Em formação

Quais são os problemas em usar um ssDNA ou um mRNA para expressão em vez de usar um plasmídeo?


Digamos que você queira fazer um experimento de clonagem de genes. Você tem um vetor de expressão vazio (mRNA ou DNA) e está procurando clonar algum gene X nele. Por que você só pode comprar X já dentro de um vetor (que, por sua vez, muitas vezes está dentro de um portador bacteriano)?

Qual é o problema de lidar com nucleotídeos de mRNA puros do gene X? Ou mesmo sscDNA?


Qual é o problema de lidar com nucleotídeos de mRNA puros do gene X? Ou mesmo sscDNA?

Problemas na transfecção direta de um mRNA / ssDNA

Os mRNAs podem ser transfectados nas células e isso é feito com bastante frequência. O problema com a transfecção direta de mRNAs é que o mRNA se degrada logo e você não terá expressão sustentada. Isso é, no entanto, muito útil em certos casos, como a criação de células-tronco pleuripotentes induzidas (iPSCs), onde você não deseja que as células expressem continuamente os fatores de Yamanaka (alguns dos quais também são oncogenes).

Além disso, os RNAs são bastante suscetíveis à degradação. É muito mais fácil preparar e armazenar soluções de DNA por muito tempo.

Problemas semelhantes surgem com um ssDNA.

Por que você só pode comprar X já dentro de um vetor (que, por sua vez, muitas vezes está dentro de um portador bacteriano)?

Uma grande vantagem do uso de plasmídeos é que você pode propagar seu gene infinitamente. Se, em vez disso, você recebeu uma quantidade fixa de mRNA, logo ficará sem ela. Alguns fornecedores praticam políticas capitalistas gananciosas: P

Quando você amplifica um DNA usando PCR, a clonagem tem vantagens adicionais:

  • você pode sequenciar o gene usando primers bem padronizados (como T7)
  • você pode fazer construções que podem expressar o gene condicionalmente

Você tem um vetor de expressão vazio (mRNA ou DNA) e está procurando clonar algum gene X nele.

Você não pode facilmente clonar algo dentro de um RNA. Você precisa de endonucleases de RNA específicas. Além disso, uma dupla digestão será desastrosa neste caso.

Por que os fornecedores geralmente não vendem uma inserção de dsDNA, mas sim a fornecem clonada em um plasmídeo

  • Um dsDNA circular é mais estável
  • Os fornecedores podem manter o estoque da inserção para futuros clientes sem ter que fazer PCR novamente
  • A inserção clonada pode ser amplificada por meio de culturas bacterianas para obter quantidades muito altas (preps maxi / giga)

Problemas de lição de casa - Módulo de aprendizagem de literatura: Fator de transcrição Ikaros reprime a proteína fosfatase 2A

  • Contribuição de Henry Jakubowski
  • Professor (Química) no College of St. Benedict / St. John's University

Esta página contém questões de avaliação / exame usando dados, figuras e gráficos de periódicos de pesquisa, como o Journal of Biological Chemistry, que permitem seu uso, ou de periódicos como o PLOS, que são de acesso totalmente aberto. Os artigos e tópicos escolhidos foram selecionados para avaliação compreensão dos alunos dos conceitos básicos e objetivos de aprendizagem da Sociedade Americana de Bioquímica e Biologia Molecular (ASBMB), bem como os conceitos básicos e objetivos do MCAT2015. Esses dois conjuntos de padrões se sobrepõem amplamente. Tanto o ASBMB quanto o MCAT2015 enfatizam fortemente a investigação científica e as habilidades de raciocínio, que talvez sejam mais bem avaliadas por questões abertas derivadas da literatura nas quais os alunos devem empregar habilidades de Bloom de nível superior de aplicação e análise.

Essas perguntas também podem ser usadas por alunos que buscam mais oportunidades de praticar a interpretação dos resultados da literatura de pesquisa. A capacidade de aplicar, analisar e avaliar informações e conceitos está no cerne da investigação científica e das habilidades de raciocínio que são centrais para os novos padrões de competência ASBMB e MCAT2015. As perguntas neste módulo de aprendizagem são projetadas para avaliar essas competências usando respostas abertas em vez de perguntas de múltipla escolha. As respostas podem ser encontradas no link na parte inferior desta página.


O Guide-it Long ssDNA Production System v2 inclui refinamentos que permitem um processamento mais eficiente de modelos desafiadores, fornecem rendimentos de ssDNA mais altos e permitem um protocolo mais simples em comparação com nossos kits de ssDNA de primeira geração (Cat. # 632644, 632645). *

Geração aprimorada de ssDNA com o Guide-it Long ssDNA Production System v2. Imagem de gel mostrando o material de partida dsDNA (pista 1) e produtos de ssDNA sense (SS) ou antisense (AS) para vários modelos HDR gerados usando as versões original (v1) ou atualizadas (v2) do Guide-it Long ssDNA Production System ( Pista 2 e Pista 3, respectivamente). Os modelos de dsDNA incluídos nesta análise foram identificados como substratos desafiadores para a geração de ssDNA usando o kit v1 Guide-it. O dsDNA e o ssDNA foram analisados ​​por eletroforese em gel de agarose usando brometo de etídio como agente de coloração. Os produtos ssDNA funcionam com um peso molecular menor do que os substratos dsDNA correspondentes. Em todos os casos, o Guide-it Long ssDNA Production System v2 gerou uma banda mais limpa de ssDNA do que a versão anterior do kit, sugerindo uma digestão mais completa e uniforme.

* Observe que, com o lançamento do Guide-it Long ssDNA Production System v2, os kits originais do Guide-it ssDNA (Cat. # 632644, 632645) foram descontinuados.

Informações adicionais do produto

Consulte o Certificado de Análise do produto para obter informações sobre as condições de armazenamento, componentes do produto e especificações técnicas. Consulte a Lista de componentes do kit para determinar os componentes do kit. Certificados de análise e listas de componentes do kit estão localizados na guia Documentos.


Vetor de expressão gênica de retrovírus MMLV

O sistema de vetor retroviral MMLV é um veículo eficiente para a introdução permanente de genes em células de mamíferos. Tornou-se particularmente popular como método de entrega de genes para a produção de células iPS.

Os vetores retrovirais MMLV são derivados do vírus da leucemia murina Moloney, que é um membro da família dos retrovírus. O vírus Wildtype MMLV tem um genoma de RNA linear de fita positiva.

Um vetor retroviral MMLV é primeiro construído como um plasmídeo em E. coli. Em seguida, é transfectado em células de empacotamento, juntamente com vários plasmídeos auxiliares. Dentro das células de empacotamento, o vetor de DNA localizado entre as duas repetições terminais longas (LTRs) é transcrito em RNA, e as proteínas virais expressas pelos plasmídeos auxiliares empacotam ainda mais o RNA em vírus. O vírus vivo é então liberado no sobrenadante, que pode ser usado para infectar as células-alvo diretamente ou após concentração.

Quando o vírus é adicionado às células-alvo, a carga de RNA é transportada para as células, onde é transcrita reversamente em DNA e integrada aleatoriamente no genoma do hospedeiro. Qualquer gene (s) que foram colocados entre os dois LTRs durante a clonagem do vetor são inseridos permanentemente no DNA do hospedeiro ao lado do resto do genoma viral.

Por design, os vetores retrovirais MMLV não possuem os genes necessários para o empacotamento e transdução viral (esses genes são transportados por plasmídeos auxiliares ou integrados em células de empacotamento). Como resultado, os vírus produzidos a partir dos vetores têm a importante característica de segurança de serem incompetentes na replicação (o que significa que podem transduzir células-alvo, mas não podem se replicar nelas).

Para obter mais informações sobre este sistema vetorial, consulte os artigos abaixo.

Referências Tema
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J Virol. 61: 1639 (1987) Sinal de empacotamento estendido aumenta o título de vetores MMLV
Gene Ther. 7: 1063 (2000) O tropismo de vetores MMLV depende de linhas de células de empacotamento
Nat Protoc. 6: 346 (2011) O tropismo de vetores MMLV depende de plasmídeos de empacotamento

Nosso vetor é otimizado para replicação de alto número de cópias em E. coli, empacotamento de alto título de vírus vivo, transdução viral eficiente de uma ampla gama de células, integração de vetor eficiente no genoma do hospedeiro e expressão de transgene de alto nível.

Integração permanente do DNA vetorial: A transfecção convencional resulta na entrega quase totalmente transitória de DNA em células hospedeiras devido à perda de DNA ao longo do tempo. Este problema é especialmente proeminente nas células que se dividem rapidamente. Em contraste, a transdução retroviral pode entregar genes permanentemente nas células hospedeiras devido à integração do vetor viral no genoma do hospedeiro.

Tropismo amplo: Nosso sistema de empacotamento adiciona a proteína do envelope VSV-G à superfície viral. Esta proteína possui amplo tropismo. Como resultado, a partir de espécies de mamíferos comumente usados, como humanos, camundongos e ratos podem ser transduzidos. Além disso, muitos tipos de células podem ser transduzidos, embora nosso vetor tenha dificuldade em transduzir células que não se dividem (veja as desvantagens abaixo).

Grande espaço de carga: O genoma retroviral de MMLV de tipo selvagem é

8 kb. Em nosso vetor, os componentes necessários para o empacotamento viral e transdução ocupam

5,5 kb para acomodar o DNA de interesse do usuário. Como nosso vetor é projetado para a inserção de apenas um ORF, esse espaço de carga é suficiente para a maioria das aplicações.

Expressão de alto nível: O 5 'LTR contém um forte promotor onipresente que conduz a expressão de alto nível do gene de interesse do usuário.

Uniformidade relativa de entrega de genes: Geralmente, a transdução viral pode entregar vetores nas células de uma maneira relativamente uniforme. Em contraste, a transfecção convencional de vetores de plasmídeo pode ser altamente não uniforme, com algumas células recebendo muitas cópias, enquanto outras células recebendo poucas cópias ou nenhuma.

Eficácia in vitro e in vivo: Embora nosso vetor seja usado principalmente para transdução in vitro de células em cultura, ele também pode ser usado para transduzir células em animais vivos.

Segurança: A segurança do nosso vetor é garantida pela partição dos genes necessários para o empacotamento e transdução viral em vários plasmídeos auxiliares ou pela integração deles em células de empacotamento. Como resultado, o vírus vivo produzido a partir do nosso vetor é incompetente para a replicação.

Desvantagens

Dependência do promotor 5 'LTR: A expressão do gene de interesse em nosso vetor é conduzida pela função do promotor onipresente no LTR 5 '. Esta é uma desvantagem distinta em comparação com nossos vetores lentivirais que permitem ao usuário inserir seu próprio promotor para conduzir seu gene de interesse.

Título viral moderado: Título viral de nosso alcance de vetor

10 7 TU / ml no sobrenadante das células de empacotamento sem concentração adicional. Isso é cerca de uma ordem de magnitude menor do que nossos vetores lentivirais.

Dificuldade de transdução de células que não se dividem: Nosso vetor tem dificuldade em transduzir células que não se dividem.

Complexidade técnica: O uso de vetores retrovirais MMLV requer a produção de vírus vivos em células de empacotamento, seguido pela medição do título viral. Estes procedimentos são tecnicamente exigentes e demorados em relação à transfecção de plasmídeo convencional.

Componentes chave

MMLV 5 'LTR: Repetição terminal longa 5 'do retrovírus MMLV. Em retrovírus MMLV de tipo selvagem, 5 'LTR e 3' LTR são essencialmente idênticos em sequência. Eles residem em duas extremidades do genoma viral e apontam na mesma direção. Após a integração viral, a sequência LTR 3 'é copiada para a LTR 5'. Os LTRs carregam o promotor e a função de poliadenilação, de modo que o LTR 5 'atua como um promotor para conduzir a transcrição do genoma viral, enquanto o LTR 3' atua como um sinal de poliadenilação para encerrar o transcrito a montante.

& Psi plus pack2: Sinal de empacotamento de retrovírus MMLV necessário para o empacotamento de RNA viral em vírus.

Kozak: Sequência de consenso de Kozak. É colocado na frente do códon de início da ORF de interesse porque se acredita que facilita o início da tradução em eucariotos.

ORF: O quadro de leitura aberto do seu gene de interesse é colocado aqui. A sua expressão é conduzida pela função do promotor ubíqua na 5 'LTR.

MMLV 3 'LTR: Repetição terminal longa 3 'do retrovírus MMLV. O sinal de poliadenilação contido em 3 'LTR serve para terminar o transcrito da ORF a montante.

pUC ori: Origem de replicação do pUC. Os plasmídeos com esta origem existem em grande número de cópias em E. coli.

Ampicilina: Gene de resistência à ampicilina. Permite que o plasmídeo seja mantido por seleção de ampicilina em E. coli.


Algumas mutações CFTR podem ser tratadas sem terapias de RNA

A maioria dos alvos genéticos está em algum ponto do espectro entre o TTR, que é ideal, e um câncer geneticamente instável, que não é o ideal. Um exemplo é a FC, uma doença causada por mutações autossômicas recessivas no CFTR, localizado no cromossomo 7 (Fig. 1a). 21 Nos Estados Unidos, cerca de 1 em 2.500 crianças caucasianas são diagnosticadas com a doença. Incidências consideravelmente mais baixas são observadas nas populações afro-americanas e asiáticas. 22 Os prognósticos melhoraram significativamente desde a descoberta da doença, embora ainda sejam muito mais baixos do que uma pessoa sem FC, a expectativa de vida média agora ultrapassa os 40 anos, em grande parte devido ao desenvolvimento de tratamentos que controlam infecções bacterianas, substituem enzimas pancreáticas, aumentam a absorção de nutrientes e facilitar a limpeza do tórax de muco espesso 23,24

Existem muitos CFTR genótipos mutantes recentemente, os cientistas estimaram que mais de 1.000 variações genéticas no CFTR gene estão representados em menos de cinco pacientes cada em todo o mundo. 25 No entanto, esse conjunto de mutações pode ser agrupado em apenas seis classes, distinguidas pelo efeito na proteína CFTR e seu fenótipo a jusante dentro da célula. 26 Algumas mutações dentro dessas classes já podem ser tratadas com pequenas moléculas aprovadas pela FDA. 25,26 Outras mutações não podem e podem, portanto, ser mais dependentes de terapias de RNA no futuro (Fig. 2).

Figura 2. As mutações de CF se enquadram em seis classes diferentes. Essas classes variam desde a geração de transcritos de mRNA de CFTR mutantes que não são traduzidos até a geração de proteína CFTR defeituosa, que não permite o tráfego de íons suficiente através da membrana celular. Diferentes moléculas pequenas têm sido usadas para tratar as seis classes, incluindo readthrough pequenas moléculas, corretor e terapêutica baseada em potenciador. CFTR mutações que provavelmente não serão tratadas por pequenas moléculas existentes podem ser melhores candidatas para terapias de genes de RNA.

Mutações de classe I, como G542X, W1282X ou R553X, resultam em um códon de parada prematura, que impede a criação de proteína funcional. 27,28 Para tratar mutações desse tipo, os cientistas desenvolveram uma leitura através de pequenas moléculas. Essas pequenas moléculas contornam os códons de parada prematuros para estimular a transcrição. 26 Readthrough pequenas moléculas foram testadas em vários estudos e ensaios clínicos, no entanto, não se sabe se elas serão aprovadas pelo FDA. 29 Essa potencial falta de drogas de moléculas pequenas para tratar mutações de Classe I pode, alternativamente, ser tratada por terapias de mRNA projetadas para substituir o que está faltando CFTR gene.

Mutações de classe II criam proteínas mal dobradas que são incapazes de alcançar a membrana celular. 26 Notável entre essas mutações é a variante ΔF508: uma mutação causada pela deleção de três pares de bases no exon 10 que leva à ausência de um resíduo de fenilalanina na proteína CFTR. 30 Mais de 70% de defeituoso CFTR alelos incluem essa mutação, tornando-a a principal causa de FC nos Estados Unidos. 23,27 Como resultado, uma quantidade enorme de pesquisas tem sido investida para encontrar tratamentos para pacientes com a mutação ΔF508, resultando em terapias de pequenas moléculas aprovadas.

Por exemplo, a combinação lumacaftor / ivacaftor terapêutico atua para restaurar parcialmente a função CFTR. Especificamente, o lumacaftor é um corretor CFTR que ajuda durante o processo de dobramento da proteína, permitindo que o CFTR seja trafegado para a superfície da célula. 31 Assim que o CFTR atinge a superfície celular, o ivacaftor atua como um potencializador, garantindo que o CFTR permita a passagem dos íons cloreto. 32 Notavelmente, para o caso de ΔF508, o ivacaftor não é eficaz por si só, uma vez que requer proteína CFTR devidamente dobrada para atuar. 32,33

Os corretores de última geração também foram desenvolvidos para lidar com diferentes anormalidades de processamento, incluindo tezacaftor e elexacaftor. 25 Especificamente, o elexacaftor se liga a uma bolsa diferente na proteína CFTR e resulta na melhora da função pulmonar e de outros fatores respiratórios quando administrado em combinação com tezacaftor e ivacaftor. 34 Na verdade, o FDA aprovou recentemente o Trikafta, uma terapia de combinação tripla que combina elexacaftor, ivacaftor e tezacaftor. Trikafta foi aprovado para uso em pacientes com pelo menos uma mutação ΔF508, enquanto as terapias anteriores únicas ou combinadas tratavam apenas pacientes homozigotos para a mutação ΔF508. 35,36 Esses tratamentos com moléculas pequenas representam um grande sucesso para cientistas e pacientes com FC. Terapias futuras para FC, incluindo terapias de mRNA, precisarão demonstrar segurança e eficácia extraordinariamente altas para suplantar essas drogas existentes.

Outro observado CFTR as mutações enquadram-se nas classes III-VI. Uma mutação de Classe III carece de uma porta de canal de íon funcional, uma Classe IV tem condutância iônica defeituosa através do canal CFTR, uma Classe V resulta em proteína CFTR insuficiente atingindo a superfície celular e uma Classe VI tem alto turnover de CFTR como resultado de proteína baixa estabilidade na membrana celular. 27 Ivacaftor, o potenciador CFTR, foi aprovado pelo FDA para tratar 38 variantes de CFTR mutações, principalmente dentro da Classe III, mas curiosamente, mostram diferentes graus de melhora dependendo do genótipo do paciente. 25,37

Da mesma forma, existem muitos CFTR variantes extremamente raras (às vezes tão raras quanto uma única pessoa). 25 Como resultado, pode ser difícil obter evidências clínicas suficientemente poderosas para apoiar a aprovação de medicamentos de pequenas moléculas, deixando esses pacientes no limbo. Mesmo se houver evidência clínica de que uma mutação rara ou ainda a ser estudada pode ser tratada por uma pequena molécula existente, o acesso a essas drogas “off-label” pode ser caro, bloqueando o acesso do paciente. 25 Há um esforço conjunto para entender melhor quais mutações são tratáveis ​​com as terapias de pequenas moléculas existentes e como elas se diferenciam das variantes de mutação intratáveis. 25,27 Compreender essas diferenças e os desafios que elas representam para os pacientes com FC é importante para identificar mutações que podem precisar ser tratadas por meio de terapias de RNA.


Formulários

  • Degradação de DNA de fita simples
  • Remoção de fragmentos de ssDNA em uma mistura de reação
  • Digestão do primer de PCR pós-reação

Notas

A exonuclease I não deve ser usada para o embotamento da extremidade do DNA. As extremidades curtas do DNA não são um substrato apropriado para a Exonuclease I. Para o embotamento da extremidade do DNA, use DNA Polimerase I, Fragmento de Klenow (2140A, 2140AK, 2140B, 2140BK) ou Mung Bean Nuclease (2420A, 2420B) em vez disso.

Amortecedor

Fornecido com 1 mL de 10X Exonuclease I Buffer [670 mM Glycine-KOH, pH 9,5, 10 mM DTT, 67 mM MgCl2].

Informações adicionais do produto

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Desenvolvimento de Tecnologia

Nosso laboratório está interessado em desenvolver novas tecnologias genéticas com aplicações para descoberta de genes e saúde humana. Algumas das tecnologias que estamos explorando atualmente são a triagem genética com bibliotecas de RNAI e ORF, descoberta de autoanticorpos e novos métodos para descoberta de anticorpos. Atualmente, estamos particularmente interessados ​​em doenças autoimunes e projeto de vacinas. Alguns de nossos trabalhos são detalhados a seguir.

Bibliotecas shRNA

Ce, junto com nossos colaboradores no laboratório de Greg Hannon, geramos grandes bibliotecas de shRNAs que cobrem todo o genoma humano e de camundongo (171, 183). As bibliotecas são projetadas usando algoritmos de previsão shRNA e sintetizadas de maneira massivamente paralela usando microarrays Agilent. Os oligonucleotídeos são amplificados por PCR e clonados em vetores retrovirais ou lentivirais. Nesse ponto, eles podem ser usados ​​diretamente ou verificados em sequência e organizados. Cada vetor também possui um código de barras exclusivo associado a ele para a deconvolução de microarray de pools. Desta forma, podemos gerar grandes bibliotecas de shRNAs para triagem genética (consulte a Seção de Desenvolvimento de Tecnologia para obter mais detalhes).

Novos vetores shRNA, os vetores PRIME

TO advento do RNAi levou à capacidade de interferir na expressão gênica e expandiu muito nossa capacidade de realizar triagens genéticas em células de mamíferos. A expressão de RNA em gancho curto de promotores da polimerase III pode ser codificada em transgenes e usada para produzir siRNAs que regulam negativamente genes específicos. No entanto, descobrimos que shRNAs transcritos pela polimerase II exibem knockdown muito eficiente da expressão gênica quando o shRNA é incorporado em um contexto de micro-RNA (182). É importante ressaltar que nosso sistema de expressão de shRNA (chamados vetores PRIME) permite a co-transcrição multicistrônica de um gene repórter, facilitando assim o rastreamento da produção de shRNA em células individuais. Com base nesse sistema, desenvolvemos uma série de vetores lentivirais que exibem knockdown responsivo à tetraciclina da expressão gênica em uma única cópia. A alta penetrância desses vetores PRIME facilitará telas de perda de função em todo o genoma e é um passo importante para o uso de estratégias de codificação de barras para acompanhar a perda de sequências específicas em populações complexas.

Também desenvolvemos uma série de vetores PRIME que mostram melhor knockdown em células ES de camundongo e outras células onde o promotor CMV pode não ser o ideal. Além disso, desenvolvemos vetores indutíveis mais responsivos a tet que codificam seu próprio ativador tet reverso.

Tecnologias de DNA recombinante

MAGIC: Um método genético in vivo para a construção rápida de DNA recombinante

Cnós desenvolvemos um novo, altamente engenheirado na Vivo método de clonagem, MAGIC (Mating Assisted Genetically Integrated Cloning), que facilita a construção rápida de moléculas de DNA recombinante (180). MAGIC emprega acasalamento bacteriano, na Vivo clivagem de endonuclease específica de local e recombinação homóloga para catalisar a transferência de fragmentos de DNA entre um vetor doador em uma cepa bacteriana e um plasmídeo receptor em uma cepa bacteriana separada. Os eventos de recombinação são geneticamente selecionados e resultam na colocação do gene de interesse sob o controle de novos elementos reguladores com alta eficiência. MAGIC elimina a necessidade de enzimas de restrição, DNA ligases, preparação de DNA e todos em vitro manipulações necessárias para a subclonagem e permite a construção rápida de várias construções com o mínimo de esforço. Demonstramos que o MAGIC pode gerar construções para expressão em vários organismos. As this new method requires only the simple mixing of bacterial strains, it represents a significant advance in high throughput recombinant DNA production that will save researchers significant amounts of time, effort and expense in functional genomics studies.

SLIC Cloning: a method for subcloning without restriction enzymes or DNA ligase

We developed a novel cloning method SLIC (Sequence and Ligation-Independent Cloning) that allows the assembly of multiple DNA fragments in a single reaction using em vitro homologous recombination and single-strand annealing (195). SLIC mimics na Vivo homologous recombination by relying on exonuclease generation of single strand DNA (ssDNA) overhangs on insert and vector fragments and the assembly of these fragments by recombination em vitro. SLIC inserts can be prepared by incomplete PCR (euPCR) or mixed PCR. SLIC allows efficient and reproducible assembly of recombinant DNA with as many as 5 and 10 fragments simultaneously. SLIC circumvents the sequence requirements of traditional methods and is much more sensitive when combined with RecA to catalyze homologous recombination. It also provides a new method for site-directed mutagenesis of a gene. This flexibility allows much greater versatility in the generation of recombinant DNA for the purposes of synthetic biology.

Enhanced display technologies for biomarker discovery – PhIP Seq

The sensitive detection of circulating biomarkers represents a powerful approach to screening for early malignancy. However, current techniques are limited in their ability to distinguish normal from pathological states. This work aims to improve on current screening technology, utilizing novel principles in synthetic biology. In particular, we combine next generation DNA sequencing with the display of polypeptide libraries encoded by microarray-derived oligonucleotides. Using the T7 bacteriophage system, we are able to display the complete human peptidome and thereby seek to discover autoantigen biomarkers common to breast cancer patients. In parallel we are developing a fully defined, synthetic human single chain variable fragment (scFv) antibody library. This library will be used in ribosome display format for a scFv library-versus-peptide library screen in an effort to create a proteomic scale scFv set. Our hope is that development of these technologies will facilitate the identification of circulating cancer biomarkers, thereby enabling early diagnosis and treatment of the disease.

The pINDUCER lentiviral toolkit for inducible RNA interference in vitro and in vivo.

The discovery of RNAi has revolutionized loss-of-function genetic studies in mammalian systems. However, significant challenges still remain to fully exploit RNAi for mammalian genetics. For instance, genetic screens and in vivo studies could be broadly improved by methods that allow inducible and uniform gene expression control. To achieve this, we built the lentiviral pINDUCER series of expression vehicles for inducible RNAi in vivo. Using a multicistronic design, pINDUCER vehicles enable tracking of viral transduction and shRNA or cDNA induction in a broad spectrum of mammalian cell types in vivo. They achieve this uniform temporal, dose-dependent, and reversible control of gene expression across heterogenous cell populations via fluorescence-based quantification of reverse tet-transactivator expression. This feature allows isolation of cell populations that exhibit a potent, inducible target knockdown in vitro and in vivo that can be used in human xenotransplantation models to examine cancer drug targets.

OLDER TECHNOLOGIES

Lambda YES cDNA Expression System

Ce have developed a multifunctional lambda expression vector system, lambda YES, designed to facilitate gene isolation from eukaryotes by complementation of E. coli and S. cerevisiae mutations (23). Lambda YES vectors have a selection for cDNA inserts using an oligo adaptor strategy and are capable of expressing genes in both E. coli and S. cerevisiae. They also allow conversion from phage l to plasmid clones using the cre-lox site-specific recombination system, referred to as automatic subcloning. Lambda YES vectors utilize an adaptor selection for inserts and can generate libraries with 109 recombinants per mg of cDNA insert. cDNA libraries constructed in these vectors have been used to isolate genes from humans by complementation of yeast. Using this technology we isolated the human Cdk2 gene (24) by complementation of a yeast cdc28 Ts mutation and the Cyclin F gene (40) as a suppressor of cdc4 Ts mutations which led to the discovery of F-box proteins (77).

UPS – the Univector Plasmid Fusion System: A method for rapid construction of recombinant DNA molecules without restriction enzymes

Modern biological research is highly dependent upon recombinant DNA technology. The functional analysis of a single gene requires the introduction of that gene into multiple vectors for different purposes. Conventional cloning methods are time-consuming and individual cloning events must be performed independently. To approach solving this problem, we sought to develop a systematic and uniform method with which to manipulate large sets of genes.

We developed a series of novel cloning methods that facilitate the rapid and systematic construction of recombinant DNA molecules (102). The central method is named the Univector Plasmid-fusion System (UPS). UPS employs cre-lox site-specific recombination to catalyze plasmid fusion between the Univector, a plasmid containing the gene of interest, and host vectors containing regulatory information. Fusion events are genetically selected and result in placement of the gene under the control of novel regulatory elements. A second UPS-related method allows for the precise transfer of coding sequences only from the Univector into a host vector. UPS eliminates the need for restriction enzymes, DNA ligases, and many em vitro manipulations required for subcloning and allows the rapid construction of multiple constructs for expression in multiple organisms. We demonstrate that UPS can be used to transfer whole libraries into new vectors. New methods for directional cloning of PCR fragments and for the generation of epitope tags and other fusions at the 3′ end of genes using homologous recombination in E. coli are described that facilitate cloning and manipulation of genes in the Univector.

Together, these recombination-based cloning methods constitute a new comprehensive approach for the rapid and efficient generation of recombinant DNA that can be used for parallel processing of large gene sets, an ability required for future genomic analysis. We are continuing to develop large-scale capabilities using UPS as an alternative to the expensive and limited GATEWAY system.

Advances in the Two-Hybrid System

The two-hybrid cloning system is a powerful genetic method to identify genes via protein-protein interactions. We have made a number of improvements to this method which are designed to increase the number of potential protein-protein interactions detectable and to streamline the labor intensive process of authenticating clones identified in the primary screen. The first improvement was the design of genetic selections instead of screens to detect interacting proteins (32, 39) We developed the strain Y190 using HIS3 as a reporter and Y166 which employed a URA3 reporter for this purpose. A selection vastly increases the numbers of library clones that can be searched and is now built into all systems. Secondly, through the use of negative selections for plasmid loss coupled with a replica-mating strategy, we have developed a rapid method to distinguish between the genuinely interacting clones and the nonspecific background that is inherent to the system. Third, a lambda phage vector, lambda ACT2, was made that allows construction of highly complex, HA epitope-tagged, directional libraries of GAL4 activation domain-fused cDNAs that can be converted to plasmid form by in vivo cre-lox mediated site-specific recombination. We also introduced yeast mating of library clones to baits as a rapid way to both generate libraries and well as to counter screen against false positives. These methods have been incorporated into all current two-hybrid system kits. We used these methods to identify the human p21 and p57 Cdk inhibitors.

A Cytoplasmic Two Hybrid System, The SOS Recruitment System

eun collaboration with Michael Karin’s lab, we have developed a novel two hybrid system for the cloning of genes involved in protein-protein interactions (84). This system, called the SOS Recruitment System, SRS, relies on the activation of the ras signalling pathway when a fusion protein to the ras guanine nucleotide exchange factor, SOS, is recruited to the inner surface of the plasma membrane by physical association with a second protein targeted to the same membrane by a myristylation sequence. When SOS is successfully recruited to the plasma membrane, it activates ras and bypasses the need for the endogenous exchange factor, Cdc25, an essential protein. This system allows protein-protein interactions to be detected in the cytoplasm. Furthermore, proteins that activate transcription can be used in this system giving it an advantage over the transcriptionally based two-hybrid system. We have developed a lambda-based expression vector, lambda MS-TRP for expression of myristylation-fused cDNA libraries an other useful vectors for this method. Visit our protocols page for more information


Conclusões

In summary, a CRISPR/Cas9 toolbox was developed for efficient and comprehensive engineering of the industrial workhorse C. glutamicum. Markerless gene deletion, gene insertion, single-nucleotide editing and double-locus editing were achieved by using a customized two-plasmid-based CRISPR/Cas9 system and a simplified co-transformation strategy. This toolbox works well in several C. glutamicum strains and holds promise for renovating the genome editing of corynebacteria.


“Hacking the software of life”: Salesmanship versus cranks

It might be a bit harsh of me to say that the “mRNA vaccines are gene therapy” narrative by antivaxxers is a self-inflicted wound. However, it is not at all harsh to point out how Moderna scientists and executives selling their technology provided antivaxxers with language that they could easily weaponize against COVID-19 vaccines. In particular, Mercola makes a lot of this 2017 talk by Dr. Tal Zaks, chief medical officer of Moderna, in which he likened mRNA vaccines to “hacking the software of life”:

It gets worse, though, and Mercola gleefully takes advantage of Moderna’s loose analogies:

Zaks’ analogy to a prowler doesn’t even make a lot of sense biologically or as an analogy. He seems to be likening the RNA from a vaccine to being a “prowler” compared to the “prowler” of the virus outside of the cell. It’s no wonder that antivaxxers can so easily turn such language against COVID-19 vaccines, as it Zaks seems to be implying that the body is more alarmed by RNA in its cells than it is from foreign protein circulating in the body. As for “information therapy”, my only thought reading that dates back to the early 1980s: Gag me with a spoon.

Seriously, I wish Moderna would lose this particular analogy. It’s done (and continues to do) so much harm. I understand why it is attractive to view mRNA as “software”, but in reality it’s not. If you really wanted to pursue the analogy, I’d say that DNA is the software, mRNA is the compilation of that software, and the protein is the output, but even that’s a strained analogy. However you look at that analogy, though, it allows Mercola to pull off a favorite old antivaccine trope, one that was resurrected for COVID-19 vaccines, namely that vaccines are “transhumanism“, a claim by antivaxxers that I first noticed in 2012.

Seriously, look at Mercola run with this:

And, of course, according to Mercola, transhumanism due to COVID-19 vaccines is part and parcel of the “Great Reset”, a conspiracy theory claiming that the pandemic was engineered by the global elites to allow for a “reset” in which they take control of the world economy. I can’t help but note that “the Great Reset” is another example of how poorly chosen words basically give conspiracy theorists a gift. “The Great Reset” really is a plan first proposed by the World Economic Forum exploring how countries might recover from the COVID-19 pandemic. I mean, seriously? Who thought of this term? Who at Moderna thought it would be a good idea to present their treatments as “hacking the software of life”, given all the negative connotations of hacking?

Again, words matter. While I can’t be too hard on Moderna for being cautious in its SEC filing and using language that reflected regulatory uncertainties of the time, I can blame Tal Zaks and the leadership of Moderna for using such easily weaponized analogies, such as “hacking the software of life” to sell its product to investors. I can blame the World Economic Forum for coming up with a term like the “Great Reset”. These words matter, and these words have been a gift to COVID-19 conspiracy theorists and a burden to those trying to counter disinformation.


Assista o vídeo: na czym polega EKSPRESJA INFORMACJI GENETYCZNEJ? - KOREPETYCJE z BIOLOGII - 212 (Novembro 2021).