Em formação

Genes regulados pelo ciclo celular e mRNA


Eu sou um matemático e meu conhecimento sobre biologia é próximo a zero. Estou lendo um artigo de bioinformática e gostaria de entender um pouco mais sobre a tarefa de biologia da qual estão falando. Cito aqui o primeiro parágrafo do artigo:

A identificação de genes regulados pelo ciclo celular através da ciclicidade de RNAs mensageiros em estudos de todo o genoma é uma tarefa difícil devido à presença de ruído interno e externo em dados de microarray. Além disso, a análise também é complicada pela perda de sincronia que ocorre nos experimentos do ciclo celular, o que geralmente resulta em ruído de fundo adicional.
[De Santis, Marianna, et al. "Combinando técnicas de otimização e aprendizado de máquina para previsão de todo o genoma de genes regulados pelo ciclo celular humano." Bioinformatics (2013): btt671.]

Pesquisei online por alguma explicação sobre este tópico e entendo que o ciclo celular é um conjunto de eventos pelos quais as células passam para se duplicar. Também entendo que existem algumas moléculas responsáveis ​​pela regulação do ciclo celular. Sei que o mRNA é uma classe de ácido nucléico responsável por transferir as informações do DNA de dentro do núcleo para os ribossomos para iniciar a síntese de aminoácidos. Microarrays são matrizes obtidas por sequências de DNA dentro de algum chip.

Qual é a ciclicidade do mRNA? Como isso está relacionado ao ciclo celular?

Só preciso de uma explicação bem simples, sem nenhum detalhe, pois não é a minha área, mas me preocupo em entender o pano de fundo.


Supõe-se que, para uma célula se dividir, ela deve progredir por meio de uma série de estágios graduais. Em cada uma dessas fases, certas proteínas têm que ser fabricadas por meio de mRNA e / ou modificadas pós-transcricionalmente a fim de servir a um papel proliferativo ou antiproliferativo específico, que em geral acaba orquestrando o trânsito para o estágio subsequente.

Convencionalmente, o ciclo celular é composto por 3 estágios de "interfase" antes da execução da própria mitose: G1 (crescimento, metabolicamente ativo), S (síntese de DNA para duplicar o material genético em preparação para sua divisão em duas células filhas) e G2 ( fase de lacuna em que uma série de verificações de controle de qualidade são realizadas na forma de vigilância do DNA recém-produzido, por exemplo, para garantir a viabilidade das progênies).

Sob essas premissas, espera-se que o conteúdo protéico de uma célula em uma fase específica circule ou oscile de acordo com suas necessidades, e isso está relacionado à ciclicidade do mRNA como o processo responsável mais direto pela modulação da abundância proteica. Está então relacionado ao ciclo celular no sentido de que, para transitar da fase G1, por exemplo, proteínas envolvidas na síntese de DNA precisarão ser produzidas e, portanto, fatores protéicos liberados para que ocorra a transcrição de certos mRNAs.

Experimentalmente, essa dissecção de genes regulados pelo ciclo celular é complicada. Extrair mRNA de subpopulações de células puras em estágios específicos de divisão celular é um desafio, pois o isolamento de tais subpopulações de células é normalmente por meio de enriquecimento químico e procedimentos de sincronização abaixo do ideal. A relação sinal-ruído não é ideal nessas circunstâncias.

Em suma, a célula percorre estágios para se dividir e esse ciclo se deve, por si só, ao ciclo de certas proteínas, as mais conhecidas são chamadas justamente de "ciclinas", que são marcadores protéicos da divisão celular. As ciclinas D, E, A, B prevalecem de forma diferente em diferentes estágios do ciclo celular como resultado da equação balanceada de transcrição de mRNA e modificações de proteínas pós-transcricionais (eventos de fosforilação marcam-nas para degradação, por exemplo). No geral, um processo entrelaçado e bem coordenado.

*** EDITAR

Para uma seleção adequada de alguma bibliografia básica sobre o assunto, fontes robustas cobrindo o assunto com rigor (menos específicas e densas do que os artigos de periódicos que comento abaixo), consulte os seguintes links:

e até mesmo uma revisão do último aqui.

HTH


A regulação do ciclo celular da transcrição do gene da histona H4 requer o fator oncogênico IRF-2

Os genes das histonas exibem um pico na transcrição na fase S inicial e são modelos ideais para a expressão gênica regulada pelo ciclo celular. Nós mostramos anteriormente que o fator de transcrição do fator regulador do interferon 2 (IRF-2) pode ativar a expressão do gene da histona H4. Neste relatório, estabelecemos que um gene de histona H4 de camundongo e seu homólogo humano perdem o controle rigoroso do ciclo celular em fibroblastos embrionários sincronizados nos quais IRF-2 foi ablado. Também mostramos que há níveis reduzidos de mRNA desse gene H4 de histona de camundongo endógeno nas células IRF-2 (- / -). Surpreendentemente, o nível geral de mRNA e a regulação do ciclo celular da transcrição da histona H4 são restaurados quando o IRF-2 é reintroduzido nessas células. O IRF-2 é um regulador negativo da resposta do interferon e tem potencial oncogênico, mas pouco se conhece sobre o mecanismo dessas atividades. Nossos resultados sugerem que IRF-2 é um jogador ativo na expressão de genes regulados por ciclo celular independente de E2F na transição de fase G1 / S. IRF-2 foi anteriormente considerado um antagonista passivo para o supressor de tumor IRF-1, mas agora pode se juntar a outros fatores oncogênicos, como c-Myb e E2F1, que são previstos para mediar suas capacidades de transformação regulando ativamente os genes necessários para a progressão do ciclo celular.


Identificação abrangente de genes regulados pelo ciclo celular da levedura Saccharomyces cerevisiae por hibridização de microarray

Procuramos criar um catálogo abrangente de genes de levedura cujos níveis de transcrição variam periodicamente dentro do ciclo celular. Para tanto, usamos microarrays de DNA e amostras de culturas de leveduras sincronizadas por três métodos independentes: parada do fator α, elutriação e parada de um mutante sensível à temperatura cdc15. Usando algoritmos de periodicidade e correlação, identificamos 800 genes que atendem a um critério mínimo objetivo para a regulação do ciclo celular. Em experimentos separados, projetados para examinar os efeitos da indução da ciclina G1 Cln3p ou da ciclina do tipo B Clb2p, descobrimos que os níveis de mRNA de mais da metade desses 800 genes respondem a uma ou a ambas as ciclinas. Além disso, analisamos nosso conjunto de genes regulados pelo ciclo celular em busca de elementos promotores novos e conhecidos e mostramos que vários elementos conhecidos (ou suas variações) contêm informações preditivas da regulação do ciclo celular. Uma descrição completa e conjuntos de dados completos estão disponíveis em http://cellcycle-www.stanford.edu.


O mRNA de CDC6 flutua periodicamente no ciclo celular de levedura.

Usando culturas sincronizadas por dois procedimentos independentes, parada do fator alfa e elutriação centrífuga, investigamos a expressão do gene CDC6 de Saccharomyces cerevisiae através do ciclo celular. Nossos resultados mostram que o gene CDC6 é expresso periodicamente no ciclo celular da levedura. O nível de transcritos de CDC6 aumenta no final do G1, atingindo um pico (aproximadamente 10-20 vezes sobre o nível inicial) próximo ao limite da fase G1 / S. Observou-se que o pico do mRNA de CDC6 se sobrepõe ou precede ligeiramente o da mensagem CDC8 e, obviamente, precede o da mensagem de histona H2A em cerca de 25 min. Ao contrário do mRNA da histona H2A, o mRNA de CDC6, bem como o mRNA de CDC8, não foram afetados pelo tratamento com hidroxiureia. Esses resultados sugerem que a regulação do mRNA H2A é diferente daquela de CDC6 ou CDC8. Estudamos as regiões flanqueadoras 5 & # x27 de CDC6 e outros genes regulados pelo ciclo celular. A análise da sequência de DNA do promotor CDC6 revelou duas sequências, 5 & # x27-C / GACGCGNC / G-3 & # x27 e 5 & # x27-PuGNAGAAA-3 & # x27 (onde Pu é uma purina e N é qualquer nucleotídeo), que são repetido três vezes cada. Elementos de sequência semelhantes também foram encontrados entre vários genes regulados pelo ciclo celular, incluindo o gene CDC8, mas não são encontrados a montante dos genes das histonas. O possível significado desses elementos é discutido.


Genes regulados pelo ciclo celular e mRNA - Biologia

A expressão gênica regulada é um mecanismo importante para controlar a progressão do ciclo celular em leveduras e mamíferos, e os genes envolvidos em processos relacionados à divisão celular freqüentemente mostram regulação da transcrição dependente da posição do ciclo celular. A análise dos processos do ciclo celular em plantas tem sido dificultada pela falta de suspensões de células sincronizáveis ​​para Arabidopsis, e poucos genes regulados pelo ciclo celular são conhecidos. Usando um sistema de sincronia recentemente descrito, analisamos o RNA de amostras sequenciais deArabidopsis células que progridem através do ciclo celular usando Affymetrix Genearrays. Identificamos cerca de 500 genes que exibem de forma robusta flutuação significativa na expressão, representando a primeira análise genômica da expressão gênica regulada pelo ciclo celular em qualquer planta. Além do número limitado de genes previamente identificados como regulados pelo ciclo celular em plantas, também encontramos padrões específicos de regulação para genes conhecidos ou suspeitos de estarem envolvidos na transdução de sinal, regulação da transcrição e regulação hormonal, incluindo genes-chave da resposta da citocinina. . Os genes identificados representam caminhos que são regulados pelo ciclo celular em outros organismos e aqueles envolvidos em processos específicos de plantas. A gama e o número de genes regulados pelo ciclo celular mostram a estreita integração do ciclo celular da planta em uma variedade de controle celular e vias de resposta.


MATERIAIS E MÉTODOS

Cultura de células, sincronização e preparação de RNA

As células HeLa e U2OS foram passadas em uma incubadora umidificada a 37 ° C em DMEM com 10% de soro fetal bovino e 100 U de penicilina-estreptomicina seguindo protocolos padrão.

As células U2OS foram sincronizadas usando um protocolo de dupla timidina ou um protocolo de timidina-nocodazol. Resumidamente, 3,0 x 10 5 células foram semeadas em 16 ml de DMEM. Após 24 h de crescimento, a timidina foi adicionada a uma concentração final de 2,5 mM. Após 18 h em meio de timidina, as células foram lavadas duas vezes com CO pré-aquecido2-equilibrada solução salina tamponada com fosfato (PBS) e deixada crescer por 8 h em CO pré-aquecido2 DMEM equilibrado. Novamente a timidina foi adicionada a uma concentração final de 2,5 mM por mais 18 h. As células foram lavadas duas vezes com PBS e liberadas em DMEM. Para a sincronização timidina-nocodazol, as células U2OS foram plaqueadas (5,0 × 10 5 células) e deixadas crescer por 24 h. Timidina (2,5 mM) foi adicionada por 18 h antes das células serem lavadas duas vezes com CO pré-aquecido2-PBS equilibrado antes do tratamento com DMEM suplementado com 100 ng / ml de nocodazol por 12 h. As células flutuantes foram coletadas e giradas, lavadas duas vezes com CO pré-aquecido2-equilibrado PBS e ressuspenso em CO pré-aquecido2- DMEM equilibrado. As células não flutuantes foram lavadas duas vezes com CO pré-aquecido2-equilibrado PBS e liberado em CO pré-aquecido2- DMEM equilibrado e as células flutuantes ressuspensas foram adicionadas de volta a cada placa. As células foram coletadas a cada 2 h por um mínimo de 36 h usando RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Amostras de zero hora foram coletadas enquanto as células ainda estavam em condições de parada.

A sincronia foi monitorada por meio de análise de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) de células marcadas com iodeto de propídio (DartLab, Geisel School of Medicine no Dartmouth College) e estado de fosforilação FOXM1 ou expressão de ciclina B1 via Western blots (ver descrição posterior). As amostras foram coletadas para análise de Western blot usando tampão de amostra SDS-PAGE.

O RNA de referência foi isolado a partir de células U2OS de crescimento assíncrono usando um Mini Kit RNeasy Plus. A mesma referência foi usada para todos os experimentos de hibridização.

Hibridização e análise de microarray

Microarrays foram executados conforme descrito anteriormente (Grant et al., 2012). Resumidamente, o RNA celular foi amplificado e Cy3 (U2OS RNA assíncrono) ou Cy5 (amostra) rotulado usando o kit Quick-Amp Labeling (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) seguindo o protocolo do fabricante, exceto que os volumes de reação foram reduzidos em um- metade. O cRNA marcado foi hibridizado com arranjos de oligonucleotídeos do genoma humano total Agilent (4 × 44k) seguindo o protocolo do fabricante. Microarrays foram digitalizados usando um scanner GenePix 4000B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). As intensidades de pixel spot foram determinadas usando o software GenePix Pro 5.1. Pontos de baixa qualidade foram identificados e sinalizados manualmente e excluídos da análise subsequente. Os arranjos foram armazenados no banco de dados de microarray da Universidade da Carolina do Norte (Chapel Hill, NC UMD). Os dados completos do microarray estão disponíveis no GEO no número de acesso GSE50988 (parte da SuperSeries GSE52100).

Cada curso de tempo foi recuperado do UMD independentemente um do outro curso de tempo com as seguintes condições. Apenas pontos com razão de intensidade sobre o fundo de & gt1,5 foram usados. Genes ausentes & gt30% de seus dados foram excluídos de análises posteriores. Os genes foram normalizados usando a normalização Lowess.

Identificação de transcrições expressas periodicamente

As transcrições expressas periodicamente foram identificadas usando o mesmo método que em Whitfield et al. (2002). Resumidamente, os dados ausentes foram imputados usando um k- algoritmo de vizinhos mais próximos (Troyanskaya et al., 2001) usando k = 12. Em seguida, cada curso de tempo foi centrado removendo o primeiro eigengene (Alter et al., 2000). Os dados imputados foram removidos do conjunto de dados como a última etapa da análise.

Estimativas aproximadas do ciclo celular U2OS foram inicialmente obtidas a partir da análise de Western blot da fosforilação regulada pelo ciclo celular de FOXM1 e análise FACS para cada curso de tempo. Esta estimativa foi então refinada realizando uma transformação de Fourier em cada gene em cada curso de tempo (Whitfield et al., 2002, Eqs. 1–3) com valores de tempo igualmente espaçados (a cada 15 min) para o comprimento estimado do ciclo celular ± duas horas.

Um deslocamento (φ Whitfield et al., 2002, Eqs. 1 e 2) foi determinado para cada curso de tempo em relação ao curso do primeiro tempo. A transformada de Fourier foi então repetida para cada curso de tempo usando os seguintes valores de T e φ: Thy-Thy 1 (T = 17,65, φ = 0,0), Thy-Thy 2 (T = 18,6, φ = 0,0), Thy-Thy 3 (T = 18, φ = 0,0) e Thy-Noc (T = 23,95, φ = 2,3). Os vetores para cada conjunto de dados foram somados e os genes classificados pela magnitude de seus vetores combinados (C) Para compensar a correspondência imperfeita com as curvas de seno ou cosseno, cada gene foi escalado por sua correlação com um vetor idealizado. O vetor ideal para cada fase do ciclo celular (G1 / S, S, G2, G2 / M e M / G1) foi definido pelos perfis de expressão médios dos genes indicados na Figura 1. Usando uma correlação de Pearson padrão, cada gene recebido uma pontuação de correlação de pico, que era sua maior correlação de valor absoluto com cada um dos vetores ideais. Esta pontuação de correlação de pico foi então usada para dimensionar cada gene C, gerando uma pontuação de periodicidade para cada gene.

Dados randomizados foram então usados ​​para definir um valor de corte para a pontuação de periodicidade mínima a ser considerada regulada pelo ciclo celular. Os dados foram randomizados 10 vezes dentro de linhas apenas ou em linhas e colunas. O pipeline de análise completo foi realizado para cada uma dessas randomizações usando os mesmos parâmetros dos dados não randomizados. Escolhemos uma pontuação de periodicidade mínima de 2,65, o que nos deu 3.568 genes com uma taxa inicial de falso-positivo de 3,67% ao randomizar apenas por linhas. A inclusão do curso de tempo Thy-Noc resultou em melhores taxas de falso-positivo e falso-negativo, apesar de ter um menor grau de sincronia do que os cursos de tempo Thy-Thy (Figura Suplementar S9)

Para contabilizar os genes que receberam uma pontuação de Fourier alta, mas não tiveram um padrão de expressão sinusoidal ao longo de cada curso de tempo, calculamos as pontuações de autocorrelação (Whitfield et al., 2002, Eq. 5). Calculamos e somamos as pontuações de autocorrelação para cada curso de tempo, deixando 2.878 genes. Para remover quaisquer genes que tiveram um viés de data óbvio de problemas técnicos durante a hibridização de array, encontramos seus espectros de potência usando a transformada de Fourier de cada curso de tempo. Os genes polarizados por data foram então removidos projetando os espectros de energia em seus dois primeiros componentes principais e agrupados por k-meios (k = 2 Figura Suplementar S2). A remoção desses genes nos deu um conjunto de dados final de 2.830 sondas. As 2830 sondas correspondem a 2140 Entrez GeneIDs com 1871 identificadores de genes únicos.

ChIP-seq e análise

FOXM1 ChIP-seq foi realizado conforme descrito anteriormente (Lupien et al., 2008 Grant et al., 2012) usando o anticorpo sc-502 FOXM1 (C20 Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Resumidamente, as células HeLa assíncronas foram fixadas usando 1% de formaldeído antes da sonicação para produzir comprimentos de fragmento de DNA de 200-600 pares de bases com um Bioruptor (Diagenode, Sparta, NJ). O anti-FOXM1 foi ligado a uma mistura de Proteína A e Proteína G Dynabeads (Life Technologies, Grand Island, NY) antes de uma incubação de 18 h a 4 ° C com o DNA fragmentado. O DNA ligado foi lavado e as ligações cruzadas revertidas antes da purificação do DNA com um kit de purificação QIAquick PCR (Qiagen). As concentrações de DNA foram medidas usando Quant-iT PicoGreen (Life Technologies). A construção da biblioteca e o sequenciamento para cada execução de ChIP-seq foram realizados de forma independente no High Throughput Sequencing Facility da University of North Carolina (Chapel Hill, NC) usando um Illumina Genome Analyzer II. Os arquivos Fastq foram mapeados para o genoma humano usando Bowtie (versão 0.12) usando o sinalizador "melhor" para restringir os alinhamentos àqueles com a melhor qualidade de leitura e menos incompatibilidades. A primeira execução de ChIP-seq resultou em 17,1 milhões de leituras de sequência (8,4 leituras de sequência mapeada), e a segunda execução de ChIP-seq resultou em 17,0 milhões de leituras (8,4 milhões de leituras mapeadas de construção do genoma humano Hg18). Os picos enriquecidos foram determinados independentemente para cada execução usando MACS, versão 1.3 (execução 1, mfold 32, p & lt 1,0 × 10 −5 run 2, mfold 25, p & lt 1,0 × 10 −5 Zhang et al., 2008). Isso resultou em 5727 picos para a primeira execução e 2849 picos para a segunda. Como uma estimativa conservadora da ligação de FOXM1, analisamos a interseção das sequências sob os picos que foram encontrados em ambas as execuções de ChIP-seq, resultando em 2215 loci genômicos compartilhados de FOXM1. Em seguida, determinamos a distribuição dos loci genômicos FOXM1 compartilhados usando o cis- Sistema de anotação de elemento regulador (CEAS http://liulab.dfci.harvard.edu/CEAS/Zhang et al., 2008 Shin et al., 2009) implementado no Cistrome (www.cistrome.com/). Dados ChIP-seq brutos e arquivos BED estão disponíveis no GEO no número de acesso GSE52098 (parte do SuperSeries GSE52100).

Ensaios de luciferase em tempo real

As células U2OS foram semeadas em ~ 20-25% de densidade em placas de 30 mm e permitidas crescer por 24 h. Após 24 h, o meio de crescimento foi substituído por meio de ensaio (Phenol red-free L15 [Life Technologies], 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina / estreptomicina, 10 mM de tampão de ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfônico e luciferina 0,1 mM). As células foram então transfectadas com quantidades iguais de plasmídeo (tipicamente 250 ng de cada plasmídeo) usando FuGENE 6 (Life Technologies) seguindo o protocolo do fabricante. As placas de cultura de tecidos foram seladas com lamínulas de vidro e graxa de silicone e transferidas para o LumiCycle (Actimetrics, Wilmette, IL) a 36 ° C. A análise dos dados foi realizada com o software LumiCycle Analysis (Actimetrics).

Western blots

Os anticorpos para FoxM1 C-20 (1: 500) e cyclinB1 H-433 (1: 2000) foram adquiridos de Santa Cruz Biotechnology. A anti-gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase foi adquirida na American Research Products (Belmont, MA). Western blots foram executados seguindo protocolos padrão.

Construção de plasmídeo

Os vetores de expressão FOXM1, os construtos do promotor ACAP3 / CENTB5 e RPS6KB1 foram descritos anteriormente (Grant et al., 2012). Obtivemos construtos de promotor disponíveis comercialmente para PLK1 (S119035), CENPE (S118567), TOP2A (S118760) e RMI1 (S113323) da Switchgear Genomics (Menlo Park, CA).

A construção do promotor alvo FOXM1, pGL3-MCM8, foi clonada com base em loci ChIP-seq conforme determinado por MACS. Os primers foram projetados usando o Primer 3 (Rozen e Skaletsky, 2000) para fornecer um comprimento de amplicon entre 800 e 1000 pares de bases. Fragmentos de DNA foram amplificados por PCR e clonados em Zero Blunt TOPO (Life Technologies) antes de serem subclonados em pGL3-basic (Promega, Madison, WI) usando métodos padrão. Todos os plasmídeos foram verificados por sequenciação (Molecular Biology and Proteomics Core Facility, Dartmouth College).

Anotação funcional

A anotação funcional de genes foi realizada usando DAVID (Dennis et al., 2003 Huang da et al., 2009).

Perfis de ligação de todo o ciclo celular

Nós investigamos a distribuição dos genes-alvo do fator de transcrição no ciclo celular. Primeiro, identificamos uma lista de 2830 sondas do ciclo celular em células U2OS e as classificamos de acordo com seu tempo de expressão de pico no ciclo celular. Em seguida, examinamos o enriquecimento dos genes-alvo de um determinado fator de transcrição em cada janela deslizante do ciclo celular. Usamos um tamanho de janela de 30 ° com sobreposição de 10 ° entre as janelas vizinhas. Usamos o teste exato de Fisher para determinar a significância do enriquecimento de genes alvo para um fator de transcrição em cada janela do ciclo celular.

Os genes alvo para E2F1, E2F4 e E2F6 em células HeLa foram determinados a partir de dados ChIP-seq gerados pelo projeto ENCODE (Gerstein et al., 2012). Os genes alvo FOXM1 foram determinados a partir do ChIP-seq apresentado aqui.


Resultados

Cronometragem.

Os dados de expressão de YMC recentes (14) exibem forte modulação de genes regulados pelo ciclo celular em uma cultura de levedura de brotamento (ver SI Fig. 5). Ao examinar os perfis de expressão temporal do conjunto de dados YMC, calculamos (15) que a razão de expressão pico-a-vale média dos 108 genes regulados pelo ciclo celular bem conhecidos (ver Tabela 3 em Apêndice SI ) é 21, em comparação com & lt9 para sincronização anterior por cdc15 ou cdc28 mutantes sensíveis à temperatura ou por alfa feromônio (1, 5). Ao contrário dos dados anteriores (1, 3, 5), derivados de levedura de crescimento rápido, os dados YMC são coletados de uma cultura de levedura contínua, altamente sincronizada e de crescimento lento (14), o que nos permite distinguir melhor os picos de alguns ciclos celulares importantes genes (Fig. 2). Além disso, a sincronização inicial das células submetidas ao YMC é alcançada simplesmente deixando a população de células de fome depois que ela atinge alta densidade. Esta abordagem não depende do uso de mutantes sensíveis à temperatura, da adição de feromônio, etc. A sincronia alcançada metabolicamente (14 ), portanto, permanece notavelmente estável, durou ≈100 ciclos, enquanto a sincronização alcançada por outros métodos se deteriora visivelmente durante os primeiros três ciclos (5). A repetição estável de padrões de expressão temporal em ciclos consecutivos é um requisito essencial para a aplicação de nosso método de temporização preciso baseado em deconvolução. Portanto, optamos por basear o tempo de alta resolução apenas nos dados YMC (14), enquanto outros conjuntos de dados (1, 3, 5) foram usados ​​para a identificação do conjunto de genes regulados por transcrição do ciclo celular (CCTR).

Comparação de padrões de expressão de genes regulados pelo ciclo celular em crescimento lento [YMC (14), Deixou] vs. culturas de levedura de crescimento rápido [cdc15, alfa e cdc28 (1, 5)]. (Superior) G2 ciclina CLB1, fator de transcrição mitótico SWI5, e G1 ciclina CLN3. (Diminuir) Ciclina mitótica PCL9 e subunidade MCM MCM3. G dependente do ambiente1 fase é ≈10 vezes mais longa em YMC do que encontrada em estudos anteriores (sincronização cdc15, alfa e cdc28), permitindo que a expressão de genes-chave do ciclo celular seja cronometrada com maior precisão.

Observamos que a maioria dos genes conhecidos por serem regulados pela transcrição durante o ciclo celular compartilham um formato de perfil característico nos dados YMC (Fig. 1). Com base na análise de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) de replicação de DNA e a observação do aparecimento de botões (14), concluímos que a amplitude observada do perfil é causada não por longos períodos de transcrição, mas por células individuais que entram no ciclo celular em momentos diferentes. Para corrigir a influência dessa propagação nas concentrações medidas de mRNA, modelamos a distribuição de mudança no tempo das células que entram no ciclo celular (ver Apêndice SI ) A forma dessa distribuição é muito semelhante à distribuição da contagem de células brotadas de outras culturas sincronizadas com o ciclo celular (1), sugerindo que essa forma é uma propriedade inerente do ciclo celular, provavelmente causada por células-filhas que precisam de mais tempo do que as células-mãe para crescer o suficiente para se dividir novamente (16, 17).

Para recuperar a concentração de mRNA na célula individual típica, deconvolvemos o perfil medido usando a forma comum. O ruído intrínseco na expressão do gene de levedura brotando é baixo (18), portanto, esperamos que nosso tempo médio de expressão celular individual estimado reflita a maioria das células individuais reais. Implementamos um algoritmo de deconvolução adaptado para análise de dados de microarray (ver Apêndice SI ), com regularização baseada no princípio da máxima entropia (19). Assim, determinamos com precisão o momento do pico da expressão gênica alinhando os ciclos celulares de toda a cultura por deconvolução dos perfis de expressão observados (ver Apêndice SI ) Este método permite a recuperação de perfis de expressão de célula única, que na medição de microarray são distorcidos por causa da média dos níveis de mRNA de células sincronizadas de forma imperfeita (Fig. 3).

Os perfis de expressão medidos para toda a cultura diferem consideravelmente dos perfis de mRNA de uma única célula. A sincronização imperfeita de células resulta no alargamento dos perfis de expressão medidos na cultura (Direito), em comparação com os respectivos perfis de célula única (Deixou) Os perfis de expressão de célula única originais (UMA, C, e E) podem ser reconstruídos a partir dos perfis observados (B, D, e F, respectivamente) usando a deconvolução. Este método também pode ser aplicado quando o perfil de expressão de uma única célula é complexo (C e E) em vez de apenas um pulso de curta duração (UMA).

Picos de expressão.

Para cada transcrição, calculamos os perfis deconvolvidos (ver SI Fig. 7) e identificamos os picos de expressão (ver Apêndice SI ) A deconvolução dos perfis de expressão gênica permite a descoberta de picos de expressão secundários, mesmo quando não são evidentes nos dados brutos. Na verdade, descobrimos que muitos genes CCTR podem atingir o pico duas vezes por ciclo. Por exemplo, perfis deconvolvidos de genes de histonas mostram que todas as histonas, exceto HTB2 são expressos em duas rajadas distintas por ciclo (SI Fig. 8): a primeira ocorrendo na fase S e relacionada à replicação de DNA e a segunda em G2Fase / M (o significado funcional desta segunda onda é desconhecido) (Fig. 4 C) Outro exemplo é CDC28, discutido abaixo (SI Fig. 10). Picos secundários de genes CCTR sugerem que eles podem funcionar em vários momentos do ciclo celular ou que apenas um dos picos observados está relacionado ao ciclo celular. Exemplos de picos calculados são mostrados na Fig. 4 D e na Tabela 4 de Apêndice SI (para a lista completa, consulte a Tabela 6 em Apêndice SI ou http://cellcycle.info).

Programa de transcrição do ciclo celular da levedura. (UMA e B) Proteínas envolvidas na iniciação da replicação do DNA, codificadas por cores de acordo com o tempo de sua expressão. O complexo de pré-replicação (pré-RC) sofre várias alterações antes que um complexo de elongação (CE), capaz de iniciar a síntese de DNA, seja formado (24). A ordem da expressão (UMA) concorda com a ordem em que os produtos genéticos são necessários (B) No UMA, contornos pontilhados denotam genes não CCTR. Observe os dois grupos de subunidades MCM, cada um contendo um sinal de localização nuclear (NLS). Em B, os contornos sólidos denotam o pico da expressão primária, os contornos tracejados denotam o pico secundário (pontuação mais baixa). A única exceção à transcrição just-in-time é ORC1. (C) Sincronização dos complexos CCTR. DSE, programa de expressão específica de célula filha APC act, ativação de APC SPB sat, formação de satélite de corpo de pólo do fuso SPB sep, duplicação e separação do corpo de pólo do fuso. (D) Picos de genes CCTR selecionados. (E) Fases e subfases do ciclo celular. Observe o novo G pré-replicativo1 (P) fase. (F) Histograma de picos de expressão de genes CCTR. (G) Picos de transcritos regulados por fatores de transcrição do ciclo celular selecionados (11, 20, 21, 29, 30). Observe as diferenças na expressão dos alvos MBF e SBF. (H) Histogramas de picos de genes CCTR envolvidos em funções selecionadas do ciclo celular. Compare os picos dos alvos Cdc28p previstos (26) vs. os picos de CDC28 (D).

Genes CCTR.

Os resultados de temporização só podem ser interpretados dentro do contexto da expressão regulada pelo ciclo celular se um gene for CCTR. Para identificar os genes CCTR, examinamos os conjuntos de dados do genoma completo disponíveis nos quais genes regulados pelo ciclo celular conhecidos exibiram modulação (1, 3, 5, 14). Para cada transcrição, construímos uma pontuação probabilística com base na porcentagem de genes anteriormente propostos (1, 5) do ciclo celular transcricionalmente regulados entre os 100 mais correlacionados em cada conjunto de dados (1, 3, 5, 14) (ver Apêndice SI ) Esta pontuação identificou um conjunto de CCTR de alta confiança que consiste em 694 genes e um conjunto estendido de 1.129 genes (ver Tabela 6 em Apêndice SI ) Validamos esses conjuntos de CCTR usando dados experimentais de ligação de fator de transcrição (11, 20, 21), bem como motivos de ligação de fator de transcrição conservados entre espécies de fungos relacionados (22, 23). Ambos os testes mostraram que nossos conjuntos de CCTR são mais consistentes com os dados de regulação da transcrição independente do que os conjuntos derivados de grupos menores de experimentos (3, 5) (ver Tabelas 1 e 2 em Apêndice SI ) Doravante, o termo "genes CCTR" refere-se ao conjunto de alta confiança.

Estimativa de erro.

Para estimar a robustez do procedimento de temporização, investigamos até que ponto os horários de pico obtidos são afetados por erros esperados nas concentrações de mRNA medidas (ver Apêndice SI ) Confirmamos que o método de tempo é muito robusto, o valor médio do erro total estimado para horários de pico previstos é de 2 min (ver Tabela 6 em Apêndice SI ) Esse tempo de alta precisão permite a anotação de cada transcrição em uma pequena fração de uma fase do ciclo celular e revela diferenças de outra forma indetectáveis ​​nos tempos de expressão do gene. A lista completa de genes CCTR, juntamente com seus picos de expressão e estimativas de erro, está disponível online em http://cellcycle.info.

Atribuição de fases e subfases.

Definimos intervalos de tempo correspondentes às principais fases do ciclo celular (Fig. 4 E) usando picos de expressão de genes do ciclo celular conhecidos (ver Tabela 5 em Apêndice SI ) O histograma de picos de expressão de genes CCTR (Fig. 4 F) revela duas ondas principais de transcrição, separadas por intervalos de quase nenhuma atividade transcricional de CCTR, entre o final de S e o final de G2 fases e na maior parte do G1 Estágio. Esta variação dramática na atividade transcricional entre os estágios do ciclo celular não foi descrita anteriormente (5) (SI Fig. 6). Além das ondas de expressão proeminentes em G1/ S – S e G2/ M – M, o histograma na Fig. 4 F revela uma onda de expressão distinta, previamente não identificada (1, 3, 5), precedendo o início da replicação do DNA. No YMC, essa onda se estende por 45 minutos e abrange 19% dos genes CCTR. Porque a maioria das subunidades do complexo pré-replicativo são expressas nesta fase (Fig. 4 UMA), propomos designá-lo como "pré-replicativo" ou "G1 (P) ”fase. Outros genes expressos em G1 (P) estão envolvidos na preparação para brotamento (por exemplo, RSR1, BUD13, GIC2, RAX1, PEA2, e BNI4) e na síntese de componentes da parede celular (por exemplo, FKS1, GAS1, e GAS5) Em estudos anteriores, G1 Os genes (P) foram talvez incorretamente atribuídos a diferentes fases do ciclo celular (1, 5). Mais de um terço foi anotado como sendo expresso em mitose ou M / G1 (1, 5), incluindo todas as subunidades do complexo MCM e o G1 ciclina CLN3 (1, 5). Our timing places expression of these genes at the beginning of the new cycle, suggesting involvement in preparation for a round of division rather than for entry into extended G1 phase, which is more consistent with their known biological function (6, 24).

Another gene expressed in G1 (P) phase is CDC28, the catalytic subunit of the main yeast cyclin-dependent kinase, which drives progress through the cell cycle (25). Our study, which classifies CDC28 as periodic, challenges the established view (3, 5, 8, 12, 25) that CDC28 is constitutively expressed. We determined that CDC28 expression peaks twice per cycle, first in G1 (P) phase and again in early mitosis (Fig. 4 C), precisely coinciding with expression waves of its predicted targets (26) (Fig. 4 H) The periodicity of CDC28 expression in YMC is strikingly clear (SI Fig. 10 P < 0.00003) it also is not an artifact of metabolic regulation, because a similar profile of CDC28 had been earlier observed under different cell cycle synchronization (1) (SI Fig. 5). The lack of earlier acceptance of CDC28 as transcriptionally regulated seems to be rather an artifact of the Fourier methods used (3, 5, 8), which, although convenient, are unable to deal appropriately with genes expressed twice per cycle (see Apêndice SI ).

Our timing results have also clarified when some key cell cycle genes are expressed. For instance, on the basis of experiments with rapidly growing yeast (1, 5), CLB1, SWI5, e CLN3 have all been thought to be expressed during mitosis (1, 5), whereas our data suggest that G2 cyclin CLB1 is expressed in G2, SWI5 in G2/M, and CLN3 upon reentry to the cell cycle, in G1 (P) (see Fig. 2). Similarly, we find that the Swi5-activated cyclin, PCL9, is expressed in mitosis and MCM3 is expressed in G1 (P), and consequently their expression can be delayed by an arbitrarily long G1 phase, although, on the basis of experiments with rapidly growing yeast (1, 5), they were both believed to be expressed in M/G1 (Fig. 2). Our timing results consistently place the expression of these key genes just before the time their products are needed within the cell cycle (6, 24).

Initiation of DNA Replication.

The initiation of DNA replication occurs at the beginning of S phase and requires the prior assembly and subsequent modifications of the prereplicative complex (24), which starts in G1 (P) (Fig. 4 B) Strikingly, our timing of the expression peaks of CCTR subunits of MCM, replicative complex and elongation complex, corresponds with the exact order in which their gene products are needed (Fig. 4 UMA e B) The subunits of the origin of replication complex, ORC2–6, have not previously been classified as transcriptionally regulated, nor did they pass the stringent criteria of being accepted as CCTR in this study. Still, applying the deconvolution timing to their expression profiles reveals that these genes have expression peaks ≈10 min before the MCM subunits, exactly when their products are needed. This observation raises the possibility that the transcription of ORC2–6 is regulated as a function of the cell cycle, contrary to established beliefs (1, 3, 5, 8) (Fig. 4 UMA).

A more detailed view reveals that subunits of the MCM complex are expressed in two groups of three, separated by an ≈8-min interval, with each predicted expression group containing one MCM subunit with a nuclear localization signal (27) (Fig. 4 UMA) These results may provide insight into the dynamics of MCM complex assembly and transport from cytoplasm into nucleus (28).

The precision of our timing data reveals that the SBF- and MBF-activated expression programs, thought to be identically timed during the mitotic cell cycle (29), actually differ (Fig. 4 G) Unlike MBF, whose targets peak predominantly in G1/S phase, targets of SBF are also activated in G1 (P) phase and are generally characterized by a broader time distribution (Fig. 4 G) This conclusion holds, independent of whether SBF and MBF targets are defined based on evolutionary analysis of conserved binding sites in 17 related fungus species or on various experimental studies (29, 30).

Cell Cycle-Regulated Complexes.

We also timed expression of several other complexes, such as the spindle pole body (SPB) (Fig. 4 C) (see Table 5 in Apêndice SI ) We observed especially tight transcriptional coregulation for complexes active in late G1 and S phase the elapsed time between expression peaks of the first and last CCTR subunits of a complex is between 5 min (RFA) and 22 min (histones) (Fig. 4 C) Transcription of many non-CCTR subunits of the cell cycle complexes also exhibits variability, allowing for timing, albeit weak. For example, only three subunits of RFC are CCTR, although expression of all five subunits occurs in the same 12-min interval (Fig. 4 C). ORC2–6 exhibit even weaker modulation, but interestingly their expression timing is nevertheless very consistent with the time in which they function (Fig. 4 UMA e B) The anaphase-promoting complex (APC) contains only two CCTR subunits, although the expression peaks of most of its 16 subunits appear in a time interval broadly corresponding to mitosis (Fig. 4 C) However, some APC subunits, e.g., Cdh1, seem to be only posttranscriptionally regulated (31).

We generally find more subunits of the cell cycle-involved complexes to be CCTR than was the case in previous studies (2, 5, 8) (Fig. 4 and see Apêndice SI and http://cellcycle.info). This difference may be explained by the increased quantity and improved accuracy of cell cycle expression data, together with our comprehensive approach to identifying CCTR genes. In addition to the examples discussed above and complexes involved in DNA replication initiation, we find more components of the septin ring of the mother-bud neck to be CCTR. Previous studies (2, 3, 5, 8) each classified only one septin (either CDC11 ou CDC10) as cell cycle-regulated, whereas we classify three components of the septin ring (CDC11, CDC12, e CDC3) as CCTR. Our classification of CDC11, CDC12, e CDC3 as coregulated is independently supported by timing results (not used for classification), which places their expression peaks within an ≈6-min interval in late S phase.


Data availability

  1. Cho RJ
  2. Campbell MJ
  3. Winzeler EA
  4. Steinmetz L
  5. Conway A
  6. Wodicka L
  7. Wolfsberg TG
  8. Gabrielian AE
  9. Landsman D
  10. Lockhart DJ
  11. Davis RW
  1. Jensen LJ
  2. Kuhn M
  3. Stark M
  4. Chaffron S
  5. Creevey C
  6. Muller J
  7. Doerks T
  8. Julien P
  9. Roth A
  10. Simonovic M
  11. Bork P
  12. von Mering C
  1. Kozar K
  2. Ciemerych MA
  3. Rebel VI
  4. Shigematsu H
  5. Zagozdzon A
  6. Sicinska E
  7. Geng Y
  8. Yu Q
  9. Bhattacharya S
  10. Bronson RT
  11. Akashi K
  12. Sicinski P
  1. Lamond AI
  2. Uhlen M
  3. Horning S
  4. Makarov A
  5. Robinson CV
  6. Serrano L
  7. Hartl FU
  8. Baumeister W
  9. Werenskiold AK
  10. Andersen JS
  11. Vorm O
  12. Linial M
  13. Aebersold R
  14. Mann M
  1. Luber CA
  2. Cox J
  3. Lauterbach H
  4. Fancke B
  5. Selbach M
  6. Tschopp J
  7. Akira S
  8. Wiegand M
  9. Hochrein H
  10. O’Keeffe M
  11. Mann M
  1. Matys V
  2. Kel-Margoulis OV
  3. Fricke E
  4. Liebich I
  5. Land S
  6. Barre-Dirrie A
  7. Reuter I
  8. Chekmenev D
  9. Krull M
  10. Hornischer K
  11. Voss N
  12. Stegmaier P
  13. Lewicki-Potapov B
  14. Saxel H
  15. Kel AE
  16. Wingender E
  1. Ohta S
  2. Bukowski-Wills JC
  3. Sanchez-Pulido L
  4. Alves Fde L
  5. Wood L
  6. Chen ZA
  7. Platani M
  8. Fischer L
  9. Hudson DF
  10. Ponting CP
  11. Fukagawa T
  12. Earnshaw WC
  13. Rappsilber J
  1. Olsen JV
  2. Vermeulen M
  3. Santamaria A
  4. Kumar C
  5. Miller ML
  6. Jensen LJ
  7. Gnad F
  8. Cox J
  9. Jensen TS
  10. Nigg EA
  11. Brunak S
  12. Mann M
  1. Ramaswamy S
  2. Tamayo P
  3. Rifkin R
  4. Mukherjee S
  5. Yeang CH
  6. Angelo M
  7. Ladd C
  8. Reich M
  9. Latulippe E
  10. Mesirov JP
  11. Poggio T
  12. Gerald W
  13. Loda M
  14. Lander ES
  15. Golub TR
  1. Su AI
  2. Cooke MP
  3. Ching KA
  4. Hakak Y
  5. Walker JR
  6. Wiltshire T
  7. Orth AP
  8. Vega RG
  9. Sapinoso LM
  10. Moqrich A
  11. Patapoutian A
  12. Hampton GM
  13. Schultz PG
  14. Hogenesch JB
  1. Subramanian A
  2. Tamayo P
  3. Mootha VK
  4. Mukherjee S
  5. Ebert BL
  6. Gillette MA
  7. Paulovich A
  8. Pomeroy SL
  9. Golub TR
  10. Lander ES
  11. Mesirov JP
  1. Tian Q
  2. Stepaniants SB
  3. Mao M
  4. Weng L
  5. Feetham MC
  6. Doyle MJ
  7. Yi EC
  8. Dai H
  9. Thorsson V
  10. Eng J
  11. Goodlett D
  12. Berger JP
  13. Gunter B
  14. Linseley PS
  15. Stoughton RB
  16. Aebersold R
  17. Collins SJ
  18. Hanlon WA
  19. Hood LE
  1. Uhlen M
  2. Oksvold P
  3. Fagerberg L
  4. Lundberg E
  5. Jonasson K
  6. Forsberg M
  7. Zwahlen M
  8. Kampf C
  9. Wester K
  10. Hober S
  11. Wernerus H
  12. Björling L
  13. Ponten F
  1. Whitfield ML
  2. Sherlock G
  3. Saldanha AJ
  4. Murray JI
  5. Ball CA
  6. Alexander KE
  7. Matese JC
  8. Perou CM
  9. Hurt MM
  10. Brown PO
  11. Botstein D
  1. Zhu J
  2. Heyworth CM
  3. Glasow A
  4. Huang QH
  5. Petrie K
  6. Lanotte M
  7. Benoit G
  8. Gallagher R
  9. Waxman S
  10. Enver T
  11. Zelent A

Materiais e métodos

Strains, Plasmids, Growth Conditions, and Genetic Methods

Yeast strains and plasmids are described in Table and Table. Standard yeast genetic procedures and media (Rose et al. 1990) were used, unless specified. For producing a bud3 deletion, plasmid pJC15 (Chant et al. 1995) carrying the bud3 deletion was linearized with BamHI and EcoRI and transformed into strain JC1030. Ura + transformants that exhibited the bipolar pattern were isolated.

Plasmid Construction

PJC16 (prom GAL1 -BUD3).

An EcoRI/BamHI GAL1 promoter fragment was liberated from pRS316-GAL (E. Bi, University of Pennsylvania Medical School, Philadelphia, PA). An isolate of BUD3 in YCp50, p35-1 (Chant et al. 1995), was digested with BamHI and SalI to liberate the BUD3 região. The linearized YCp50 was then digested with EcoRI. o GAL1 promoter fragment and the BUD3 fragment were then double ligated into the EcoRI/SalI YCp50 to yield BUD3 under the control of the GAL1 promoter.

PJC117 (prom MET3 -hemagglutinin [HA]-BUD3).

A 700-bp MET3 promoter region was amplified from JC1030 genomic DNA with Pfu polymerase (Stratagene) using primers: MET3promoter (prom) 1 -BamHI-5′ (5′-GCGCGCGGATCCAATACCCGTCAAGATAAGAG-3′) and MET3prom-HindIII-3′ (5′-GCGCGCAAGCTTGTTAATTATACTTTATTCTTG-3′). o MET3 promoter was ligated into pAD5 via the BamHI and HindIII sites of the primers, replacing the alcohol dehydrogenase promoter of pAD5. o BUD3 sequence was PCR amplified with Pfu polymerase from p35-1, and the fragment was ligated into MET3 promoter-containing pAD5 via SalI and SacI sites present in the vector and the primers. Primers were BUD3-SalI-5′ (5′-CTATGTCGACTATGGA-GAAAGACCTGTCGTC-3′) and BUD3-SacI-3′ (5′-GACTGAGCT-CTCCGATAATTCTCACAGG-3′).

PJC1869 (prom MET3 -BUD10-HA).

623 bp of the 5′ portion of the BUD10 coding region were amplified from pJC246 with Pfu polymerase using the primers BUD10-KpnI-5′ (5′-CCCCCCGGTACCATGACACAGCTTCAGATTT-3′) and BUD10-AgeI-3′(5′-GAAAATCCTTCAATGTCTGTAGCG-3′). pJC246 was linearized by KpnI and AgeI, which resulted in excision of the BUD10 promoter and 623 bp of the BUD10 open reading frame up to the unique AgeI site. This linearized plasmid was gel purified and ligated with the 5′ BUD10 PCR product that had been digested with KpnI and AgeI. The resulting construct (pJC255) contained BUD10-HA lacking the BUD10 promoter. BUD10-HA was excised from pJC255 by digestion with KpnI and SpeI, gel purified, and ligated into KpnI/SpeI linearized pJC1830 to yield pJC1869 carrying BUD10-HA debaixo de MET3 promoter.

PJC256 and pJC257 (prom BUD3 -BUD10-HA).

600 bp of BUD3 upstream sequence were amplified from p35-1 with Pfu polymerase using the primers BUD3prom-EcoRI-KpnI-5′ (5′-GGGGAATTCGGTACCCCGGATCCTGTATTATATCCAGTAA-3′) and BUD3prom-EcoRI-KpnI-3′ (5′-GGGGAATTCGGTACCTGGTGAGGTGTAAATATACTCTTT-3′). The PCR product was ligated into pBluescript via the EcoRI sites of the primers. Ligation products were digested with KpnI to liberate the BUD3 promoter, which was ligated into the KpnI site of pJC255. Two resulting constructs (pJC256 and pJC257) were sequenced (Harvard Medical School, DNA Core Facility), and it was confirmed that the constructs carried BUD10 debaixo de BUD3 promoter.

Overexpression of BUD3

o BUD3-overexpression construct (pJC16) and YCp50 (control vector) were transformed into EJY301. Ura + colonies carrying the plasmids were selected. Each transformant was grown overnight in Ura − glucose complete synthetic medium (CSM). The cultures were divided into two samples, harvested, washed twice, and resuspended in either Ura − glucose or Ura − galactose CSM for 24 h. Morphological analysis of cells was performed by counting normally dividing cells versus cells producing elongated buds. For each sample, 600 cells were scored. Visualization of Cdc3-HA in all samples was performed by immunofluorescence, as described below.

Preparation of RNA Samples from Synchronized Cell Cultures

JC1362 (containing wild-type copies of BUD3 e BUD10) in rich medium, JC2123 carrying pJC117 (prom MET3 -BUD3) in Leu − Met − CSM, JC2133 carrying pJC256 (prom BUD3 -BUD10) in Trp − CSM, and JC2133 carrying pJC1869 (prom MET3 -BUD10) in Trp − Met − CSM were grown up overnight in 500-ml cultures at 25°C. When cultures reached an optical density at 600 nm (OD600) of ∼0.15, they were harvested and resuspended in 500 ml of their respective growth media that had been prewarmed to 37°C. cdc15-2 ts –based arrest was attained by incubation of cultures at 37°C for 4.5 h. Arrest was confirmed microscopically and cells were chilled on ice for 5–10 min before resumption of growth at 25°C (0 min after release from arrest). Samples (25 ml) were harvested every 15 min (for JC1362) or 30 min (for all others), frozen in liquid nitrogen, and stored at −80°C at time points from 0–240 min after arrest. These 25-ml samples were used for subsequent RNA sample preparation. The Hot Phenol Method of total RNA preparation (Köhrer and Domdey 1991) was used. In addition, at every time point, 1 ml of culture was fixed in 4% formaldehyde for 30 min at 30°C. These samples were used to determine the budding index (the number of budded cells versus unbudded cells). For the initial portions of the synchronizations (60 min for Fig. 1, Fig. 3, and Fig. 4, and 90 min for Fig. 2 and Fig. 6) a modification of this basic method was used. Cells were scored as small budded versus other, due to the fact that cells recovering from the cdc15-2 block are delayed in completing cell separation. Cultures synchronized in identical fashion were used to correlate budding index with spindle morphology.

Northern Blotting

Standard methods were employed (Sambrook et al. 1989) with the following modifications. 5 μl of RNA samples were mixed with 10 μl of RNA loading buffer (Ambion) and run on 1% agarose-MOPS gels containing 6% formaldehyde. Running buffer was 1× MOPS. Gels were washed five times in 0.1% diethyl pyrocarbonate–treated water then by a 45-min equilibration in 20× SSC. RNA was subjected to capillary transfer overnight onto Zeta Probe (Bio-Rad Laboratories) nylon membranes. Membranes were washed for 5 min in 6× SSC and dried at room temperature for 30 min on paper towels before baking them in a vacuum oven at 80°C for 1.5 h. Membranes were prehybridized for 1 h in UltraHyb (Ambion) at 55°C then hydridized overnight at 55°C with the appropriate radioactively labeled probes. 0.5–1.5 kb of BUD3, BUD10, LEU2, ou ACT1 were PCR amplified, gel purified, and used as templates for the manufacture of probes through the use of the “Prime-a Gene” Labeling System (Promega). After hybridization, membranes were washed twice at 55°C for 15 min in 2× SSC/0.1% SDS, and then by two washes for 30 min in 0.1× SSC/0.1% SDS. Blots were exposed to a BAS-III Imaging Plate (Fuji) for appropriate times. The Imaging Plate was processed by a Fujix BAS 2000 Imager (Fuji). Images were analyzed by MacBAS V2.5 (Fuji). Blots were stripped for reprobing by washing three times for 20 min in 0.1× SSC/0.5% SDS at 95°C.

Immunofluorescence and Calcofluor Staining

JC1997 carrying pJC117 (prom MET3 -BUD3) was grown overnight in Leu − Met − CSM. JC1296 carrying pJC246 (prom BUD10 -BUD10) or pJC256 (prom BUD3 -BUD10) was grown in Trp − CSM overnight. JC1296 carrying pJC1869 (prom MET3 -BUD10) was grown in Trp − Met − CSM overnight. At an OD600 of 0.3–0.5, cells were fixed in 4% formaldehyde at 30°C for 30–60 min and washed three times in PBS. Indirect immunofluorescence was performed as described by Pringle et al. 1991. A mouse anti-HA epitope monoclonal antibody (Jackson ImmunoResearch Laboratories) or rabbit anti-Bud3p antibody (Chant et al. 1995) was used to visualize the two proteins. The secondary antibodies used were CY3-conjugated goat anti–mouse IgG and FITC-conjugated goat anti–rabbit IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Microtubule staining was performed as described in Chant et al. 1995. Budding patterns were scored by staining bud scars with Calcofluor and observing with fluorescence microscopy (Pringle 1991) 200–300 cells were scored for each set of counts. Fluorescence microscopy was performed using a Nikon Microphot SA microscope with a 63× Plan-apo objective.

Western Blot Analysis

15 OD600 units of cells were harvested and washed with distilled water. Cells were resuspended in 150 μl lysis buffer (1% SDS, 2 mM PMSF plus protease inhibitors) and lysed with glass beads by vortexing on ice for a total of 6 min. 100 μl of lysis buffer was added to the extracts that were then centrifuged at 500 g for 2 min. Lysates were decanted and stored at −80°C if they were not required immediately. The protein concentrations of the lysates were determined using Pierce Coomassie Plus protein reagent (Pierce Chemical Co.). Equal protein levels from each lysate were loaded onto an SDS-PAGE gel and immunoblotted by standard methods (Sambrook et al. 1989). Mouse anti-HA epitope monoclonal primary antibodies (Jackson ImmunoResearch Laboratories) were used at a dilution of 1:500. Secondary antibodies were goat anti–mouse antibodies conjugated to horseradish peroxidase (Sigma–Aldrich) used at a dilution of 1:2,500. Blots were developed using the ECL Western blotting detection system (Amersham Pharmacia Biotech). Autoradiographs were scanned and the protein bands were quantitated using the MacBAS V2.5 program.

Pulsed Expression Experiments

Unsynchronized Cells.

JC1296 carrying pJC1869 (prom MET3 -BUD10) was grown in repressing conditions (4 mM methionine, Trp − CSM) overnight. At an OD600 of ∼0.25, cells were spun down and washed three times in inducing medium (Trp − Met − CSM), and followed by a 30 min incubation in the same medium. Induction of BUD10 expression was terminated by the addition of 4 mM methionine. Samples were harvested and fixed in formaldehyde (as described above) at 0, 60, and 120 min after cells were removed from inducing conditions. All samples were washed three times in PBS. Samples were subjected to analysis by immunofluorescence, as described above. Typically, 100 cells were scored per sample.

Synchronized Cells.

JC2133 carrying pJC1869 (prom MET3 -BUD10) was grown up at 25°C in repressing conditions (4 mM methionine, Trp − CSM) overnight. Cell synchronization was achieved as described earlier using the cdc15-2 ts mutation. The synchronized culture was divided in two: one half for late G1 induction and the other half for S/G2 induction. All subsequent incubations were performed at 25°C. 35 min after release from cell cycle arrest, late G1 induction was performed by the following method: cells were washed three times in inducing medium (Trp − Met − CSM) and incubated 45 min in the same medium. Induction was terminated by addition of 4 mM methionine and an additional brief incubation. At 90 min after release from arrest, cell samples were taken and fixed (as performed above). Cells were washed three times in PBS and subjected to analysis by immunofluorescence. S/G2 induction was performed in identical fashion, but 110 min after release from cell cycle arrest.


Cell cycle-regulated genes and mRNA - Biology

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The yeast cell cycle analysis project's goal is to identify all genes whose mRNA levels are regulated by the cell cycle. This site complements the published information from:

Spellman et al., (1998). Comprehensive Identification of Cell Cycle-regulated Genes of the Yeast Saccharomyces cerevisiae by Microarray Hybridization. Molecular Biology of the Cell 9, 3273-3297.

Full text of the paper is available from the Journal's website here .


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Partial table of contents:

RNA Structure (E. Puglisi & J. Puglisi).

Transcription and Transcriptional Control: An Overview (I. Olave,et al.).

Constitutive and Alternative mRNA Splicing (S. Bernstein & D.Hodges).

mRNA Polyadenylation: Functional Implications (E. Baker).

RNA Export from the Nucleus (L. Maquat).

The Intracellular mRNA Sorting System: Postal Codes, Zip Codes,Mail Bags and Mail Boxes (O. Steward & R. Singer).

The Fundamentals of Translation Initiation (H. Huang & T.Donahue).

Mechanisms of mRNA Turnover in Eukaryotic Cells (S. Tharun & R.Parker).

Control of mRNA Decay in Plants (A. van Hoof & P. Green).

mRNA Metabolism and Cancer (M. Korth & M. Katze).

Translational Regulation in Animal Virus-Infected Cells (R.Schneider).

RNA Decay by the Interferon-Regulated 2-5A System as a Host DefenseAgainst Viruses (R. Silverman & N. Cirino).


Assista o vídeo: InfoPlus - Biologia 3 - Animacja 1 - Animacja przebiegu mitozy (Novembro 2021).