Em formação

Qual é a diferença entre hsa-miR-33a e hsa-miR-33b?


Alguém sabe qual é a diferença entre dois miRNAs como hsa-miR-33uma e hsa-miR-33b? A última carta neles mostra o quê?

Além disso, se sabemos que hsa-miR-33a tem como alvo o gene A, podemos dizer que hsa-miR-33b tem como alvo o gene A também? ou podemos dizer que é muito provável que hsa-miR-33b tenha como alvo o gene A, já que hsa-miR-33a tem como alvo A?


Eles são parálogos, isto é, eles têm um alto nível de homologia de sequência. Eles podem ter a mesma sequência de sementes também (veja isto). Os parálogos podem ter os mesmos alvos se tiverem a mesma sequência de sementes, mas isso não é essencial em todos os casos. No entanto, a extensão da homologia necessária para este tipo de classificação é mal definida. miRBase ainda segue as diretrizes mencionadas neste artigo (bastante antigo):

Quando tal candidato é tão semelhante em sequência ao miRNA conhecido que a sonda projetada para detectá-lo certamente hibridizaria com o miRNA conhecido, o critério A não precisa ser satisfeito e o candidato pode ser anotado como uma forma variante do conhecido miRNA, desde que o próprio candidato atenda ao critério C, e também há uma confiança muito alta de que um desses parálogos é um miRNA confirmado (ou seja, sua classificação é apoiada por pelo menos três dos critérios listados). Quando há duas ou mais incompatibilidades entre os parálogos de miRNA de modo que as sondas possam diferenciar as espécies em Northern blots, o critério A deve ser satisfeito experimentalmente. Às vezes, sequências de cDNA que se sobrepõem parcialmente são identificadas a partir do mesmo locus; supõe-se que estes representem produtos processados ​​diferencialmente do gene.


A análise da matriz de microRNA do soro identifica miR-140-3p, miR-33b-3p e miR-671-3p como potenciais biomarcadores de osteoartrite envolvidos em processos metabólicos

MicroRNAs (miRNAs) em circulação surgiram como biomarcadores promissores. Neste estudo, objetivamos identificar uma assinatura de miRNA circulante para pacientes com osteoartrite (OA) e em combinação com a análise de bioinformática para avaliar a utilidade de miRNAs expressos diferencialmente no soro como potenciais biomarcadores de OA.

Métodos

Amostras de soro foram coletadas de 12 pacientes primários com OA, e 12 indivíduos saudáveis ​​foram selecionados usando a plataforma Agilent Human miRNA Microarray interrogando 2549 miRNAs. Curvas Receiver Operating Characteristic (ROC) foram construídas para avaliar o desempenho diagnóstico dos miRNAs desregulados. Os níveis de expressão dos miRNAs selecionados foram validados por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) em todas as amostras de soro e cartilagem articular de pacientes com OA (n = 12) e indivíduos saudáveis ​​(n = 7). A análise de bioinformática foi usada para investigar as vias envolvidas e genes alvo para os miRNAs acima.

Resultados

Identificamos 279 miRNAs diferencialmente expressos no soro de pacientes com OA em comparação com os controles. Duzentos e cinco miRNAs (73,5%) foram regulados positivamente e 74 (26,5%) regulados negativamente. A análise ROC revelou que 77 miRNAs tinham área sob a curva (AUC) & gt 0,8 e p & lt 0,05. A análise de bioinformática nos 77 miRNAs revelou que seus genes-alvo estavam envolvidos em múltiplas vias de sinalização associadas com OA, entre as quais FoxO, mTOR, Wnt, pI3K / akt, vias de sinalização TGF-β, interação ECM-receptor e biossíntese de ácidos graxos. A validação de qRT-PCR em sete selecionados dos 77 miRNAs revelou 3 miRNAs significativamente regulados para baixo (hsa-miR-33b-3p, hsa-miR-671-3p e hsa-miR-140-3p) no soro de pacientes com OA, que foram previstos in silico para serem enriquecidos em vias envolvidas em processos metabólicos. A análise do gene-alvo de hsa-miR-140-3p, hsa-miR-33b-3p e hsa-miR-671-3p revelou que InsR e IGFR1 foram alvos comuns de todos os três miRNAs, destacando seu envolvimento na regulação dos processos metabólicos que contribuem para a patologia da OA. Os níveis de expressão de Hsa-miR-140-3p e hsa-miR-671-3p foram consistentemente regulados para baixo na cartilagem articular de pacientes com OA em comparação com indivíduos saudáveis.

Conclusões

Uma assinatura de miRNA de soro foi estabelecida pela primeira vez usando miR-arrays de resolução de alta densidade em pacientes com OA. Identificamos uma assinatura de três miRNAs, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-671-3p e hsa-miR-33b-3p, no soro de pacientes com OA, prevista para regular os processos metabólicos, que poderiam servir como um biomarcador potencial para a avaliação do risco e progressão da OA.


Dados Associados

As células estromais mesenquimais (hMSCs) exibem uma função pleiotrópica na regeneração óssea. A sinalização envolvida no comprometimento dos osteoblastos ainda não é totalmente compreendida, o que determina o insucesso das terapias atuais em uso. Em nossos estudos recentes, identificamos dois miRNAs como reguladores da diferenciação de osteoblastos hMSCs, direcionando a sinalização de hipóxia e a reorganização do citoesqueleto. Outras sinalizações envolvidas neste processo são a transição epitelial para mesenquimal (EMT) e as sinalizações do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) por meio da regulação da expressão da proteína associada a Sim (YAP) / motivo de ligação ao PDZ (TAZ). No presente estudo, investigamos o papel da família miR-33a como um (i) modulador da expressão de YAP / TAZ e (ii) um regulador da sinalização de EGFR durante comprometimentos de osteoblastos. A partir da observação em hMSCs e linhas celulares de osteoblastos primários (Nh-Ost) em que os genes EMT e miR-33a exibiram uma expressão específica, realizamos um estudo de ganho e perda de função com miR-33a-5p e 3p em células hMSCs e Nh-Ost. Após 24 horas de transfecções, avaliamos a modulação da expressão dos genes EMT e osteoblastos por qRT-PCR, Western blot e ensaios de Osteoimage. Por meio da análise bioinformática, identificamos o YAP como o alvo putativo do miR-33a-3p. Seu papel foi investigado por estudos de ganho e perda de função com miR-33a-3p em hMSCs qRT-PCR e análises de Western blot também foram realizadas. Finalmente, o possível papel da sinalização de EGFR na modulação de YAP / TAZ pela expressão de miR-33a-3p foi avaliado. MSCs humanas foram tratadas com EGF-2 e inibidor de EGFR para diferentes pontos de tempo, e qRT-PCR e análises de Western blot foram realizadas. Os métodos mencionados acima revelaram um equilíbrio entre a expressão de miR-33a-5p e miR-33a-3p durante a diferenciação de osteoblastos de hMSCs. O fenótipo de MSCs humanas foi mantido por miR-33a-5p, enquanto a manutenção do fenótipo de osteoblasto no modelo de célula Nh-Ost foi permitida pela expressão de miR-33a-3p, que regulou YAP / TAZ por meio da modulação da sinalização de EGFR. A inibição do EGFR bloqueou os efeitos do miR-33a-3p na modulação YAP / TAZ, favorecendo a manutenção de hMSCs em um fenótipo comprometido. Uma nova abordagem terapêutica personalizada possível para a regeneração óssea foi discutida, que pode ser mediada pela personalização da entrega de miR-33a ao direcionar simultaneamente a sinalização de EGFR e YAP com o uso combinado de drogas.


Introdução

A carne suína é uma das carnes mais consumidas no mundo, sendo a qualidade da carne uma característica relevante tanto para a indústria da carne quanto para o consumidor. Entre as características de qualidade da carne, o teor de gordura intramuscular (FMI) e a composição de ácidos graxos (FA) determinam não apenas o sabor, maciez, firmeza e suculência da carne, mas também a salubridade do produto [1, 2]. Além disso, o porco é considerado um bom modelo animal para pesquisas biomédicas devido às suas semelhanças com os humanos, e tem sido usado para identificar alvos de drogas contra doenças humanas, como a obesidade [3].

Fígado, tecido adiposo e músculo esquelético são os principais órgãos metabólicos envolvidos na regulação do metabolismo lipídico e, portanto, desempenham um papel importante na determinação do conteúdo de FMI e composição de AF. Em porcos, o fígado participa da síntese e secreção de proteínas de densidade muito baixa, de novo síntese de colesterol e β-oxidação de ácidos graxos. Além disso, o fígado e o tecido adiposo estão envolvidos na síntese de novo de ácidos graxos [4], com maior contribuição do tecido adiposo. Além disso, o tecido adiposo é um órgão que atua no armazenamento de lipídios e na manutenção da homeostase metabólica, sendo a principal fonte de AGs livres circulantes [5, 6]. O músculo é um local importante para a captação e armazenamento de glicose, e um reservatório de aminoácidos, usado para a síntese de proteínas e produção de energia [7]. As vias do metabolismo lipídico têm regulação cruzada entre o fígado, tecido adiposo e músculo e têm sido extensivamente estudadas.

Além da regulação da expressão gênica transcricional, os microRNAs (miRNAs) surgiram como importantes reguladores pós-transcricionais dos genes envolvidos no metabolismo lipídico em diferentes tecidos suínos [8]. miRNAs são pequenas moléculas de RNA que impedem a produção de proteínas ou degradam o mRNA [9]. Eles desempenham papéis importantes em diversas vias regulatórias de muitos processos celulares e doenças. Membros da família miR-33, que inclui mir-33a e mir-33b, estão localizados em fator de transcrição de ligação de elemento regulador de esterol 2 (SREBF2) íntron 13 e SREBF1 intron 16, respectivamente, e foram relatados como co-transcritos com seus genes hospedeiros. Os fatores de transcrição SREBP são reguladores mestres bem conhecidos da homeostase lipídica. SREBF1 regula os genes envolvidos principalmente no metabolismo dos ácidos graxos, enquanto SREBF2 regula os genes envolvidos na biossíntese e absorção do colesterol [10, 11]. As sequências miR-33a / b de porco diferem apenas em três nucleotídeos, têm a mesma sequência semente e são conservadas com os genes homólogos humanos. Em linha com as funções regulatórias de seus genes hospedeiros, o miR-33b humano foi relatado para regular a via de sinalização da insulina e a síntese de glicose, que afetou as vias de gliconeogênese [12, 13], e o miR-33a esteve envolvido na regulação dos genes do colesterol síntese [14, 15]. Em porcos, apenas o miR-33b foi relatado como desempenhando um papel importante na adipogênese e na lipogênese no tecido adiposo [16].

O objetivo deste trabalho foi estudar a expressão de miR-33a e miR-33b, juntamente com seu hospedeiro SREBF genes, nos três principais tecidos metabólicos, fígado, tecido adiposo e músculo, e o efeito de ambos os genes miR-33 na composição de AG medidos em músculo e tecido adiposo, para melhor compreender seu papel no metabolismo lipídico em suínos.


Avaliação dos níveis circulantes de miR-122, miR-30c e miR-33a e sua associação com lipídios, lipoproteínas na lipemia pós-prandial

A lipemia pós-prandial é caracterizada por um aumento nas lipoproteínas ricas em triglicerídeos após refeições gordurosas. MicroRNAs (miRs) desempenham papéis importantes no metabolismo de lipídios e lipoproteínas. O objetivo deste estudo foi determinar a relação entre os níveis de expressão de miR plasmático e proteínas relacionadas ao metabolismo de lipoproteínas em indivíduos com resposta pós-prandial normal (NPR) e alta (HPR) no período pós-prandial.

Materiais e métodos

O teste de tolerância à gordura oral foi aplicado a 22 indivíduos com NPR e 22 com HPR.

Principais conclusões

Expressões aumentadas de miR-122 e miR-33a e razão miR-122 / 30c e expressão diminuída de miR-30c foram observadas em jejum e período pós-prandial de HPR em comparação com NPR. A análise da curva ROC mostrou que a razão miR-122 / 30c é um bom biomarcador para lipemia pós-prandial (AUC: 0,97, p & lt 0,001). Os níveis de TG, MTTP e Apo B-48 e tamanho de partícula de quilomícrons (CM) foram significativamente maiores em HPR do que em NPR (p & lt 0,05). A razão miR-122 / 30c em 2 h foi positivamente correlacionada com o tamanho de partícula CM e com os níveis de TG, MTTP e Apo B-48 na 4ª hora. A expressão de miR-33a diminuiu em HPR e foi negativamente correlacionada com os níveis de ABCA1 e Apo A-1 na 4ª hora do período pós-prandial em ambos os grupos.

Significado

O aumento dos níveis de expressão de miR-122 e diminuição dos níveis de expressão de miR-30c em HPR podem desempenhar papéis críticos na lipemia pós-prandial elevada ou prolongada. A razão miR122 / 30c exibiu boa associação com os níveis de MTTP, Apo B-48 e TG, e com o tamanho de partícula CM, e pode ser um marcador confiável para avaliar a lipemia pós-prandial. miR-33a também pode desempenhar um papel fundamental na diminuição do HDL-C na lipemia pós-prandial.


B-RCA revelou circulantes de miR-33a / b associados ao colesterol sérico em pacientes com diabetes tipo 2 com alto risco de ASCVD

O diabetes tipo 2 (T2D) é uma doença metabólica complexa com alta incidência em todo o mundo. A dislipidemia é a principal causa de doenças cardiovasculares ateroscleróticas (ASCVD) em pacientes com DM2. hsa-miR-33 (miR-33) atua como um regulador do metabolismo lipídico. Nossa hipótese é que o miR-33 sanguíneo está associado aos lipídios séricos em pacientes com DM2 com alto risco de eventos ASCVD.

Métodos

Desenvolvemos um método de amplificação por círculo rolante ramificado (B-RCA) e avaliamos sua sensibilidade e especificidade com padrões miR-33a / b pelo ensaio TaqMan tradicional. O nível circulante de miR-33a / b foi então determinado com B-RCA em 30 pacientes com DM2 com alto risco de desenvolver ASCVD e 33 controles saudáveis. O coeficiente de correlação de Pearson foi usado para avaliar a correlação entre o miR-33a / b circulante e o colesterol sérico.

Resultados

Comparado com o ensaio TaqMan, o método B-RCA mostrou uma especificidade semelhante e uma sensibilidade 100 vezes maior para a detecção de miR-33a. O nível circulante de miR-33a / b está positivamente correlacionado com o colesterol total sérico (TC) (r = 0,364, p = 0,048) e colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-C) (r = 0,383, p = 0,037) em pacientes T2D em alto risco de desenvolver ASCVD.

Conclusões

Nosso método B-RCA forneceu uma estratégia alternativa com especificidade e alta sensibilidade para detecção de miRNAs circulantes, e os resultados demonstraram que miR-33a / b pode desempenhar um papel importante na regulação do colesterol.


Identificação de papéis diferenciais de MicroRNA & # x201033a e & # x201033b durante a progressão da aterosclerose com camundongos geneticamente modificados

Micro RNA (miR) ‐33 tem como alvo a proteína A1 do cassete de ligação ao ATP do transportador de colesterol e outros alvos antiaterogênicos e contribui para a progressão aterogênica. Sabe-se que sua inibição ou deleção resulta na melhora da aterosclerose em camundongos. No entanto, os camundongos não têm o outro membro da família miR-33, miR-33b, que existe em humanos e outros grandes mamíferos. Assim, avaliação precisa e comparação das responsabilidades desses 2 miRs durante a progressão da aterosclerose não foram relatadas, embora sejam essenciais.

Métodos e Resultados

Neste estudo, realizamos uma análise abrangente da diferença entre a função de miR-33a e miR-33b usando camundongos geneticamente modificados. Geramos 4 cepas com ou sem miR-33a e miR-33b. A comparação entre camundongos com apenas miR-33a (camundongos de tipo selvagem) e camundongos com apenas miR-33b (miR-33a - / - / miR-33b + / +) revelou a expressão dominante de miR-33b no fígado. Para avaliar a potência aterogênica de todo o corpo de miR-33a e miR-33b, desenvolvemos apolipoproteína E-deficiente / miR-33a + / + / miR-33b - / - camundongos e apolipoproteína E-deficiente / miR-33a - / - / Camundongos miR-33b + / +. Com uma dieta rica em gordura e colesterol, os camundongos deficientes em apolipoproteína E / miR ‐ 33a - / - / miR ‐ 33b + / + desenvolveram placa aterosclerótica aumentada contra deficiência de apolipoproteína E / miR ‐ 33a + / + / miR‐ Camundongos 33b - / -, em linha com a expressão predominante de miR-33b no fígado e perfil de colesterol sérico piorado. Em contraste, um estudo de transplante de medula óssea não mostrou nenhuma diferença significativa, o que foi consistente com os níveis de expressão relevantes de miR-33a e miR-33b em células da medula óssea.

Conclusões

A família miR-33 exibe diferenças na distribuição e regulação e, particularmente na progressão da aterosclerose, miR-33b seria mais potente do que miR-33a.

Perspectiva Clínica

O que há de novo?

Este é o primeiro relatório da avaliação da aterogenicidade de microRNAs (miR-33a e miR-33b) separadamente in vitro e in vivo usando camundongos geneticamente modificados. Descobrimos que o miR-33b apresentou potencial aterogênico aumentado.

Ambos miR-33a e miR-33b mostraram expressão diferencial em vários órgãos e foram regulados de forma antagônica pela carga de colesterol em todo o corpo.

O miR-33b mostrou expressão dominante no fígado e sua expressão foi aumentada em resposta à sobrecarga de colesterol. Isso resultou no aumento da aterogenicidade sob dieta rica em gordura e colesterol em camundongos deficientes em apolipoproteína E / miR-33a - / - / miR-33b + / +.

Quais são as implicações clínicas?

A inibição do miR-33 é considerada uma terapia antiaterogênica promissora. Como a deleção completa do miR-33 causa obesidade e fígado gorduroso em camundongos, a inibição específica do miR-33b pode servir como uma abordagem alternativa para a inibição terapêutica do miR-33.

As estatinas reduziram o número total de cópias miR-33 hepáticas em camundongos. Pode ser uma das causas potenciais de pleiotropia de estatinas.

Introdução

A doença aterosclerótica é uma das principais causas de morte em todo o mundo. Embora muitas vias biológicas estejam envolvidas na patogênese da aterosclerose, a homeostase do colesterol desempenha um papel importante na progressão da doença. A terapia para baixar o colesterol, especialmente com estatinas, é a terapia mais comum para reduzir o risco e a progressão da aterosclerose. 1 No entanto, vários estudos clínicos indicam a existência de “riscos residuais”, principalmente consistindo em diminuição do colesterol 2, 3 da lipoproteína de alta densidade (HDL) e aumento dos níveis de triglicerídeos. 4, 5 HDL ou HDL-colesterol é o componente mais importante do transporte reverso do colesterol, que é a única via no corpo humano para excretar o colesterol do corpo. Os resultados de pesquisas recentes destacam a importância não apenas da quantidade, mas também da qualidade do HDL / HDL-colesterol na progressão da aterosclerose. 6 Como a terapia moduladora do colesterol HDL / HDL é uma abordagem terapêutica promissora para a doença aterosclerótica, pesquisas rigorosas são necessárias.

MicroRNAs (miRs) são uma classe de RNAs curtos e não codificadores que afetam muitas vias biológicas ao reprimir a expressão de genes codificadores tanto transcricionalmente quanto pós-transcricionalmente. 7 Foi demonstrado que vários miRs estão envolvidos nas vias biológicas e afetam a patogênese. Notavelmente, nós e outros grupos demonstramos anteriormente que o miR-33 afeta potencialmente muitas vias biológicas, incluindo a homeostase do colesterol. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 A deleção ou inibição in vivo de miR-33 usando oligonucleotídeo antisense melhorou o perfil de colesterol sérico e aumentou o transporte reverso de colesterol não apenas de camundongos, mas também primatas não humanos. Essas mudanças favoráveis ​​no perfil do colesterol sérico ou no transporte reverso do colesterol reduziram a progressão da placa aterosclerótica em camundongos. 11, 14 Essas observações sugerem miR-33 como um potencial alvo terapêutico da aterosclerose.

No entanto, muitos desafios devem ser superados antes que a aplicação clínica da terapia anti-miR-33 seja realizada. Primeiro, nós e outros grupos descobrimos que a deleção in vivo de miR-33 resulta em obesidade e tolerância à glicose prejudicada em camundongos, 17, 18 o que poderia ser um efeito adverso potencial da terapia anti-miR-33. Além disso, o genoma humano abriga miR-33b no íntron 16 do fator de ligação ao elemento regulador de esterol (SREBF) 1, como um parálogo de miR-33a (Figura 1A). Essas sequências miR são quase as mesmas, exceto na posição 9 e 10 do nucleotídeo imediatamente após as sequências de sementes (Figura 1B). Notavelmente, o camundongo, que é o modelo animal mais convencional de aterosclerose, carece de miR-33b. Assim, a assinatura do gene alvo, o padrão de expressão espaço-temporal e a regulação ambiental do miR-33b permanecem amplamente desconhecidos. Uma investigação mais aprofundada das diferenças e semelhanças entre miR-33a e miR-33b in vivo é essencial para confirmar a eficácia e segurança da terapia anti-miR-33.

Figura 1. Semelhanças e diferenças entre microRNAs (miR-33a e miR-33b). UMA, Loci genômicos do fator de ligação ao elemento regulador de esterol (SREBF) 2 / miR-33a e SREBF 1 / miR-33b no genoma humano. B, Sequência de referência, sequência de semente e sequência de direcionamento de miR-33a e miR-33b. UTR indica região não traduzida.

Neste estudo, avaliamos as diferenças entre miR-33a e miR-33b in vitro e in vivo usando miR-33a knockout e miR-33b knockout geneticamente modificado em camundongos (KI), relatados anteriormente. 10, 19 As distribuições de órgãos desses 2 miRs eram diferentes. Em particular, os 2 órgãos mais responsáveis ​​pela aterosclerose, macrófagos e fígado, mostraram padrões distintos de distribuição de miR-33a ou miR-33b. Além disso, por meio da modificação da carga de colesterol na dieta, descobrimos que esses 2 miRs são estrita e distintamente regulados pela carga de colesterol. Em particular, miR-33b foi induzido por alto teor de gordura e colesterol na dieta, que é uma composição comum das dietas atuais e é considerada aterogênica. No geral, os camundongos deficientes em apolipoproteína E (ApoE - / -) com apenas miR-33b mostraram maior carga aterosclerótica do que os camundongos ApoE - / - com apenas miR-33a. Esses dados sugerem que o miR-33b é um alvo terapêutico mais potente do que o miR-33a durante a progressão da aterosclerose.

Materiais e métodos

Animais

Nós cruzamos camundongos knockout para miR-33 previamente gerados e camundongos miR-33b KI e obtivemos 4 camundongos geneticamente modificados. Neste artigo, denominamos miR ‐ 33a + / + e miR ‐ 33b - / - como miR ‐ 33 do tipo selvagem (WT) camundongos e miR ‐ 33a - / - e miR ‐ 33b + / + como miR ‐ 33 knock out camundongos knock in (KOKI). Usamos camundongos machos para todos os experimentos, exceto para experimentos de transplante de medula óssea. Para avaliar o padrão de expressão de miR-33a e miR-33b com dieta do tipo ocidental (WTD) contendo 0,15% de colesterol e 40% de gordura (Oriental Yeast, Japão), alimentamos camundongos miR-33b KI com 8 semanas de idade com WTD por 4 semanas. Para experimentos de redução do colesterol, camundongos miR-33b KI foram colocados em WTD e na segunda semana, 10 mg / kg de peso corporal de pitavastatina (KOWA, Japão) e ezetimiba (Santa Cruz, TX) dissolvidos em carboximetilcelulose foram administrados por gavagem oral a cada 24 horas por 7 dias. Os camundongos foram sacrificados 24 horas após a última administração. Para a análise da formação da placa, também obtivemos os camundongos ApoE - / - miR-33a WT e ApoE - / - miR-33 KOKI por cruzamento. Estes ratos são desmamados com 4 semanas de idade e alimentados com ração normal (fermento oriental) e mudados para WTD com 6 semanas de idade, até 18 semanas de idade. As seções congeladas da raiz da aorta foram coradas com óleo ‐ red O, picrosirius red, anticorpo anti ‐ CD68 (1 μg / mL) e cassete de ligação anti ‐ ATP A1 (ABCA1 2 μg / mL NB400‐105 Novus Biologicals) e a área positiva foi quantificado pelo Adobe Illustrator e o script R interno. Os primers da reação em cadeia da polimerase (PCR) usados ​​na PCR de genotipagem são fornecidos na Tabela S1. Os camundongos foram sacrificados pela injeção IP de pentobarbital (50 mg / kg de peso corporal Kyoritsu Seiyaku, Japão), seguido por deslocamento cervical. A anestesia foi obtida por inalação contínua de sevoflurano ou injeção IP de anestesia mista consistindo em medetomidina (0,3 mg / kg de peso corporal Nihon Zen ‐ yaku, Japão), midazolam (4 mg / kg de peso corporal Sandoz, Japão) e butorfanol (4 mg / kg de peso corporal Meiji Seika Pharma, Japão). Este estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão de Ética da Universidade de Kyoto. Todos os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes relevantes.

Cultura de células

Os hepatócitos primários foram obtidos de camundongos knockout para miR-33 pelo método de perfusão com colagenase. Fígados de camundongos foram lisados ​​por perfusão retrógrada com colagenase tipo II (Worthington, OH). A suspensão de células foi passada por um filtro de células de 70 μm e centrifugada para isolar hepatócitos maduros. Os hepatócitos foram semeados em placas revestidas com colágeno tipo I a uma densidade de 2,5 × 10 5 células / mL em glicose média baixa de Eagle modificada por Dulbecco (Nacalai Tesque, Japão) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS). Macrófagos peritoneais primários de camundongos foram obtidos de miR-33 WT, miR-33a knockout, miR-33b KI e camundongos miR-33 KOKI por lavagem intraperitoneal com solução salina tamponada com fosfato frio (PBS) 72 horas após a administração intraperitoneal de 3% ( w / v) tioglicolato. Os macrófagos foram ressuspensos em meio RPMI 1640 (Nacalai Tesque) contendo 10% de FBS e semeados a uma densidade de 5,0 × 10 5 células / mL. As células Hep ‐ G2 foram cultivadas com DMEM suplementado com FBS a 10% a uma densidade de 1,0 × 10 6 células / mL. Para experimentos de depleção de colesterol, o meio foi substituído por DMEM contendo 10% de soro pobre em lipoproteínas e 10 nmol / L de pitavastatina.

Análise de expressão gênica por PCR quantitativo em tempo real

O RNA total foi isolado usando o reagente TriPure (Sigma-Aldrich, MO) de órgãos ou células. Para os genes codificadores, o cDNA foi sintetizado usando um kit de síntese de cDNA Verso (Thermo Fisher Scientific, MA) e a PCR quantitativa em tempo real foi realizada com THUNDERBIRD SYBR qPCR MIX (TOYOBO, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. Os níveis de expressão foram normalizados usando o nível de expressão de β-actina. Os primers usados ​​neste estudo estão listados na Tabela S2. Para miR, PCR quantitativo foi realizado usando TaqMan MicroRNA Assays (Applied Biosystems, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Os níveis de expressão foram normalizados pela expressão de pequeno RNA nuclear U6 ou quantificados pelo método da curva padrão. Ambas as análises foram realizadas usando um sistema de PCR em tempo real StepOnePlus (Applied Biosystems).

Western Blotting

A análise de Western blotting foi realizada conforme descrito anteriormente. 17 As proteínas foram fracionadas usando géis NuPAGE 4% a 12% Bis-Tris (Invitrogen) e transferidas para a membrana de transferência de nitrocelulose Protran (Whatman, Japão). A membrana foi bloqueada usando PBS contendo 5% de leite desnatado por 30 minutos em temperatura ambiente e incubada com o anticorpo primário (anti ‐ ABCA1: 1: 2000, NB400‐105 anti ‐ ABCG1 (cassete de ligação anti ‐ ATP G1): 1: 2000 , NB400-132 [Novus Biologicals, CO], anti-carnitina palmitoiltransferase Ia: 1: 2000, ab128568 [Abcam, UK] anti-β-actina: 1: 3000, A5441 [Sigma-Aldrich]) durante a noite a 4 ° C. A membrana foi lavada em PBS contendo 0,05% de Tween-20 e, em seguida, foi incubada com o anticorpo secundário (anti-IgG de coelho peroxidase de rábano ligada: 1: 2000 anti-IgG de camundongo peroxidase de rábano ligada: 1: 2000 [GE Healthcare, Reino Unido ]) por 30 minutos em temperatura ambiente. A membrana foi lavada em PBS contendo 0,05% de Tween ‐ 20 e incubada com ECL Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare) por 5 minutos, em seguida, o sinal foi detectado usando um sistema LAS ‐ 4000 (Fuji Film, Japão).

Teste de tolerância à glicose e insulina

Para o teste de tolerância à glicose, camundongos miR-33 WT com 12 semanas de idade e camundongos miR-33 KOKI passaram fome durante a noite, em seguida, 1,0 g / kg de peso corporal de glicose foi administrado por injeção IP. Para o teste de tolerância à insulina, os camundongos miR-33 WT e os camundongos miR-33 KOKI passaram fome por 4 horas, em seguida, 1 U / kg de peso corporal de insulina foi administrado por injeção IP. O sangue foi obtido da cauda cortada e as concentrações de glicose foram medidas por um sensor de glicose em cada momento.

Análise Metabolômica

As amostras de fígado de camundongos KI, nocaute ou KI miR-33 de 8 semanas de idade foram submetidas a eletroforese capilar - espectrometria de massa de tempo de vôo, eletroforese capilar - espectrometria de massa de quadrupolo triplo e cromatografia líquida de massa de tempo de vôo análises de espectrometria (Agilent, Palo Alto, CA) e quantificadas por Human Metabolome Technologies, Inc.

Análise da Via de Integração do Metabólito Alvo miR

Metabólitos significativamente desregulados no fígado de camundongos miR-33 KI foram determinados por t teste para abundância de metabólitos transformados em log. Para integrar as informações do gene alvo miR-33, baixamos o site alvo miR-33 previsto do mouse do site TargetScan (http://www.targetscan.org/mmu_71). Realizamos a análise da via integrada do metabólito do gene pela estrutura de análise do nível da via molecular integrada (http://impala.molgen.mpg.de/impala/), introduzindo esses metabólitos desregulados e alvos miR-33 previstos. Vias com uma taxa de descoberta falsa & lt0,05 são mostradas.

Análise do transcriptoma miR nos camundongos Knockout miR-33

O RNA total do fígado foi extraído de camundongos knockout para miR-33 com 8 semanas de idade e camundongos WT usando o reagente TriPure de acordo com as instruções do fabricante. A análise do transcriptoma miR inteiro foi realizada usando o chip miRNA Oligo (mouse, v19 TORAY, Japão).

Análise transcriptômica de hepatócitos primários transfectados por miR

24 horas após a incubação em DMEM suplementado com 10% de FBS, os hepatócitos primários foram transfectados com miR-33a, miR-33b ou controle-miR mimetizador (Thermo Fisher Scientific) a uma concentração de 30 nmol / L usando Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante. O RNA total foi extraído com o reagente TriPure de acordo com as instruções do fabricante. A análise de todo o transcriptoma foi realizada usando GeneChipMouseGene2.0ST Arrays (Affymetrix, CA). 3′-Sequências da região não traduzida foram obtidas do bioMart (https://www.ensembl.org/biomart) e analisadas usando um script interno. A análise de enriquecimento do motivo foi realizada usando o software Sylamer. 20 As diferenças dos padrões de expressão entre os transcritos com diferentes motivos de direcionamento miR-33 foram testados pelo teste de Kolmogorov-Smirnov.

Efluxo de colesterol via soro empobrecido de apolipoproteína B de camundongo

A capacidade de efluxo de colesterol do soro empobrecido de apolipoproteína B de camundongo foi medida como descrito anteriormente. 21 Resumidamente, células de macrófagos de camundongo J774 foram semeadas a uma densidade de 7 × 10 4 células / poço em uma placa de 24 poços. Essas células foram marcadas com 2 μCi / mL de 3 H ‐ colesterol por 24 horas em meio RPMI 1640 com FBS a 1%. Em seguida, as células foram incubadas por 16 horas em meio RPMI 1640 contendo 8‐ (clorofeniltio) adenosina 3 ′, 5 ‐ monofosfato cíclico (0,3 mmol / L) e BSA 0,2% para regular ABCA1 em células J774. Após lavagem 4 vezes com meio RPMI 1640, as células foram incubadas com soro contendo soro de rato empobrecido com apolipoproteína B a 2,8%. A depleção da apolipoproteína B foi obtida pelo polietilenoglicol. As propriedades de extração do colesterol foram quantificadas como a porcentagem de radioatividade das células dividida pela radioatividade total das células e do meio.

Efluxo de colesterol de macrófagos peritoneais de camundongo

O efluxo de colesterol celular via apolipoproteína A-1 e HDL foi determinado conforme descrito anteriormente. 10 Resumidamente, macrófagos peritoneais de camundongos induzidos por tioglicolato foram semeados em placas de 48 poços (2,5 × 10 6 células / mL) e foram cultivados por 24 horas em meio RPMI 1640 contendo lipoproteína de baixa densidade acetilada marcada com 3 H (1,0 μCi / mL) de 3 H ‐ colesterol e 25 μg / mL de lipoproteína de baixa densidade acetilada Biomedical Technologies Inc, MA). As células foram lavadas 4 vezes com meio e, em seguida, incubadas por 6 horas em meio RPMI 1640 com ou sem apolipoproteína A-1 e HDL nas concentrações indicadas. O efluxo de colesterol foi expresso como uma porcentagem da radioatividade liberada das células no meio em relação à radioatividade total nas células e no meio.

Quantificação de colesterol e triglicerídeos no fígado de camundongo

Os lipídios do fígado foram extraídos pelo método de Folch, conforme descrito anteriormente. 17 Briefly, the lipids in the liver were extracted by addition of ice‐cold MeOH, followed by CHCl3. Water was added to the sample and incubated on ice for an additional 10 minutes, with occasional mixing. The sample was centrifuged for 5 minutes at 2000g, and the aqueous phase was discarded and reextracted by addition of ice‐cold CHCl3:MeOH (2:1, v/v). Organic phases were collected and dried under nitrogen stream. Lipids were quantified using the Cholesterol E‐test (WAKO, Japan) or Triglyceride E‐test (WAKO).

Bone Marrow Transplantation

Bone marrow transplantation experiments were performed using the same protocol as reported previously. 14 Eight‐week‐old male miR‐33 WT or miR‐33 KOKI mice were used as bone marrow donors. Recipients were 8‐week‐old miR‐33 WT female mice. All mice used for bone marrow transplantation experiments had an ApoE −/− background. After euthanasia by cervical dislocation, femurs and tibias of donor mice were flushed with PBS containing 3% FBS and bone marrow cells were collected. The cell suspension was passed through a 40‐μm cell strainer, and contaminating red blood cells were lysed using ACK lysing buffer (Lonza, Switzerland). Bone marrow cells were washed twice with 3% PBS and suspended in RPMI 1640 medium. For donor mice, to induce bone marrow aplasia, whole body irradiation was performed twice, using 6 Gy, within an interval of 3 hours ( 137 Cs Gammacell 40 Exactor), and prepared bone marrow cells were transferred by retro‐orbital injection with 5×10 6 bone marrow cells 6 hours after irradiation. Transplanted mice were placed on a standard normal diet for 4 weeks, and then switched to WTD for 12 weeks.

Reporter Assay

A complementary sequence of miR‐33a or miR‐33b was subcloned into psiCheck2 (Promega, WI) vector. Then, 50 ng of the reporter constructs was transfected into HepG2 cells with miR mimic at 1 nmol/L. At 24 hours after transfection, the cells were lysed and analyzed using a Piccagene dual luciferase reporter assay system (Toyo INK, Japan). Subsequently, 50 ng of liver‐X‐receptor (LXR) element reporter construct and sterol regulatory element reporter construct were transfected into HepG2 cells and incubated for 24 hours in the indicated medium composition.

Análise Estatística

Numerical data are expressed as the mean±SEM. In the dot plots, horizontal bars indicate mean±SEM. Two sample data sets were tested using a 2‐tailed Student t test or a Wilcoxon rank sum test. The normality was tested beforehand by the Kolmogorov‐Smirnov normality test. If deviation from normality was observed, we applied a nonparametric test for the data set. For multiple comparisons, one‐way analysis of variance followed by Tukey and Dunnett multiple comparisons was used. P<0.05 was considered statistically significant. Data analyses and statistical tests were performed using R, version 3.3.1, and Prism, version 6.0 (GraphPad Software).

Resultados

Similar Potential Target Repression and Targeting Motif of miR‐33a/b in Vitro

To explore the similarities and differences in the targeting potency, and the target motifs of miR‐33a and miR‐33b, we performed transcriptomic analysis of primary cultured hepatocytes transfected with synthetic miR‐33a, miR‐33b, and a control miR (Figure 2A). To avoid the effects of endogenous miR‐33, hepatocytes were obtained from miR‐33a −/− /miR‐33b −/− (referred to as miR‐33a knock‐out) mice that were generated previously. 9 The systemic miR expression remodeling in the liver of these mice was not observed (Figure S1). Hierarchical clustering analysis revealed that the gene expression signature of hepatocytes transfected with miR‐33a and miR‐33b formed a tight cluster that was distinct from the control (Figure 2B). To identify the difference between the target motifs, we performed the motif enrichment analysis in the 3′‐untranslated region (Figure 2C). We found that genes with miR‐33 canonical targeting sites were significantly repressed by synthetic miR‐33a and miR‐33b. However, we found no significantly repressed motifs in the comparison between miR‐33a and miR‐33b. This result suggested that miR‐33a and miR‐33b target virtually the same genes. These 2 synthetic miRs showed significant repression effects specifically on the genes with canonical miR‐33 targeting sites in the 3′‐untranslated region (Figure 2D). However, the repression potency of both these miRs showed no significant difference.

Figura 2. Transcriptomic analysis of targeting potency and targeting motifs in rodent primary hepatocytes. UMA, Experimental schema. B, Hierarchal clustering analysis of the expression pattern of primary hepatocytes. MicroRNAs (miR‐33a and miR‐33b) indicate miR‐33a or miR‐33b transfected primary hepatocytes. n=2 for each. C, Significantly suppressed motifs by synthetic miR transfection. miR‐33a vs miR‐control (deixou), miR‐33b/miR‐control (middle), and miR‐33a/miR‐33b (direito) Dotted lines indicate significant threshold after multiple testing correction. D, Suppression of mRNA s with or without miR‐33 target sites in their 3′‐untranslated region. P values were calculated using the Kolmogorov‐Smirnov test. 7‐mer‐A1 indicates CAAUGCA 7‐mer‐m8, AAUGCAA 8‐mer, CAAUGCAA KO, knock out.

Distinct Organ Distribution Patterns of miR‐33a and miR‐33b in Vivo

Because the targeting potency and targeting motif were relevant, we examined the spatial distributions of these 2 miRs. We obtained organs and thioglycolate‐elicited peritoneal macrophages from mice carrying the human miR‐33b sequence in Srebf1 intron 16 (miR‐33a +/+ /miR‐33b +/+ , referred to as miR‐33b knock in), which were reported previously. 19 We found distinct expression patterns of miR‐33a and miR‐33b in several organs (Figure 3A). In particular, in the 2 most atherosclerosis‐responsive organs, macrophages and liver, the expression patterns showed distinct contrasts. In peritoneal macrophages, miR‐33a and miR‐33b were relevant, but in the liver, miR‐33b showed higher copy number than miR‐33a. Each intronic miR is coexpressed with its host gene. The expression patterns of miR‐33a and miR‐33b were closely correlated with those of Srebf2 e Srebf1 expression, respectively. To confirm its relevance in humans, we analyzed the expression patterns of these host genes and miR‐33 family in FANTOM5 human primary cultured cells. 22 , 23 We also found distinct expression patterns of the miR‐33 family and significant correlation between SREBF2 ou SREBF1 and miR‐33a or miR‐33b (Figure 3B and 3C).

Figura 3. Organ expression patterns of microRNAs (miR‐33a and miR‐33b) and sterol regulatory element‐binding factor (Srebf) 1 and Srebf2. UMA, Absolute copy number of miR‐33a and miR‐33b (deixou) and correlations between the expression ratios of miR‐33a/miR‐33b and Srebf2/Srebf1 in organs of miR‐33b KI mice (direito) n=3 for each organ. B, miR‐33 family abundance in human primary culture cells. C, Correlations between Srebf2 and miR‐33a (deixou) and Srebf1 and miR‐33b (direito) expression levels in human primary cultured cells. Pearson's correlation coefficients (r) e P value were shown. Horizontal bars in the dot plots indicate mean±SEM. PMP indicates peritoneal macrophage WAT , white adipose tissue cpm, counts per million.

To dissect the functional difference in the different abundance of miR‐33a and miR‐33b in vivo, we generated 4 strains of mice in which miR‐33a and/or miR‐33b was specifically deleted by cross bleeding of miR‐33a knockout and miR‐33b KI mice (Figure 4A). These mice were born at mendelian ratio and did not show significant differences in body weight or liver weight (Figure 4B) at 8 weeks old. Previous studies confirmed the role of the miR‐33 family in cholesterol metabolism. Therefore, we assessed the serum cholesterol profile of these 4 strains of mice (Figure 4C). The level of serum HDL‐cholesterol was the highest in miR‐33a knockout mice and lowest in miR‐33b KI mice, as expected. Interestingly, the miR‐33a −/− /miR‐33b +/+ (referred to as miR‐33 KOKI) mice showed significantly decreased serum HDL‐cholesterol levels compared with miR‐33a +/+ /miR‐33b −/− (referred to as miR‐33 WT) mice by ≈30%, and as low as miR‐33b KI mice. Hereafter, we mainly compared WT with KOKI mice because we want to clarify the in vivo functional difference between miR‐33a and miR‐33b. We assessed the absolute quantity of miR‐33 family in the liver and found dominant abundance of miR‐33b (Figure 4D). Although the expression of host genes was similar, the confirmed miR‐33 target genes were significantly repressed (Figure 4E through 4G). In addition, we noticed a slightly reduced LDL‐cholesterol level in miR‐33 KOKI than miR‐33 WT mice however, genes involved in LDL‐cholesterol metabolism showed no significant difference between miR‐33 KOKI and miR‐33 WT mice (Figure 4H).

Figura 4. Generation, phenotype, and gene expression of microRNA (miR)‐33 wild‐type ( WT ) and miR‐33 knock out knock in ( KOKI ) mice. UMA, Representative polymerase chain reaction ( PCR ) genotyping results and nomenclatures of the 4 strains of mice. B, Body and liver weight of 8‐week‐old miR‐33 4 strain mice. n=5 for knockout, n=5 for WT , n=6 for KOKI , and n=6 for KI for body weight. n=5 for knockout, and n=4 for WT , KOKI , and KI for liver weight. C, Serum lipid levels of the 4 strains of mice. n=13 for knockout, n=24 for WT , n=24 for KOKI , and n=14 for KI . D, Absolute copy number of miR‐33a and miR‐33b in miR‐33 WT mice and miR‐33 KOKI mice liver. n=4 for each. E, Quantitative PCR analysis for miR‐33 host and target genes in the liver. F, Densitometric analysis of Western blotting of miR‐33 target genes in the liver. G, Representative Western blotting images of miR‐33 target genes in the liver. H, Quantitative PCR analysis for low‐density lipoprotein‐cholesterol (LDLC) related genes in the liver. n=5 for WT , and n=6 for KOKI . Horizontal bars in the dot plots indicate mean±SEM. ABCA indicates ATP‐binding cassette A HDLC, high‐density lipoprotein‐cholesterol T‐Chol, total cholesterol ACTB, Beta acitin CPT, Carnitine Palmitoyltransferase KO, Knock out TG, Triglyceride. *P<0.05 compared with WT .

As previous reports suggested the roles of miR‐33 in glucose homeostasis, we assessed glucose and insulin tolerance of the 2 strains of mice as potential atherogenic factors. We found significantly impaired glucose tolerance and decreased insulin sensitivity (Figure 5A) of miR‐33 KOKI mice than miR‐33 WT mice. In addition, we performed metabolomic analysis of the liver tissue in miR‐33 knockout, miR‐33 KI, and WT mice. We found that a greater number of metabolites showed different abundance compared with miR‐33 WT in the miR‐33 KI mice liver than miR‐33 knockout mice liver (Figure 5B). To characterize the metabolomic changes caused by miR‐33b, we also performed integrated pathway enrichment analysis of these metabolites and miR‐33 target genes. We identified several pathways on which these metabolites and miR‐33 target genes were enriched. These pathways included glucose homeostasis related pathways (Figure 5C and Figures S2 through S4).

Figura 5. Impaired glucose tolerance and dysregulated liver metabolites in microRNA (miR)‐33 knock out knock in ( KOKI ) mice. UMA, Glucose and insulin tolerance of miR‐33 wild‐type ( WT ) and miR‐33 KOKI mice. n=6 for WT , and n=5 for KOKI . *P<0.05 compared with WT . B, Number of significantly dysregulated metabolites for miR‐33 knockout mice compared with WT and miR‐33b KI mice compared with WT mice. n=6 for each. *P<0.05 compared with knockout (tested by Fisher's exact test). C, Significantly dysregulated pathways in miR‐33b KI mice liver. Horizontal bars in the line chart or dot plots indicate mean±SEM. AMPK indicates AMP kinase AUC, area under the curve FDR , false discovery rate IPGTT , intraperitoneal glucose tolerance test IPITT , intraperitoneal insulin tolerance test KO, Knock out.

Relevant Functions of miR‐33a and miR‐33b in Macrophages

Because miR‐33 in macrophages was also shown to be responsible for atherosclerosis, especially by repressing cholesterol reverse transport, we assessed the function of macrophages, where the abundance of miR‐33a and miR‐33b was relevant (Figure 3A). To assess the functional differences in macrophages obtained from these 4 strains of mice, we performed cholesterol efflux experiments. The experiments confirmed the similar functionality of macrophages obtained from miR‐33 WT and miR‐33 KOKI mice (Figure 6A). Supporting this result, gene expression analysis confirmed no significant difference in the expression of Abca1 ou Abcg1 in macrophages obtained from miR‐33 KOKI mice compared with miR‐33 WT mice (Figure 6B and 6C). Although previous reports also suggested the participation of miR‐33 in macrophage inflammatory phenotypes, 15 , 16 inflammatory gene expression patterns were similar between macrophages obtained from miR‐33 KOKI mice compared with miR‐33 WT mice (Figure 6D).

Figura 6. Similar characteristics of peritoneal macrophages obtained from microRNA (miR)‐33 wild‐type ( WT) and miR‐33 knock out knock in ( KOKI ) mice. UMA, Cholesterol efflux to high‐density lipoprotein ( HDL ) or apolipoprotein A‐1 (ApoA‐1) from peritoneal macrophages from the 4 strains of mice. n=8 for each. B, Quantitative polymerase chain reaction ( PCR) analysis for miR‐33 target genes in the peritoneal macrophages. n=7 for each. C, Representative images of Western blotting analysis for miR‐33 target genes in the peritoneal macrophages. n=6 for each. D, Quantitative PCR analysis for inflammatory markers in the peritoneal macrophages. n=7 for each. Horizontal bars in the dot plots indicate mean±SEM. ABCA indicates ATP‐binding cassette A ABCG1, anti ATP binding cassete G1 ACTB, beta‐actin KO, Knock out. *P<0.05 compared with WT .

Regulation of the miR‐33 Family in Cholesterol‐Burdened Conditions

Intronic miRs are expressed concurrently with their host genes. Srebf2, the host gene of miR‐33a, is the master regulator of cholesterol homeostasis. Decreased cellular cholesterol content enhances the activity of the sterol regulatory element‐binding protein 2 and increases the expression of the sterol regulatory element‐binding protein 2 target genes. On the contrary, Srebf1, the host gene of miR‐33b, is regulated by transcriptional regulation through the LXR. The activity of the LXR axis is enhanced by increased cellular cholesterol content. To assess the effect of hypercaloric and hypercholesteric diet on the expression of miR‐33a and miR‐33b, we fed miR‐33b KI mice with WTD (Figure 7A). Feeding the miR‐33b KI mice with WTD for 4 weeks successfully induced a hypercholesterolemic state (Figure 7B), resulting in a reduction in Srebf2 expression and an increase in Srebf1 expression (Figure 7C). Corresponding to these changes in the expression of host genes, reduced miR‐33a and increased miR‐33b expression levels were observed in the liver (Figure 7D) and these changes were accompanied by changes in the expression patterns of sterol regulatory element‐binding protein 2/LXR target genes (Figure 7E).

Figura 7. Changes in liver gene expression in microRNA (miR)‐33b knock in ( KI ) mice in the cholesterol‐burdened condition. UMA, Experimental scheme and changes in body, liver, and epidydimal white adipose tissue (Epi WAT ) weight during experiment. B, Serum lipid profiles after 2 weeks of Western‐type diet (WTD) feeding experiment. Quantitative polymerase chain reaction analysis for sterol regulatory element‐binding factor (Srebf) 2 and Srebf1 (C) and miR‐33a and miR‐33b (D) in the liver under the cholesterol‐burdened condition. E, Heat map representation of liver gene expression levels of mice fed normal chow ( NC ) or WTD . n=3 for normal NC ‐fed mice, and n=4 for WTD ‐fed mice. Horizontal bars in the dot plots indicate mean±SEM. EC indicates esterified cholesterol FC , free cholesterol HDLC , high‐density lipoprotein‐cholesterol LDLC , low‐density lipoprotein‐cholesterol T‐Chol, total cholesterol TG, Triglyceride. *P<0.05 compared with NC ‐fed mice.

Regulation of the miR‐33 Family in Cholesterol‐Depleted Conditions

Cholesterol‐lowering treatment is the established therapeutic approach against atherosclerotic disease and is generally used in the clinical setting. In such conditions, the enhanced expression of miR‐33a was suggested however, there was no evidence of the kinetics of miR‐33b in such conditions. To assess changes in the expression of miR‐33a and miR‐33b under these conditions, we performed cholesterol‐lowering experiments in vivo. We administrated statin or vehicle orally to WTD‐fed miR‐33b KI mice (Figure 8A). Because the dietary cholesterol intake was not negligible in mice, we also administrated intestinal cholesterol absorption inhibitor, ezetimibe, simultaneously. This treatment effectively decreased serum LDL‐cholesterol levels without affecting the body, liver, and adipose tissue weight of WTD‐fed miR‐33b KI mice (Figure 8A and 8B) and it significantly repressed Srebf1 and miR‐33b expression in the liver (Figure 8C and 8D). Indeed, the miR‐33a expression levels were also significantly increased considering the prevalence of miR‐33b in the liver, the hepatic total miR‐33 copy number was significantly decreased by the treatment. Changes in cellular sterol regulatory element and LXR element signaling by statin treatment were also confirmed by reporter assays using the HepG2 human liver cell line (Figure 8E). These transcriptional changes in the miR‐33 family were also accompanied by changes in the expression patterns of sterol regulatory element‐binding protein 2/LXR target genes in the opposite direction to WTD‐fed mice (Figure 8F). These transcriptional changes resulting from the statin/ezetimibe treatment were replicated in human primary cultured hepatocytes 24 (Figure 8G).

Figure 8. Changes in liver gene expression in microRNA (miR)‐33b knock in ( KI ) mice in the cholesterol‐depleted condition. UMA, Experimental scheme and changes in body liver and epidydimal white adipose tissue (Epi WAT ) weight during experiment. B, Serum lipid profiles after 2 weeks of Western‐type diet (WTD) feeding and 1 week of treatment with vehicle or statin/ezetimibe. C e D, Quantitative polymerase chain reaction analysis for sterol regulatory element‐binding factor (Srebf) 2 and Srebf1 (C) and miR‐33a and miR‐33b (D) in the liver under the cholesterol‐depleted condition. n=4 for each. *P<0.05 compared with vehicle. E, Reporter assay containing sterol response element (SRE) and liver‐X‐receptor response element ( LXRE ) in HepG2 cells. n=3 for each. *P<0.05 compared with fetal bovine serum ( FBS ) containing medium. F, Heat map representation for liver gene expressions of mice treated with vehicle or statin/ezetimibe. Green indicates low expression level, and red indicates high expression level. n=4 for each. G, Heat map representation of gene expression in vehicle‐ or statin‐treated human primary culture hepatocytes. Data were obtained from GSE 24187. n=6 for each. Horizontal bars in the dot plots indicate mean±SEM. HDLC indicates high‐density lipoprotein‐cholesterol LDLC , low‐density lipoprotein‐cholesterol LPDS , lipoprotein‐depleted serum T‐Chol, total cholesterol TG, Triglyceride.

Differential Roles of miR‐33a and miR‐33b in Atherosclerotic Plaque Formation

From the data presented above, miR‐33a and miR‐33b had similar targeting potency and targeting genes however, the organ distribution was different. To compare the whole body atherogenic potency of miR‐33a and miR‐33b, we generated ApoE −/− /miR‐33 WT and ApoE −/− /miR‐33 KOKI mice. When fed a WTD for 12 weeks, ApoE −/− /miR‐33 KOKI mice showed higher plaque burden than ApoE −/− /miR‐33 WT mice (Figure 9A through and 9C). Serum HDL‐cholesterol level was reduced in ApoE −/− /miR‐33 KOKI mice versus ApoE −/− /miR‐33 WT mice (Figure 9D and 9E). As reported previously in miR‐33b KI mice, reduced serum triglyceride levels in miR‐33 KOKI mice were also observed. To confirm that reduced serum HDL‐cholesterol level resulted in increased atherogenicity in ApoE −/− miR‐33 KOKI mice, we assessed cholesterol extraction properties of serum obtained from these 2 strains of mice. According to the difference in serum HDL‐cholesterol levels, the serum obtained from ApoE −/− miR‐33b KOKI mice showed significantly decreased cholesterol extraction property than the serum obtained from ApoE −/− miR‐33 WT mice (Figure 9F). In addition, the miR‐33 KOKI mice showed blunted dose relationships between serum HDL‐cholesterol content and cholesterol efflux properties compared with WT mice. Moreover, the miR‐33 KOKI mice showed significantly reduced miR‐33 target gene expression in the liver (Figure 9G and 9H). This finding was consistent with the higher expression of miR‐33b than miR‐33a in mice livers. These results suggest that miR‐33b is more responsible for atherogenesis in vivo than miR‐33a, especially through the dysregulation of hepatic gene expression and worsened serum cholesterol profile. Because a previous report implicated the role of miR‐33 in cholesterol accumulation and inflammation in the liver, we assessed the liver triglyceride or cholesterol content and liver injury marker in the ApoE −/− WTD‐fed study. We observed a significant increase in the triglyceride content and a nonsignificant increase in the cholesterol content of the liver in ApoE −/− /miR‐33 KOKI mice compared with those in ApoE −/− /miR‐33 WT mice. Accordingly, a nonsignificant increase in the serum aspartate transaminase/alanine aminotransferase levels and a significant increase in hepatic gene expression of inflammatory makers were observed in ApoE −/− /miR‐33 KOKI mice (Figure 9I through 9K).

Figura 9. Increased atherosclerotic plaque burden in apolipoprotein E–deficient (ApoE −/− )/microRNA (miR)‐33 knock out knock in ( KOKI ) mice. Representative microscopic images of the en‐face analysis of aortic atherosclerotic plaque (UMA) and proximal aorta (B) in ApoE −/− /miR‐33 wild‐type ( WT ) mice and ApoE −/− /miR‐33 KOKI mice. Bar=500 μm. C, Quantification of the atherosclerotic plaque area in cross‐sections at the proximal aorta level. D, Serum lipid profiles of ApoE −/− /miR‐33 WT mice and ApoE −/− /miR‐33 KOKI mice. n=14 for WT , and n=10 for KOKI . E, High‐performance liquid chromatography analysis of serum cholesterol and triglyceride levels from ApoE −/− /miR‐33 WT mice and ApoE −/− /miR‐33 KOKI mice. F, Cholesterol extraction properties of serum obtained from ApoE −/− /miR‐33 WT or ApoE −/− /miR‐33 KOKI mice (deixou) and correlations between serum high‐density lipoprotein‐cholesterol ( HDLC ) level and cholesterol efflux (direito) n=11 for WT, and n=9 for KOKI . G, Quantitative polymerase chain reaction ( PCR ) analysis for miR‐33 target genes in the liver. H, Western blot analysis for miR‐33 target genes in the liver. β‐Actin is used as loading control. eu, Quantifications of triglycerides or cholesterol content in the liver. n=6 for each. J, Serum aspartate transaminase (AST) and alanine aminotransferase ( ALT ) levels from ApoE −/− /miR‐33 WT and ApoE −/− /miR‐33 KOKI mice. n=14 for WT , and n=10 for KOKI . K, Quantitative PCR analysis for gene expression of inflammatory makers in the liver. n=6 for each. Horizontal bars in the dot plots indicate mean±SEM. ApoB indicates apolipoprotein B LDLC , low‐density lipoprotein‐cholesterol T‐Chol, total cholesterol WTD , Western‐type diet TG, Triglyceride. *P<0.05 compared with WT .

To further characterize the atherogenic plaque, we performed the immunostaining of CD68 and ABCA1 and we could not detect significant differences of the positive area (Figure 10A and 10B). In addition, because a previous report suggested the role of miR‐33b in the unstable plaque formation, 21 we assessed the area of picrosirius red staining. However, we also could not detect any difference in the area of unstable plaque. To compare the function of macrophages of these 2 genotypes in vivo, we performed bone marrow transplantation experiments using these 2 strains (Figure 11A). As a result, the genotype of miR‐33 in bone marrow did not affect the atherosclerotic lesion size (Figure 11B and 11C). In addition, no significant changes in serum lipid profile were detected between these 2 groups (Figure 11D). This result was consistent with the similar prevalence of miR‐33a and miR‐33b observed in the mice macrophages.

Figura 10. Plaque characterization of apolipoprotein E–deficient (ApoE −/− )/microRNA (miR)‐33 wild‐type ( WT ) or ApoE −/− /miR‐33 knock out knock in ( KOKI ) mice. UMA, Representative images of immunostaining for CD 68, ATP‐binding cassette A ( ABCA ) 1, and picrosirius red staining. B, Quantification of positive area ( CD 68 or ABCA 1) or negative area (picrosirius red). For CD 68 and ABCA 1 staining, n=14 for WT , and n=10 for KOKI . For picrosirius red staining, n=14 for WT , and n=8 for KOKI . Bar=500 μm.

Figura 11. Hematopoietic microRNAs (miR‐33a and miR‐33b) have similar effects on atherosclerotic plaque formation. UMA, Representative genotyping polymerase chain reaction analysis of tail and blood cell genome. B, Representative microscopic images of the proximal aorta in apolipoprotein E–deficient (ApoE −/− )/miR‐33 wild‐type ( WT ) mice transplanted with bone marrow (BM) obtained from ApoE −/− /miR‐33 WT mice or ApoE −/− /miR‐33 knock out knock in ( KOKI ) mice. Bar=500 μm. C, Quantification of the atherosclerotic plaque area in cross‐sections at the proximal aorta level. D, Serum lipid profiles of ApoE −/− /miR‐33 WT mice transplanted with BM obtained from ApoE −/− /miR‐33 WT mice or ApoE −/− /miR‐33 KOKI mice. n=7 for each. Horizontal bars in the dot plots indicate mean±SEM. HDLC indicates high‐density lipoprotein‐cholesterol LDLC , low‐density lipoprotein‐cholesterol T‐Chol, total cholesterol TG, Triglyceride.

Discussão

In the current study, we comprehensively analyzed the differential roles of miR‐33a and miR‐33b in various physiological conditions and during the progression of atherosclerosis using genetically modified mice in detail. In vitro transcriptomic assays confirmed the similar functionality of miR‐33a and miR‐33b. However, in vivo, these miRs were differently distributed and regulated. The cholesterol burden of the body regulated these miRs differently, especially when fed an atherosclerosis‐prone diet, which contained high fat and high cholesterol, resulting in significantly increased miR‐33b expression in the liver through the enhancement of the LXR signaling axis. On the contrary, statins, which are commonly used as antiatherosclerotic drugs, reduced expression of miR‐33b in the liver. miR‐33 KOKI mice showed increased plaque formation versus miR‐33 WT mice. From these data, we considered that miR‐33b could be more responsible for the atherosclerotic plaque formation in vivo.

We showed that miR‐33a and miR‐33b play distinct biological roles in vivo. As expected from the targeting mechanisms of miRs, 25 the result of our transcriptomic evaluation using miR‐33–null hepatocytes and artificially synthesized miRs confirmed the same functionalities of miR‐33a and miR‐33b in repressing the target gene expression. Although there are many reports focusing on the biological function or disease relevance of miRs as a family, reports focused on the difference among members of an miR family are rare. One example is the miR‐1/miR‐133a and miR‐133b/miR‐206 cluster. miR‐1 and miR‐206 share a common seed sequence, as do miR‐133a and miR‐133b. These miR families show distinct organ distribution and involvement in different biological processes. 26 In addition, members of the same miR family may show distinct biological functions through their distinct subcellular localization. 27 In line with these data, the observed differences between miR‐33 WT and miR‐33 KOKI mice in this study are also based on the different spatiotemporal localizations. From these observations, we believe that a comprehensive assessment of the spatiotemporal distribution is important to understand the precise functionality of miRs. In particular, the experiments using genetically modified mice gave us clear data, and these data are also important to establish an effective and safe therapeutic approach.

In this study, the miR‐33 KOKI mice exhibited increased plaque formation versus miR‐33 WT mice. This result was reasonable because miR‐33b was more abundant than miR‐33a in the liver on the other hand, miR‐33a and miR‐33b were relevant in macrophages. Because previous reports showed that whole‐body miR‐33 knockdown resulted in attenuated atherosclerosis through functional changes in these organs, 11 , 14 , 28 , 29 , 30 , 31 we considered that our result is consistent with these observations. In addition, enhanced expression of miR‐33b with a cholesterol‐rich diet could also contribute to the worsening of atherogenic phenotype in the miR‐33 KOKI mice. From these observations, we considered that miR‐33b is a more potent therapeutic target of miR‐33–repressing therapy against atherosclerotic disease than miR‐33a. The deletion of miR‐33a results in worsened conditions in several cases, including not only obesity and glucose intolerance, as mentioned above, but also reduced cardiac function in pressure overload conditions in our previous report. 32 Nonselective miR‐33 inhibition may cause such adverse effects through the repression of miR‐33a, especially in miR‐33a dominant organs. Considering this possibility, miR‐33b–specific inhibition therapy for atherosclerosis may be a better treatment strategy for atherosclerosis.

In addition to the increased miR‐33b expression levels in the liver associated with a high‐fat and a high‐cholesterol diet, we showed that the abundance of miR‐33b was significantly repressed by cholesterol‐decreasing interventions, such as treatment with a statin and ezetimibe. This is consistent with the previous observation that SREBF1 expression was repressed with cholesterol‐depletion treatment. 33 These data confirm that the miR‐33 expression levels are tightly regulated by cholesterol burden. Increased expression of miR‐33a, responding to decreased cholesterol burden, is reasonable as a negative feedback mechanism, to maintain cellular cholesterol level through the downregulation of ABCA1. However, enhanced expression of miR‐33b in response to increased cholesterol burden was paradoxical. If this response works as a positive feedback mechanism, it results in overaccumulation of cholesterol in cells and could lead to cellular toxicity. Inconsistent with this hypothesis, we observed increased lipid content and expression levels of inflammatory genes in the ApoE −/− miR‐33 KOKI mice liver in the WTD‐fed study. Systemic inflammation, including steatosis, has been suggested as a contributing factor to atherosclerosis. 34 , 35 Liver inflammation in the miR‐33 KOKI mice also may have contributed to the increased atherogenicity.

Previously, it was a concern that enhanced expression of miR‐33a during statin treatment, through enhanced Srebf2 expression, resulted in hepatotoxicity. 36 However, in the current study, statin treatment decreased the transcriptional activity of downstream genes in the LXR signaling, including Srebf1, and reduced the expression of miR‐33b. Because miR‐33b is expressed in the liver at levels 10 times higher than miR‐33a, statin treatment reduced the overall level of miR‐33 in the liver. Taking into consideration that the previous report 36 used WT mice with only miR‐33a, further evaluation of the miR‐33 family and statin treatment is warranted.

Also, miR‐33 WT mice showed significantly increased HDL‐cholesterol levels than miR‐33 KOKI mice. There are 2 reports that evaluated the effects on the serum lipid profiles after pharmacological inhibition of the miR‐33 family in nonhuman primates that carry both miR‐33a and miR‐33b. 12 , 13 These reports showed that simultaneous inhibition of miR‐33a and miR‐33b increased serum HDL‐cholesterol levels. In the second report, 13 the authors focused on the selective inhibition of miR‐33a and miR‐33b using selective anti‐miR approaches. However, these selective approaches failed to increase serum HDL‐cholesterol levels or liver ABCA1 expression levels. In this study, we showed distinct effects of miR‐33a and miR‐33b on serum HDL‐cholesterol levels and the expression of their target genes. We considered that the difference between the previous report and ours may be rooted in the incompleteness of pharmacologic inhibition. In our results, in the presence of miR‐33b, the deletion of miR‐33a did not result in increased serum HDL‐cholesterol levels. On the other hand, miR‐33b was highly abundant in the liver, and complete inhibition of miR‐33b could be difficult. Thus, it was reasonable that only the simultaneous inhibition of miR‐33a and miR‐33b increased in serum HDL‐cholesterol levels and hepatic ABCA1 expression levels. As support for this discussion, the authors reported that the absolute copy number of miR‐33b is 7 times higher than that of miR‐33a in the primate liver.

Contrary to the abbreviating phenotypes on HDL‐cholesterol level, miR‐33 KOKI mice in the ApoE −/− background showed a decreased triglyceride level. In the previous report, we showed decreased triglyceride absorption in miR‐33 KI mice. In this study, the liver phenotype of miR‐33 KOKI mice was similar to that of miR‐33 KI mice because of the abundance of miR‐33b. However, in the small intestine, miR‐33a was more abundant compared with miR‐33b. From these data, we assume that the liver miR‐33 plays an important role in the triglyceride absorption however, to elucidate the precise roles of the miR‐33 family in small intestine, organ‐specific deletion of the miR‐33 family is necessary.

In addition, in the cholesterol extraction experiments by mice serum, we found a blunted slope of cholesterol efflux against serum HDL‐cholesterol in the miR‐33 KOKI mice serum compared with the miR‐33 WT mice. This suggests that not only the quantity but also the quality of HDL‐cholesterol was worsened in the miR‐33b KOKI mice. Recent studies emphasize the importance of the quality of HDL‐cholesterol for atherosclerosis progression. 6 These factors might contribute to the increased atherogenicity in miR‐33 KOKI mice.

Because of the lack of miR‐33b in the mice, which is the most widely used animal model of atherosclerosis, the role of miR‐33b in atherosclerotic plaque formation has not been well studied. Recently, the role of miR‐33b was reported during atherosclerotic plaque formation in mice. 28 However, the mice used in the this study did not grow to adulthood and could not be used to assess the whole‐body roles of miR‐33b in adult mice. In this study, we used our previously reported miR‐33b KI mice, which showed mendelian segregation and showed no significant difference in adult body weight with a normal diet. The data obtained from this strain showed many consistencies with external data and previous findings. In particular, the strong correlation between Srebf2/Srebf1 and miR‐33a/b expression patterns was also confirmed in human primary cultured cell lines. This observation supported the generalizability of the data obtained from these mice. We suggest that this strain will also be useful for assessing the roles of miR‐33b in the adult mice, and comparison of the results with previously reported strains is also important to understand the biological roles of Srebf1 and miR‐33b in vivo.

Sources of Funding

This work was supported by the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology and the Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI Grants, whose numbers are 17K09860 (Dr Horie), 1605297 (Dr Kimura), 17H04177, and 17H05599 (Dr Ono) and by a visionary research grant “Step” from Takeda Science Foundation (Dr Ono).


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Ciência

Vol 328, Issue 5985
18 June 2010

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By Katey J. Rayner , Yajaira Suárez , Alberto Dávalos , Saj Parathath , Michael L. Fitzgerald , Norimasa Tamehiro , Edward A. Fisher , Kathryn J. Moore , Carlos Fernández-Hernando

Ciência 18 Jun 2010 : 1570-1573

A small noncoding RNA helps regulate cholesterol levels in mice.


Biologia molecular

Molecular biology concerns the molecular basis of biological activity between biomolecules in the various systems of a cell, including the interactions between DNA, RNA, and proteins, their biosynthesis, as well as the regulation of these interactions.

Standard techniques include:

- Molecular cloning and gene editing
- Polymerase Chain Reaction (PCR)
- Gel electrophoresis and Blotting
- F.

Molecular biology concerns the molecular basis of biological activity between biomolecules in the various systems of a cell, including the interactions between DNA, RNA, and proteins, their biosynthesis, as well as the regulation of these interactions.

Standard techniques include:

- Molecular cloning and gene editing
- Polymerase Chain Reaction (PCR)
- Gel electrophoresis and Blotting
- Fluorescence in situ hybridization (FISH)
- Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)
- Biolabeling


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Jinchang Pan and Chengwei Zhou contributed equally.

Afiliações

Department of Biochemistry and Molecular Biology, Medical School of Ningbo University, Ningbo, 315211, China

Jinchang Pan, Shuai Fang, Xiaodan Meng, Xiaofeng Jin & Zhaohui Gong

Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pathophysiology, Medical School of Ningbo University, Ningbo, 315211, China

Jinchang Pan, Shuai Fang, Xiaodan Meng, Xiaofeng Jin & Zhaohui Gong

Department of Thoracic Surgery, The Affiliated Hospital of Medical School of Ningbo University, Ningbo, 315020, China

Chengwei Zhou & Xiaodong Zhao

Department of Thoracic Surgery, The Affiliated Ningbo Medical Center Lihuili Eastern Hospital of Medical School of Ningbo University, Ningbo, 315048, China

Jinxian He, Hui Tian & Weiyu Shen

Department of Radiation Oncology, The Affiliated Yinzhou Renmin Hospital of Medical School of Ningbo University, Ningbo, 315040, China


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