Em formação

Unidade 18: Coloração Negativa - Biologia


Unidade 18: coloração negativa

Biologia estrutural guiada por espectrometria de massa

A espectrometria de massa fornece determinação inequívoca da estequiometria de subunidade.

Define a ligação de lipídios ou outras moléculas pequenas.

Descreve a mudança conformacional com reticulação química.

Permite o encaixe de componentes adicionais em mapas de densidade EM.

Com a convergência de avanços na biologia estrutural, especificamente quebrando as barreiras de resolução na microscopia crioeletrônica e com o desenvolvimento contínuo da cristalografia, novas interfaces com outros métodos biofísicos estão surgindo. Aqui, consideramos como a espectrometria de massa pode informar essas técnicas, fornecendo uma definição inequívoca de estequiometria de subunidade. Além disso, desenvolvimentos recentes que aumentam a resolução espectral de massa permitem que detalhes moleculares sejam atribuídos à densidade não atribuída em mapas de alta resolução de complexos de membrana e proteínas solúveis. É importante também mostrar como os desenvolvimentos em espectrometria de massa podem definir as condições de solução ideais para orientar a determinação da estrutura a jusante, particularmente de biomoléculas desafiadoras que se recusam a cristalizar.


1. Introdução

A microscopia eletrônica de transmissão (EM) pode ser usada para fornecer informações estruturais sobre uma variedade de espécimes biológicos, de células a macromoléculas. A resolução das informações que podem ser adquiridas usando EM depende das propriedades da amostra, do método de preparação da amostra usado, da especificação técnica do microscópio eletrônico e dos parâmetros de imagem. As informações 3D podem ser obtidas a partir dos dados 2D EM coletados de várias maneiras, incluindo análise de partícula única [1], [2], reconstrução helicoidal [3], tomografia eletrônica (com ou sem média de subtomograma) [4], [5 ] e cristalografia 2D [6], [7]. Esses métodos de processamento de dados são adequados para diferentes amostras de análise de partícula única para purificados, complexos de proteínas & # x02018 homogêneos & # x02019 (como o ribossomo [8]), reconstrução helicoidal para conjuntos de proteínas com simetria helicoidal (como microtúbulos [9]), tomografia para & # x02018unique & # x02019 assemblies (como organelas e células [10]) e cristalografia 2D para proteínas, significativamente menor do que 150 & # x000a0kDa que formam matrizes ordenadas 2D (como bacteriorodopsina [11]). A análise de partícula única usa imagens de projeção 2D múltiplas e otimizadas que contêm muitas & # x02018 partículas únicas & # x02019 com diferentes orientações angulares. As relações angulares entre cada vista do espécime podem ser calculadas nas imagens para fornecer informações 3D. A tomografia de elétrons e a cristalografia 2D obtêm diferentes visualizações angulares inclinando o mesmo espécime muitas vezes (normalmente inclinando o espécime entre & # x000b165 & # x000b0 e tirando uma imagem a cada 2 & # x000b0, produzindo 65 imagens da mesma área). A relação angular entre cada imagem é conhecida, pois o incremento de inclinação é definido e, portanto, pode ser usado para reconstruir informações 3D. A geração de informações estruturais 3D a partir de micrografias 2D e padrões de difração de elétrons usando os métodos de processamento acima foi revisada extensivamente em outros lugares [1], [2], [6], [7], [12].

Aqui, as etapas para a determinação da estrutura biológica por EM são discutidas com foco na preparação de amostras e imagens de espécimes para análise de partícula única (fluxo de trabalho de exemplo mostrado na Fig. 1) e tomografia eletrônica, embora muitos dos conceitos e considerações discutidos sejam transferíveis.

Fluxo de trabalho de exemplo para determinação de estrutura por EM de partícula única.


Processo de coloração de Gram

O processo de coloração de Gram inclui as seguintes etapas:

  1. Pegue uma lâmina limpa e seca e coloque uma gota de água destilada no centro.
  2. Prepare o esfregaço bacteriano retirando pouco inóculo da cultura bacteriana com a ajuda da alça de inoculação.
  3. Em seguida, misture o inóculo com a gota de água para preparar um esfregaço bacteriano fino girando o loop de inoculação no sentido horário e anti-horário.
  4. Depois disso, o esfregaço bacteriano é fixado por calor sob a lâmpada de álcool.
  5. Em seguida, inunde o esfregaço bacteriano com violeta de cristal e deixe-o repousar por 1 minuto.
  6. Em seguida, inunde o esfregaço com Iodo de Gram.
  7. Depois disso, adicione o agente descolorante, ou seja, 95% de etanol para o esfregaço.
  8. Por último, adicione contracoloração, ou seja, Safranin ao esfregaço e deixe-o repousar por 1 minuto.
  9. Então, lavagem a lâmina com água e secar ao ar.
  10. Afinal, observar a lâmina de vidro sob o microscópio, adicionando imersão em óleo às células coradas para diferenciar as células gram-positivas e negativas.

Interpretação do resultado da coloração de Gram

  • Gram-Positivo: Se a célula da bactéria der um resultado positivo para a reação grama, ela irá manchar Tolet.
  • Gram-negativo: Se a célula bacteriana der um resultado negativo para a reação grama, ela irá manchar Cor de rosa.

Significado

A coloração de Gram é a etapa principal para o identificação e classificação das bactérias em dois grupos, isto é, gram-positivas e gram-negativas. Ele cora a parede celular bacteriana de forma diferente, dando cor violeta às bactérias gram-positivas e cor rosa às bactérias negativas. Portanto, adiciona cor à parede celular das bactérias, o que aumenta o visibilidade sob o microscópio óptico.

Além disso, a coloração de Gram também ajuda no estudo da morfologia e arranjo das bactérias. Também nos ajuda a saber sobre o químico e propriedades físicas das bactérias gram-positivas e gram-negativas, com base na diferença da parede celular.


Diferença entre bactérias gram positivas e gram negativas

Christian Gram, um médico dinamarquês em 1884, desenvolveu uma técnica de coloração para distinguir dois tipos de bactérias. As duas categorias de bactérias com base na coloração de Gram são Gram positivo bactérias e Gram negativo bactérias. As bactérias são coradas primeiro com violeta cristal ou violeta genciana. Todas as células bacterianas irão tingir-se de azul ou roxo com solução de cristal violeta. Em seguida, as células bacterianas são tratadas com solução de iodo (iodo de Lugol) e lavadas com álcool (solução de descoloração). As bactérias que retêm a cor azul ou roxa do cristal violeta são chamadas de bactérias Gram-positivas e as bactérias que perdem a cor do cristal violeta após a lavagem com uma solução de descoloração são chamadas de bactérias Gram-negativas.

Bactérias Gram negativas são posteriormente coradas com safranina ou fucsina para observação ao microscópio. As bactérias Gram negativas após a coloração com safranina ou fucsina aparecem de cor vermelha ou rosa. A coloração de Gram diferencia as bactérias pelas propriedades químicas e físicas de suas paredes celulares, detectando as propriedades do peptidoglicano. O método de coloração de Gram é útil na diferenciação da maioria das espécies bacterianas em duas grandes categorias. Embora todas as espécies bacterianas não possam ser diferenciadas com base na técnica de coloração de Gram, esse método tem imensa aplicação em diagnósticos clínicos e pesquisas biológicas.

Semelhanças entre bactérias gram positivas e gram negativas

Ø Ambos são células bacterianas

Ø Ambos os grupos são procarióticos

Ø Ambos carecem de organelas delimitadas por membrana

Ø Ambos os grupos têm DNA circular covalentemente fechado como material genético

Ø Ambos os grupos contêm materiais genéticos extra-cromossômicos (plasmídeos)

Bactérias Gram positivas (azul) e Gram negativas (rosa) (fonte wikipedia)

Ø Ambos os grupos possuem cápsula

Ø Em ambos os grupos, a parede celular é composta por peptidoglicano

Ø Em ambos os grupos, o citoplasma é rodeado por bicamada lipídica com muitas proteínas que abrangem a membrana

Ø Tanto as bactérias gram-positivas quanto as gram-negativas geralmente têm uma camada superficial chamada camada S

Ø Ambos os grupos de bactérias sofrem recombinação genética por meio de transformação, transdução e conjugação

Ø Ambos os grupos sofrem fissão binária como um modo de reprodução assexuada

Ø Ambos os grupos contêm muitas espécies flageladas e não flageladas

Ø As bactérias gram positivas e gram negativas são inibidas por antibióticos (sua sensibilidade varia)

Ø Ambos os grupos incluem formas flageladas (móveis) e não flageladas (não móveis)

Saiba mais & # 8230

Diferença entre bactérias gram positivas e bactérias gram negativas


3 principais métodos de coloração | Botânica Prática

Para uma observação mais rápida da morfologia das células bacterianas ou de levedura, aplica-se a técnica de coloração negativa e shynique.

1. Suspensão bacteriana / levedura.

2. Lâmina, agulha de inoculação, pipetas etc.

5. Solução de corante de nigrosina (1% aq.)

Uma gota de suspensão bacteriana é colocada em uma lâmina limpa e sem gordura. Em seguida, cerca de 1 ml. suspen & shysion é espalhado por uma agulha na lâmina e seco ao ar. Finalmente, a mancha seca é fixada por calor passando por uma chama. Em seguida, algumas gotas de solução de corante de nigrosina são despejadas no esfregaço e espalhadas uniformemente na lâmina. Finalmente, o esfregaço com corante é seco e examinado microscopicamente.

Bactérias ou células de levedura são vistas como corpos brilhantes contra um fundo escuro.

Método # 2. Coloração Simples:

I. Por Ziehl & # 8217s Carbol Fuchsin:

Para facilitar a observação ao microscópio, é necessário corar as bactérias com corantes adequados. Normalmente, os corantes básicos são empregados para a coloração de bactérias.

(b) Lâmina, agulha, queimador, pipeta, microscópio etc.

Transfira uma pequena gota de uma suspensão bacteriana para o centro de uma lâmina sem graxa e espalhe uniformemente sobre uma área de cerca de 1 × 2 cm. Deixe o esfregaço secar ao ar e fixe passando 3 a 4 vezes rapidamente sobre uma chama.

Coloque a lâmina na borda de um petridish e cubra o esfregaço com mancha de carbol-fucsina. Deixe a mancha reagir por 2 minutos e depois lave a lâmina com água corrente da torneira. Seque a lâmina (Fig. 4.2a.). Observe ao microscópio usando objetiva de imersão em óleo.

As células bacterianas parecem arroxeadas.

II. Por Cristal Violeta:

1. Solução de corante violeta de cristal (0,5% aq.)

2. Lâmina, agulha, queimador, pipeta, microscópio etc.

1. Pegue 1 ou 2 alças cheias de uma suspensão bacteriana em uma lâmina limpa. Faça um esfregaço fino na lâmina e deixe-a secar. Fixe o filme passando a lâmina seca 3 ou 4 vezes rapidamente sobre uma chama.

2. Cubra a lâmina com a mancha e deixe agir por 1 minuto.

3. Retire a mancha, lave com água e seque entre papéis absorventes.

4. Examine a lâmina sob um microscópio e evite as objetivas de baixa e alta potência.

Observe a forma dos organismos conforme observado. As células bacterianas adquirem coloração violeta (Fig. 4.2b).

Método # 3. Coloração diferencial:

I. Coloração de Gram:

Este método é usado para classificação de microorganismos de acordo com sua propriedade de coloração. Certas bactérias, quando tratadas com um corante como cristal (ou metil) violeta e, em seguida, com iodo, a mancha torna-se & # 8220 corrigido & # 8221 de modo que o tratamento subsequente com um agente descolorante, por exemplo, álcool ou acetona & # 8211, não remova a cor. Alguns organismos, no entanto, são descoloridos por esse processo.

As espécies que retêm a cor são denominadas & # 8220Grama positivo & # 8221 e os descoloridos são denominados & # 8220Gram negativo & # 8221. Para tornar visíveis os organismos descoloridos e para os distinguir daqueles que retêm a cor, é então aplicado um contraste ou contracoloração, geralmente a primeira mancha é violeta e pode ser diferenciada da contracoloração que é vermelha.

1. Primeira coloração: (violeta de cristal ou violeta de metila) & # 8211 5 g.

Dissolva 20 g. KI em 250 ml. água e, em seguida, adicione 10 g. eu2 quando dissolvido, perfazer até 1 litro.

4. Álcool absoluto ou 80% de acetona.

5. Pipetas, conta-gotas, microscópio, papel absorvente etc.

1. Faça o esfregaço (conforme as instruções na seção anterior), seque e fixe-o com calor.

2. Cubra a lâmina com solução de cristal (ou metil) violeta e deixe agir por cerca de 30 & # 8211 60s.

3. Despeje a mancha e, segurando a lâmina em um ângulo para baixo, despeje a solução de iodo para remover o cristal violeta. Cubra a lâmina com solução de iodo nova e deixe agir por cerca de 30 & # 8211 60s.

4. Lave a solução de iodo com álcool absoluto até que a cor cesse do preparo.

5. Lave com água. Enxágüe com uma pequena quantidade de contracolorante.

6. Aplique a contracoloração por 1 e # 8211 2 minutos.

7. Lave com água e seque entre papéis absorventes.

8. Examine ao microscópio com objetiva de imersão em óleo.

Explicação da coloração de Gram:

A explicação mais plausível para esse fenómeno está associada à estrutura e à composição da parede celular bacteriana. As diferenças na espessura das paredes celulares entre esses dois grupos de bactérias podem ser importantes, pois as paredes celulares das bactérias Gram-negativas são geralmente mais finas do que as das bactérias Gram-positivas.

As bactérias Gram-negativas contêm uma porcentagem maior de lipídios do que as bactérias Gram-positivas. Evidências experimentais sugerem que, durante o tratamento com álcool, a coloração extrai o lipídio, o que resulta em aumento da porosidade ou permeabilidade da parede celular. Assim, o complexo de cristal violeta-iodo (CV & # 8211 I) pode ser extraído e o organismo Gram-negativo é descolorado.

Subseqüentemente, essas células assumem a cor da contracoloração da safranina. As paredes celulares das bactérias Gram-positivas, devido à sua composição diferente (menor teor de lipídios), ficam desidratadas durante o tratamento com álcool. O tamanho dos poros diminui, a permeabilidade é reduzida e o complexo CV-I não pode ser extraído. Portanto, essas células permanecem roxo-violeta.

Outra explicação, um tanto semelhante, também se baseia nas diferenças de permeabilidade entre os dois grupos de bactérias. Em bactérias Gram-positivas, o complexo CV & # 8211 I fica preso na parede após o tratamento com etanol, o que presumivelmente causa uma diminuição no diâmetro dos poros no peptidoglicano da parede celular.

As paredes do bacte Gram-negativo e shyria têm uma quantidade muito menor de peptídeo e shylycan, que é menos extensivamente reticulada do que nas paredes das bactérias Gram-positivas. Os poros no peptidoglicano de bacte Gram-negativo e shyria permanecem suficientemente grandes, mesmo após o tratamento com etanol e inibição, para permitir que o complexo CV & # 8211 I seja extraído.

Embora os organismos Gram-negativos falhem de maneira consistente e tímida em reter a coloração de violeta de cristal primário, os organismos Gram-positivos podem, às vezes, apresentar variações a este respeito, ou seja, uma reação de Gram variável. Por exemplo, culturas antigas de bactérias Gram-positivas perdem a capacidade de reter o violeta cristal e, portanto, serão coradas pela safranina.

II. Coloração de endosporo:

Os endosporos maduros de bactérias não são facilmente corados devido à presença de uma camada impermeável entre o citoplasma dos esporos e o revestimento dos esporos.

No entanto, manchas especiais concentradas penetram. Uma dessas manchas é o verde malaquita.

(i) Solução saturada de verde malaquita (verde malaquita dissolvido em água destilada).

(ii) Safranin 0,25% aq. solução.

(iii) suspensão de cultura bacteriana com 72 horas de idade.

Prepare o esfregaço da forma habitual e fixe passando a lâmina 20 vezes sobre uma chama. Cubra o esfregaço com verde malaquita e deixe reagir por 10 minutos. Enxágüe com água da torneira por 10 seg. e então corar com safranina por 1 minuto. Enxágüe com água, seque e examine sob imersão em óleo. Faça um esboço à mão livre.

Método: II (Método de Writz & # 8217s):

Coloração por Ziehl & # 8217s Carbol fuchsin e Dorner & # 8217s solução de nigrosina:

(a) Suspensão de cultura bacteriana com 72 horas de idade.

(b) Ziehl & # 8217s Carbol fucsina (0,3 g. de 90% de fucsina básica é dissolvido em 10 ml de etanol a 95% e então o volume é completado para 100 ml pela adição de água).

(c) Solução de nigrosina Dorner & # 8217s (10 gm. de nig e tirosina são dissolvidos em 100 ml de água destilada e fervida durante 30 minutos e, em seguida, 0,5 ml de formalina a 40% é adicionado e filtrado a seguir).

(e) Tubo de ensaio, suporte para tubos de ensaio.

Cerca de 1 ml. de suspensão bacteriana é tomada em um tubo de ensaio e, em seguida, uma quantidade igual de carbol-fucsina é adicionada. Em uma lâmina, uma alça cheia da preparação corada é misturada com uma alça cheia de solução de nigrosina. A preparação é untada o mais finamente possível e seca rapidamente. A porção delgada desta preparação de esfregaço é observada ao microscópio usando objetivas de imersão em óleo.

O fundo aparece preto acinzentado, as células incolores e o endosporo vermelho brilhante (Fig. 4.3).

III. Coloração de Flagelos:

Alguns organismos eucarióticos e procarióticos podem mover-se ativamente por um componente celular conhecido como flagelo, que é tão fino que não pode ser resolvido por um microscópio de campo claro. Como tal, requer coloração especial que o torna visível.

(i) cultura inclinada de Bacillus aspiarius com 18 horas de idade

(ii) Tubo de cultura e água destilada (esterilizada)

(iii) Lâmina limpa e sem graxa.

(a) Ácido tânico (solução aq. 10%) & # 8211 18 ml.

(b) Fucsina básica (0,5% em etanol) & # 8211 0,5 ml.

(c) HCl (concentrado) & # 8211 0,5 ml.

1. A inclinação é preenchida até a metade com água e mantida em temperatura ambiente por cerca de 1/2 hora sem perturbação.

2. Uma gota de suspensão é colocada na rampa e mantida de forma inclinada para que a suspensão corra ao longo da superfície da rampa muito lentamente.

4. É corado de acordo com o método de Bailey & # 8217s.

(i) A solução & # 8216A & # 8217 é filtrada e o filtrado é permitido permanecer na lâmina por 3 & # 8211 4 minutos.

(ii) Após despejar a solução & # 8216A & # 8217 da lâmina, a solução & # 8216B & # 8217 é adicionada e pode permanecer por 7 min.

(iii) O esfregaço manchado é lavado com água destilada.

(iv) A lâmina é então preenchida com a solução & # 8216C & # 8217 e é deixada em repouso por 1 minuto com aquecimento suave.

5. O esfregaço é lavado com água e seco ao ar.

6. É examinado sob a objetiva de imersão em óleo.

Observam-se flagelos de Peritrichonus (cor rosa (escuro)) aderidos à superfície das hemácias. Alguns flagelos quebrados também são visíveis.

1. Extremo cuidado deve ser tomado para não perturbar a suspensão bacteriana, que pode causar o desprendimento do flagelo.

2. Durante a coloração com solução & # 8216C & # 8217, deve-se tomar cuidado para não ferver diretamente na chama.

4. Coloração da cápsula:

Algumas células bacterianas são circundadas por uma substância viscosa, formando um envelope ao redor da célula. Esta estrutura é conhecida como cápsula. Esta cápsula pega um tipo especial de mancha e revela sua presença.

1. Cultura oblíqua de Klebsiella com 24 horas de idade.

2. Tubo de cultura e água destilada (esterilizada) para fazer a suspensão.

3. Lâmina limpa e sem gordura.

a) 1% aq. solução de vermelho congo.

b) Coloração de Maneval & # 8217s. (2 ml. De solução aquosa a 1% de fucsina ácida, 4 ml de solução aquosa a 20% de cloreto férrico, 10 ml. De ácido acético glacial e 30 ml. De solução aquosa de fenol a 5% misturados completamente e filtrado).

1. É preparada uma suspensão aquosa de Klebsiella.

2. Uma gota de vermelho congo é colocada em uma lâmina limpa sem gordura.

3. Uma alça cheia de suspensão bacteriana é removida, misturada com vermelho congo e espalhada suavemente sobre a lâmina. É permitido secar ao ar.

4. O esfregaço é inundado com corante Maneval & # 8217s e mantido por pelo menos 3 minutos.

5. O esfregaço corado é lavado com água destilada e seco ao ar.

6. A preparação é examinada sob a objetiva de imersão em óleo.

As cápsulas são vistas como zonas não coradas, mas o fundo é azul a enegrecido e as células são coradas de vermelho a marrom avermelhado, dependendo da espessura do esfregaço.

As seguintes soluções são necessárias:

1. Solução aquosa de violeta de cristal a 1%.

2. Solução aquosa de sulfato de cobre a 20%.

1. Um esfregaço fino é preparado e seco ao ar sem fixação.

2. O violeta de cristal é aplicado por 2 minutos sem aquecimento.

3. É lavado com solução de sulfato de cobre.

4. Em seguida, é seco ao ar e examinado ao microscópio.

Cápsula & # 8211 violeta pálido, célula bacteriana & # 8211 violeta profundo.

V. Coloração ácido-resistente:

Este é um procedimento de coloração único para identificar alguns grupos característicos de bactérias denominadas & # 8220Acid fast bacillus & # 8221, que são extremamente patogênicas para o homem. Essas bactérias pertencem ao gênero & # 8211 & # 8220Mycobacterium & # 8221.

1. Coloração primária & # 8211 Carbol fucsina (mistura de fucsina básica e fenol diluído).

2. Contra-coloração & # 8211 azul de metileno (1% aq.)

3. Mistura ácido-álcool (3% HCl ou HNO3 em álcool etílico a 95%)

4. Lâmina, agulha, pipeta, queimador, papel absorvente.

1. Um esfregaço bacteriano é feito em uma lâmina sem graxa e então fixada com calor da maneira usual.

2. O esfregaço é inundado com a mancha primária e mantido por 3 & # 8211 5 minutos (sem secagem). O morto é lavado com água.

3. Em seguida, o esfregaço é lavado com uma mistura de ácido-álcool e finalmente contrastado com azul de metileno por 2 & # 8211 3 minutos.

Os organismos ácido resistentes ficam com coloração de vermelho escuro, enquanto outros organismos não ácido resistentes ficam com coloração azul.

VI. Coloração de Organismos de Coalhada:

O & # 8216Curd & # 8217 é um produto lácteo que é formado devido à atividade microbiológica do leite. A bactéria Lactobacillus produz ácido no leite e, em seguida, causa a acidificação do leite e o leite é finalmente convertido em coalhada. Além da coalhada de Lactobacillus também contém a bactéria Streptococcus lactis e algumas leveduras.

2. Reagentes para coloração de gram de organismos de coalhada (coloração violeta cristal, solução de iodo, coloração de safranina, solução de álcool).

3. Lâmina, agulha, pipeta, copo, papel absorvente.

Uma alça cheia de coalhada é colocada em uma lâmina limpa sem gordura e diluída com 1 gota de água esterilizada. Um esfregaço fino é então preparado na lâmina, seco ao ar e finalmente fixado por calor. O esfregaço é corado seguindo o procedimento usual de coloração de Gram e examinado ao microscópio usando objetiva de imersão em óleo. O tamanho, forma e natureza grama de cada organismo são examinados e registrados.


Informações de Apoio

S1 Fig. Três interfaces NTD M1 diferentes reveladas por cristalografia de raios-X anterior.

São mostradas (A) interface de simetria C2, presente na estrutura PDB: 1AA7 [14], e (B) empilhada e (C) interfaces laterais presentes na estrutura PDB: 1EA3 [15]. Os resíduos de lisina, usados ​​abaixo nas análises de reticulação, são mostrados em vermelho. As localizações hipotéticas de CTDs são mostradas em verde. CTD, domínio C-terminal M1, proteína de matriz 1 NTD, domínio N-terminal PDB, Protein Data Bank

S2 Fig. Crio-EM de oligômeros de proteína WT-M1.

(A) Micrografia crio-EM representativa de oligômeros WT-M1. (B) A transformação de Fourier da imagem em (A) mostra as linhas de camada. A primeira linha de camada indica o passo helicoidal de 111 Å do oligômero WT-M1. (C) As médias de classe 2D que se concentram no centro dos segmentos helicoidais mostram grande heterogeneidade de densidade adicional em ambos os lados da camada externa do filamento. crio-EM, microscopia crioeletrônica M1, proteína da matriz 1 WT-M1, PR8 M1 de comprimento completo.

S3 Fig. M1 montagem é dependente do tempo, bem como proteína e concentração de NaCl.

Micrografias eletrônicas de coloração negativa (A) após 2 horas e (B) 24 horas de incubação nas concentrações indicadas de proteína na presença de NaCl 2 M. (C) Micrografias eletrônicas de coloração negativa após incubações de 24 h de 10,8 μM M1 montadas nas concentrações de NaCl indicadas. Barra de escala = 5.000 Å. M1, proteína da matriz 1

S4 Fig. Reconstrução helicoidal Cryo-EM de filamentos M1-V97K.

(A) Transformada de Fourier de uma micrografia representativa que mostra o anel de água. (B) Indexação de linha de camada. (C) Médias representativas de classe 2D. (D) Resolução local da unidade assimétrica M1-V97K. (E) A curva FSC mostra resolução de 3,4 Å usando o corte de 0,143. crio-EM, microscopia crioeletrônica FSC, correlação de camada de Fourier M1, proteína da matriz 1

S5 Fig. As ligações cruzadas descobertas mapeiam bem a estrutura M1-V97K.

(A) Representação em fita de uma proteína M1-V97K nas mesmas orientações mostradas na Fig. 5, exibindo as reticulações descobertas aplicando o mesmo esquema de cores da Fig. 4. Os resíduos de lisina são mostrados como bastões laranja. (B) O mesmo que em (A), exceto que apenas as reticulações verdes e vermelhas são exibidas para destacar as reticulações formadas pela lisina K242 e K252, localizadas no loop flexível L12. M1, proteína da matriz 1

S6 Fig. M1-V97K estrutura crio-EM revela interações moleculares entre monômeros adjacentes.

(A) Um grupo de 6 unidades assimétricas com a fita inferior identificada como N (rosa), N + 1 (vermelho) e N + 2 (ciano) e a fita superior identificada como N + 22 (verde), N + 23 (amarelo) e N + 24 (azul). Círculos pontilhados destacam 3 grupos de interações intermoleculares. (B) Interações entre N CTD e N + 23 NTD na interface entre cadeias. Cinco resíduos T167-169, N170 e R174 de N participam de uma bolsa hidrofóbica que também contém Q75 de N + 23. (C) Interações entre NTDs de 2 unidades assimétricas adjacentes N + 23 e N + 24. Resíduos L3, L4, T140 e F144 de N + 24 formam uma bolsa hidrofóbica com I51 de N + 23. (D) A alça de conexão CL9 e a hélice α10 do CTD de N + 23 interagem com N + 24 NTD por meio de ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas. (E) As hélices α11 e α12 do CTD de N + 23 interagem com N + 24 via ligações de hidrogênio, pontes de sal e interações hidrofóbicas. As linhas tracejadas em amarelo indicam ligações de hidrogênio e pontes de sal. As orientações são alteradas para facilitar a visualização. CL, loop de conexão crio-EM, microscopia crioeletrônica CTD, domínio C-terminal M1, proteína da matriz 1 NTD, domínio N-terminal.

S7 Fig. Mutações de WT-M1 mapeadas na estrutura M1-V97K.

Todos os resíduos com mutação no fundo WT-M1 são exibidos como esferas no contexto do oligômero M1-V97K. Os resíduos mutados que resultaram em oligomerização de camada única, sem aparente ou de múltiplas camadas são exibidos como esferas vermelhas, azuis e laranja, respectivamente. O resíduo I51, no qual as mutações resultaram em nenhuma oligomerização aparente ou em várias camadas, é exibido em verde. M1, proteína da matriz 1 WT-M1, PR8 M1 de comprimento completo.

S8 Fig. Ângulos entre interfaces empilhadas.

Comparação da interface empilhada entre 2 subunidades (cinza) da estrutura cristalina de NTD M1 (PDB: 1EA3) [15] e os NTDs de 2 subunidades M1, N + 23 (amarelo) e N + 24 (azul), do estrutura crio-EM de oligômeros M1-V97K. A falta de sobreposição da subunidade amarela e cinza mais à esquerda revela a ligeira alteração na interface empilhada entre as estruturas NTD e M1 de comprimento total. crio-EM, microscopia crioeletrônica M1, proteína da matriz 1 NTD, domínio N-terminal PDB, Banco de dados de proteínas

S9 Fig. Conservação de aminoácidos entre 3.544 IAV M1s.

Os aminoácidos são mostrados com cada resíduo colorido por sua pontuação de conservação, conforme calculado usando o servidor ConSurf. M1, proteína da matriz 1

S10 Fig. Orientação e dimensões de 1 subunidade monomérica dentro do filamento M1-V97K.

São mostradas 3 subunidades adjacentes dentro do tubo M1-V97K com a interface empilhada entre os monômeros M1 indicados. Uma caixa destaca o comprimento e a largura da subunidade amarela. O NTD é apontado para fora do tubo. M1, NTD da proteína da matriz 1, domínio N-terminal.

S11 Fig. Sensibilidade ao pH dos oligômeros WT-M1 e V97K-M1.

(A) Micrografias eletrônicas de coloração negativa de oligômeros WT-M1 (esquerda) e V97K-M1 (direita) que foram sedimentados e ressuspensos em tampão a pH 7 ou 5,5, conforme indicado. (B) Quantificação de SDS-PAGE de pellets (P) e sobrenadantes (S) após ressuspensão de oligômeros WT-M1 e M1-V97K em tampão a pH 7 ou 5,5. M1, proteína da matriz 1 WT-M1, PR8 M1 de comprimento completo.

Tabela S1. Interfaces proteína-proteína e condições de cristalização de todas as estruturas IAV NTD M1 depositadas no PDB em rcsb.org.

IAV, vírus influenza A M1, proteína de matriz 1 NTD, domínio N-terminal PDB, Protein Data Bank

Tabela S2. Relacionado à Fig 3.

Mutações na interface empilhado, lateral e C2-dímero.

Tabela S3. Relacionado à Fig 5.

Coleta de dados Cryo-EM, processamento e estatísticas de refinamento de modelo dos filamentos WT-M1 e M1-V97K M1. crio-EM, microscopia crioeletrônica M1, proteína da matriz 1 WT-M1, PR8 M1 de comprimento total.

S1 Movie. Relacionado à Fig 6.

Interações da subunidade M1 dentro do oligômero M1-V97K. M1, proteína da matriz 1

S1 Data. Relacionado à Fig 4.

Dados de MS brutos para M1 de oligômeros M1-V97K. MS, espectrometria de massa M1, proteína da matriz 1

S2 Data. Relacionado à Fig 4.

Dados de MS brutos para M1 de oligômeros WT-M1. MS, espectrometria de massa M1, proteína da matriz 1 WT-M1, PR8 M1 de comprimento total.

S3 Data. Relacionado à Fig 4.

Dados brutos de MS para M1 a partir de vírions PR8 a pH 7. MS, espectrometria de massa M1, proteína de matriz 1 PR8, A / Puerto Rico / 8/1934 (H1N1)

S4 Data. Relacionado à Fig 4.

Dados de MS brutos para M1 a partir de vírions PR8 a pH 5,5. MS, espectrometria de massa M1, proteína da matriz 1 PR8, A / Puerto Rico / 8/1934 (H1N1)

S5 Data. Relacionado à Fig 4.

Dados de MS brutos para M1 de vírions Udorn a pH 7. MS, espectrometria de massa M1, proteína de matriz 1 Udorn, A / Udorn / 1972 (H3N2) vírus filamentoso

S6 Data. Relacionado à Fig 4.

Dados brutos de MS para M1 de vírions Udorn em pH 5,5. MS, espectrometria de massa M1, proteína de matriz 1 Udorn, A / Udorn / 1972 (H3N2) filamentous virus

Imagens S1 Raw.


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