identificar o alvo sozinho não é suficiente. Os cientistas também precisam saber como o alvo age dentro da célula e quais reações dão errado no caso de doença. Depois que os pesquisadores identificam o alvo e a via, o processo real de criação de medicamentos começa. Durante esse estágio, químicos e biólogos trabalham juntos para projetar e sintetizar moléculas que podem bloquear ou ativar uma reação específica. No entanto, este é apenas o começo: se e quando um protótipo de droga for bem-sucedido no desempenho de sua função, ele deve passar por muitos testes de em vitro experimentos para ensaios clínicos antes de obter a aprovação do FDA para estar no mercado.

Muitas enzimas não funcionam de maneira ideal, ou mesmo de forma alguma, a menos que estejam ligadas a outras moléculas auxiliares não proteicas específicas, seja temporariamente por meio de ligações iônicas ou de hidrogênio ou permanentemente por meio de ligações covalentes mais fortes. Dois tipos de moléculas auxiliares são cofatores e coenzimas. A ligação a essas moléculas promove uma conformação e função ideais para suas respectivas enzimas. Os cofatores são íons inorgânicos como o ferro (Fe ++) e o magnésio (Mg ++). Um exemplo de uma enzima que requer um íon metálico como cofator é a enzima que constrói moléculas de DNA, a DNA polimerase, que requer um íon zinco ligado (Zn ++) para funcionar. As coenzimas são moléculas auxiliares orgânicas, com uma estrutura atômica básica composta de carbono e hidrogênio, necessárias para a ação enzimática. As fontes mais comuns de coenzimas são as vitaminas dietéticas ((Figura)). Algumas vitaminas são precursoras das coenzimas e outras atuam diretamente como coenzimas. A vitamina C é uma coenzima para várias enzimas que participam da construção de um importante componente do tecido conjuntivo, o colágeno. Um passo importante para quebrar a glicose para produzir energia é a catálise por um complexo multi-enzima que os cientistas chamam de piruvato desidrogenase. A piruvato desidrogenase é um complexo de várias enzimas que, na verdade, requer um cofator (um íon de magnésio) e cinco coenzimas orgânicas diferentes para catalisar sua reação química específica. Portanto, a função enzimática é, em parte, regulada por uma abundância de vários cofatores e coenzimas, que as dietas da maioria dos organismos fornecem.


Compartimentação de enzimas

Em células eucarióticas, moléculas como enzimas são geralmente compartimentadas em diferentes organelas. Isso permite ainda outro nível de regulação da atividade enzimática. As enzimas necessárias apenas para certos processos celulares às vezes são alojadas separadamente junto com seus substratos, permitindo reações químicas mais eficientes. Exemplos desse tipo de regulação enzimática com base na localização e proximidade incluem as enzimas envolvidas nos últimos estágios da respiração celular, que ocorrem exclusivamente na mitocôndria, e as enzimas envolvidas na digestão de detritos celulares e materiais estranhos, localizados dentro dos lisossomas.

Inibição de feedback nas vias metabólicas

As moléculas podem regular a função enzimática de várias maneiras. No entanto, uma questão importante permanece: o que são essas moléculas e de onde elas vêm? Alguns são cofatores e coenzimas, íons e moléculas orgânicas, como você aprendeu. Quais outras moléculas na célula fornecem regulação enzimática, como modulação alostérica e inibição competitiva e não competitiva? A resposta é que uma grande variedade de moléculas pode desempenhar essas funções. Alguns incluem drogas farmacêuticas e não farmacêuticas, toxinas e venenos do meio ambiente. Talvez as fontes mais relevantes de moléculas reguladoras de enzimas, no que diz respeito ao metabolismo celular, sejam os próprios produtos da reação metabólica celular. De uma forma mais eficiente e elegante, as células evoluíram para usar suas próprias reações e produtos # 8217 para inibição de feedback da atividade enzimática. A inibição por feedback envolve o uso de um produto de reação para regular sua própria produção posterior ((Figura)). A célula responde à abundância de produtos específicos diminuindo a produção durante as reações anabólicas ou catabólicas. Esses produtos de reação podem inibir as enzimas que catalisaram sua produção por meio dos mecanismos que descrevemos acima.


A produção de aminoácidos e nucleotídeos é controlada por meio da inibição por feedback. Além disso, o ATP é um regulador alostérico de algumas das enzimas envolvidas na degradação catabólica do açúcar, o processo que produz o ATP. Dessa forma, quando o ATP é abundante, a célula pode impedir sua futura produção. Lembre-se de que o ATP é uma molécula instável que pode se dissociar espontaneamente em ADP. Se muito ATP estivesse presente em uma célula, grande parte seria desperdiçada. Alternativamente, o ADP atua como um regulador alostérico positivo (um ativador alostérico) para algumas das mesmas enzimas que o ATP inibe. Assim, quando os níveis relativos de ATP são altos em comparação com o ATP, a célula é acionada para produzir mais ATP através do catabolismo do açúcar.

Resumo da Seção

As enzimas são catalisadores químicos que aceleram as reações químicas em temperaturas fisiológicas, diminuindo sua energia de ativação. As enzimas são geralmente proteínas que consistem em uma ou mais cadeias polipeptídicas. As enzimas têm um sítio ativo que fornece um ambiente químico único, composto por certos grupos de aminoácidos R (resíduos). Este ambiente único é perfeitamente adequado para converter reagentes químicos específicos para aquela enzima, os cientistas chamam de substratos, em intermediários instáveis ​​que eles chamam de estados de transição. Enzimas e substratos se ligam com um ajuste induzido, o que significa que as enzimas sofrem pequenos ajustes conformacionais após o contato do substrato, levando a uma ligação total e ideal. As enzimas se ligam a substratos e catalisam reações de quatro maneiras diferentes: juntando substratos em uma orientação ideal, comprometendo as estruturas de ligação dos substratos para que as ligações possam se quebrar mais facilmente, fornecendo condições ambientais ideais para que uma reação ocorra ou participando diretamente de sua reação química através da formação de ligações covalentes transitórias com os substratos.

A ação da enzima deve ser regulada de modo que em uma determinada célula em um determinado momento, as reações desejadas sejam catalisadas e as indesejadas não. As enzimas são reguladas por condições celulares, como temperatura e pH. Eles também são regulados por meio de sua localização dentro de uma célula, às vezes compartimentada de modo que só podem catalisar reações em certas circunstâncias. A inibição e ativação de enzimas por meio de outras moléculas são outras formas importantes pelas quais as enzimas são reguladas. Os inibidores podem agir de forma competitiva, não competitiva ou alostericamente. Os inibidores não competitivos são geralmente alostéricos. Os ativadores também podem aumentar a função enzimática alostericamente. O método mais comum pelo qual as células regulam as enzimas nas vias metabólicas é por meio da inibição por feedback. Durante a inibição por feedback, os produtos da via metabólica atuam como inibidores (geralmente alostéricos) de uma ou mais enzimas (geralmente a primeira enzima comprometida da via) envolvida na via que os produz.

Resposta livre

No que diz respeito às enzimas, por que as vitaminas são necessárias para uma boa saúde? Dar exemplos.

A maioria das vitaminas e minerais atuam como coenzimas e cofatores para a ação enzimática. Muitas enzimas requerem a ligação de certos cofatores ou coenzimas para serem capazes de catalisar suas reações. Visto que as enzimas catalisam muitas reações importantes, é fundamental obter vitaminas e minerais suficientes da dieta e dos suplementos. A vitamina C (ácido ascórbico) é uma coenzima necessária para a ação das enzimas que constroem o colágeno, um importante componente proteico do tecido conjuntivo de todo o corpo. O íon magnésio (Mg ++) é um importante cofator necessário para que a enzima piruvato desidrogenase catalise parte da via que quebra o açúcar para produzir energia. As vitaminas não podem ser produzidas no corpo humano e, portanto, devem ser obtidas na dieta.

Explique em suas próprias palavras como a inibição de feedback enzimático beneficia uma célula.

A inibição por feedback permite que as células controlem a quantidade de produtos metabólicos produzidos. Se houver muito de um produto específico em relação às necessidades da célula, a inibição de feedback efetivamente faz com que a célula diminua a produção desse produto específico. Em geral, isso reduz a produção de produtos supérfluos e conserva energia, maximizando a eficiência energética.

Glossário


MgCl2 (e EDTA) em buffers - (19 / abr / 2012)

Estou tentando otimizar um buffer para um ensaio de proteína. No tampão original está Tris, glicerol, DTT, NaCl, EDTA e MgCl2.
Estou me perguntando qual é a função do MgCl2 no meu buffer? Li em algum lugar que ajuda as interações proteína-proteína, mas não há muito o que descobrir sobre isso.
Forma um complexo com o EDTA? e em caso afirmativo, qual seria o propósito disso no meu buffer de proteína?
Outra coisa a mencionar é que minhas proteínas têm uma etiqueta His. O EDTA teria algum efeito sobre isso?

Espero que você possa ajudar, obrigado & # 33

Ei, eu estava realmente me perguntando isso, pois tenho a mesma coisa, embora minha concentração de MgCl2 seja extremamente baixa.
Além disso, apenas no caso, se você estiver fazendo um ensaio de proteína, como Lowry, o EDTA no tampão irá interferir no resultado & # 33 & # 33 Você terá que fazer uma etapa de precipitação com TCA e ressuspender em água ou algo para obter livrar-se do EDTA.
Tenho certeza que você sabe disso, mas fui pego e demorei um pouco para descobrir & # 33 & # 33 & # 33

É um ensaio baseado em proteína fluorescente (FRET), então é um pouco diferente para mim, alguns componentes têm um efeito prejudicial no meu sinal de fluorescência como o NaCl, mas isso é devido à natureza da minha interação proteína-proteína. No entanto, não consegui descobrir qual função teria o MgCl2 além de ser outro sal no meu buffer.

Ter ambos em um único buffer faz pouco sentido. O EDTA remove os íons de magnésio, o MgCl2 os adiciona. Você pode querer tomar cuidado com o uso de um tampão contendo EDTA com proteínas marcadas com His. O EDTA irá quelar o cobalto ou níquel na coluna usada para a ligação da etiqueta His.

devido às constantes de dissociação, edta-mg permitirá um vestígio de mg livre na solução. você está, em essência, protegendo o íon metálico.

Bom ponto. Mas eu pensei que as constantes eram tais que muito pouco Mg ++ livre estaria presente.

Se houver cálcio na mistura da amostra, isso formará preferencialmente um complexo de EDTA-Ca liberando o Mg e liberando os íons de Mg ++ previamente ligados na solução.
Além disso, o EDTA quelata o Mg na proporção molar de 1: 1, de modo que só vai limpar todo o Mg livre (até onde a constante de dissociação permitir) se houver pelo menos a mesma quantidade molar nele.

Obrigado a todos por sua contribuição. No entanto, ainda não tenho certeza do que o MgCl2 faria às minhas proteínas (fundidas por fluorescência). Alguém sabe disso?

e Phage424, não uso EDTA no meu buffer de purificação, então tudo bem. O EDTA teria algum efeito adicional no meu tampão aqui aceito para atuar como agente antimicrobiano?

Para saber se o MgCl2 tem ou não algum efeito sobre a sua proteína, você deve fazer FRET sob baixo e alto MgCl2 e ver se você vê uma diferença na sinalização. Temos MgCl2 em nossos buffers e não tem nenhum efeito prejudicial. Usamos MgCl2 para simular as interações iônicas que podem ocorrer. EDTA não é um agente antimicrobiano

Ei, oi .. Você pode apenas deixar-me saber o papel do MgCl2 nos buffers durante a purificação da proteína? Por que isso é essencial?


Por que EDTA na tripsina? - (24 / out / 2006)

Oi
O EDTA tem o mesmo efeito que a tripsina, ou seja, podemos separar as células usando apenas o EDTA e é muito mais suave nas células do que a tripsina, então acho que é adicionado à tripsina para aumentar seu efeito e li também que pode diminuir o clumbing das células.
espero esta ajuda.

Na verdade, a tripsina / EDTA é um método combinado para a separação de células. A tripsina corta as proteínas de adesão nas interações célula-célula e célula-matriz (não me lembro do local específico), e o EDTA é um quelante de cálcio, que as integrinas precisam interagir com outras proteínas para a adesão celular - sem cálcio, sem célula adesão. E é por isso que o tratamento com EDTA é mais suave do que a tripsina.

O meio de cultura de tecido contém íons cálcio e magnésio, o soro fetal de bezerro contém proteínas que são inibidoras da tripsina. Ambos Mg2 + / Ca2 + INIBEM TRIPPSINA. A razão pela qual usamos PBS sem Ca2 + / Mg2 + para lavar as células antes da tripsinização é para reduzir a concentração de cátions divalentes e proteínas que inibem a ação da tripsina. EDTA é um quelante de cálcio que irá "limpar" os cátions divalentes restantes. Se a tripsina permanecer em contato com as células por muito tempo, a viabilidade celular será reduzida.
Este deve ser o primeiro princípio da cultura de células que você aprende no primeiro dia. Existem apenas muito poucas células que se destacam apenas com o tratamento com EDTA.

para EDTA:
Lembro-me que quando trabalhamos com cultura de tecidos vegetais, usamos EDTA como agente quelante para manter o Mg e outros elementos em suspensão para que o tecido vegetal pudesse absorvê-los facilmente.

concordo com a explicação do losango e # 39

O meio de cultura de tecido contém íons cálcio e magnésio, o soro fetal de bezerro contém proteínas que são inibidoras da tripsina. Ambos Mg2 + / Ca2 + INIBEM TRIPPSINA. A razão pela qual usamos PBS sem Ca2 + / Mg2 + para lavar as células antes da tripsinização é para reduzir a concentração de cátions divalentes e proteínas que inibem a ação da tripsina. EDTA é um quelante de cálcio que irá "limpar" os cátions divalentes restantes. Se a tripsina permanecer em contato com as células por muito tempo, a viabilidade celular será reduzida.
Este deve ser o primeiro princípio da cultura de células que você aprende no primeiro dia. Existem apenas muito poucas células que se destacam apenas com o tratamento com EDTA.

woooow
thankx um milhão de losangos e, a propósito, acho que hoje em dia ninguém ensina como antes, estou falando sobre o meu caso como me disseram para fazer o protocolo, que obtive da busca na rede, e estou procurando por mim mesmo todas as respostas na net e aqui no fórum.
muito obrigado novamente.

editei minha postagem para dar uma sugestão ao Rhombus, se você tiver tempo, pode iniciar um tópico sobre perguntas e respostas sobre cultura de células?

Devo dizer que esse é um lugar muito comum hoje em dia. Os protocolos são transmitidos e os primeiros princípios às vezes são esquecidos. Eu ensino cultura de células e tecidos a todos os funcionários do departamento da minha universidade que desejam aprender com os primeiros princípios. 9 em cada 10 vezes, o pessoal em questão teve alguma descrição de "treino", mas a sua ignorância é sempre aparente. Eles invariavelmente vêm me pedir ajuda depois de terem problemas em seus laboratórios específicos. Por exemplo :-

& quot Acho que é um problema com minhas células, elas não estão crescendo muito rápido & quot

& quot Acho que a sala de cultura de tecidos está contaminada de alguma forma, minhas células estão contaminadas & quot

& quot Não sei o que há de errado, mas minha mídia tem uma cor engraçada & quot

Todos os itens acima são facilmente resolvidos, mas são eventos regulares na maioria dos laboratórios. Aprendi na década de 1970 & # 39 como fazer cultura de células na bancada com um bico de Bunsen, sem filtros HEPA e todos os frascos e pipetas de cultura de vidro reutilizáveis. É apenas bom senso.

sim, o básico geralmente é ignorado.

Um pouco fora do assunto talvez (concordo totalmente com Rhombus sobre a função de fato do EDTA e da tripsina), mas a maioria das pessoas hoje em dia não é treinada demais.

As pessoas simplesmente compram kits e soluções de buffer sem pensar no que eles contêm e no que eles fazem. Está piorando, porque as empresas estão tornando-o "mais fácil" com a venda de misturas prontas para usar (por exemplo, para um PCR, você só precisa adicionar seus primers e modelo e está pronto para ir, é um início automático automatizado e tudo , então você dificilmente precisa saber o que está fazendo e o que está em seus tubos para fazer um PCR bem-sucedido).
As pessoas dificilmente sabem como trabalhar com esterilização, não sabem medir o pH corretamente. Torna muito mais difícil se você precisar solucionar qualquer tipo de reação ou processo.

Uma aluna de doutorado que trabalha aqui está trabalhando bastante com DNA e ela nem sabia o que era a proporção A260 / 280 e por que ela era importante.

Então, todos: se você está ensinando técnicas a alguém (sejam elas quais forem), tente explicar tudo o que há para saber sobre a técnica, não importa que técnica seja "fácil" para você (e executante experiente).

Isso não é para ofender ninguém, se você não foi ensinado nada, você faz a coisa certa ao fazer perguntas e eu exorto todos a tentarem encontrar algumas respostas & quot pesquisando & quotá-las, mas se necessário, venha e pergunte aqui.

Concordo com Rhombus e vairus que muitos alunos e técnicos não conhecem a teoria subjacente aos experimentos.

Tudo bem, se eles obtiverem os resultados esperados. No entanto, quando se trata de solucionar problemas, eles não sabem o que fazer e podem esperar que seus mentores / supervisores resolvam.

Atualmente sou um estudante de doutorado do segundo ano, meu PI espera resultados e não se importa se eu entendo a teoria. ele se opôs à leitura.


Efeito do magnésio no metabolismo do fósforo e do cálcio

O magnésio é um elemento que ocorre de forma onipresente na natureza. O metabolismo do magnésio e do cálcio estão intimamente relacionados. A absorção intestinal e a excreção renal dos dois íons são interdependentes. A relação entre o metabolismo do fósforo e do magnésio é mais difícil de demonstrar. As causas mais frequentes de hipomagnesemia em crianças são ingestão reduzida, absorção intestinal prejudicada, perda renal e doenças genéticas. A hipomagnesemia se reflete clinicamente no sistema nervoso, ocorrendo alterações neurofisiológicas e metabólicas. A hipomagnesemia grave induz hipocalcemia secundária na maioria dos animais experimentais, exceto ratos. Além disso, a hipomagnesemia grave induz hipoparatireoidismo funcional. Estudos in vitro demonstraram que o magnésio pode modular a secreção do hormônio da paratireóide (PTH) de maneira semelhante ao cálcio. Uma diminuição aguda na concentração de magnésio estimula a secreção de PTH e um aumento agudo na concentração diminui a secreção. O magnésio provavelmente desempenha um papel importante no metabolismo da vitamina D. Alguns pacientes com hipocalcemia e deficiência de magnésio são resistentes a doses farmacológicas de vitamina D ou podem ter uma forma de raquitismo resistente à vitamina D dependente de magnésio. Foi observado que a depleção de fosfato é acompanhada por um aumento do magnésio e do cálcio urinários. Na pediatria, a síndrome de depleção de fosfato é observada com frequência principalmente em bebês prematuros, que costumam receber uma dieta pobre em fósforo. O magnésio está envolvido em muitas das reações bioquímicas que ocorrem na célula e, particularmente, nos processos que envolvem a formação e a utilização de ATP. Assim, a nível celular, o magnésio desempenha um papel fundamental nos processos de transporte iônico.


Resumo

As enzimas são catalisadores químicos que aceleram as reações químicas em temperaturas fisiológicas, diminuindo sua energia de ativação. As enzimas são geralmente proteínas que consistem em uma ou mais cadeias polipeptídicas. As enzimas têm um sítio ativo que fornece um ambiente químico único, composto por certos grupos de aminoácidos R (resíduos). Este ambiente único é perfeitamente adequado para converter reagentes químicos específicos para aquela enzima, chamados substratos, em intermediários instáveis ​​chamados estados de transição. Acredita-se que as enzimas e os substratos se liguem com um ajuste induzido, o que significa que as enzimas passam por pequenos ajustes conformacionais no contato do substrato, levando a uma ligação total e ideal. As enzimas se ligam a substratos e catalisam reações de quatro maneiras diferentes: juntando substratos em uma orientação ideal, comprometendo as estruturas de ligação dos substratos para que as ligações possam ser quebradas mais facilmente, fornecendo condições ambientais ideais para que uma reação ocorra ou participando diretamente de sua reação química através da formação de ligações covalentes transitórias com os substratos.

A ação da enzima deve ser regulada de forma que em uma determinada célula em um determinado momento, as reações desejadas sejam catalisadas e as indesejadas não. As enzimas são reguladas por condições celulares, como temperatura e pH. Eles também são regulados por meio de sua localização dentro de uma célula, às vezes sendo compartimentados de modo que só podem catalisar reações em certas circunstâncias. A inibição e ativação de enzimas por meio de outras moléculas são outras formas importantes pelas quais as enzimas são reguladas. Os inibidores podem agir de forma competitiva, não competitiva ou alostericamente. Os inibidores não competitivos são geralmente alostéricos. Os ativadores também podem aumentar a função das enzimas alostericamente. O método mais comum pelo qual as células regulam as enzimas nas vias metabólicas é por meio da inibição por feedback. Durante a inibição por feedback, os produtos de uma via metabólica atuam como inibidores (geralmente alostéricos) de uma ou mais enzimas (geralmente a primeira enzima comprometida da via) envolvida na via que os produz.


Assista o vídeo: Receptores acoplados a proteínas G y Receptores ionotrópicos (Novembro 2021).