Em formação

Como posso avaliar a hidrofobicidade e / ou carga superficial de uma proteína?


Como devo avaliar as superfícies das proteínas em termos de hidrofobicidade e propriedades de carga superficial da superfície.

Em particular, estou procurando comparar manchas hidrofóbicas ou carga de superfície entre duas proteínas, de sequências .pdb ou Fasta, por exemplo.

O objetivo é estudar o mecanismo de adsorção de proteínas no contexto da purificação de proteínas.


Já que você tem as estruturas, a melhor opção, na minha opinião, é o Pymol.

Hidrofobicidade

Pymol aberto. Carregue sua proteína preferida. Baixe color_h.py que é um script da Universidade de Osaka que colore os resíduos de acordo com a escala de hidrofobicidade de Eisenberg. Carregue isso no Pymol porArquivo-> Executar-> PATH / TO / color_h.py. Em seguida, no Pymol execute os seguintes comandos

  1. mostrar superfície

  2. color_h

Observe que o script pode ser editado para usar as escalas de sua preferência. @mimat aponta para protscale e eu sugeriria o mesmo. A escala de Eisenberg é uma escala de consenso bastante antiga. Escalas mais atualizadas podem ser mais apropriadas no seu caso.

Para começar a quantificar isso, Pymol tem ferramentas para calcular a acessibilidade a solventes, por exemplo.

Além disso, o PDBSum e o PDBe-PISA podem estimar a área de superfície acessível ao solvente.

Carga de superfície

Eletrostática a vácuo

A maneira mais rápida e fácil de gerar eletrostática é com as ferramentas integradas de eletrostática a vácuo. Em Pymol, selecione obotão de ação (A) -> gerar-> eletrostática a vácuo-> potencial de contato da proteína.

ABPS

Uma vez que a eletrostática embutida do Pymol faz muitas suposições, para publicação é melhor obter um mapa de superfície quantificado com muito mais precisão. No entanto, o ABPS é um pouco mais envolvido. Leia o wiki se for mais parecido com o que você precisa.


Eu acho que você está atrás de uma escala maior. Dá a você um monte de opções para prever como sua proteína se "comportará" para purificação e hidrofobicidade por HPLC, resíduos enterrados, etc.


Ponto de isolação eletrica

o ponto de isolação eletrica (pI, pH (I), IEP), é o pH no qual uma molécula não carrega nenhuma carga elétrica líquida ou é eletricamente neutra na média estatística. A nomenclatura padrão para representar o ponto isoelétrico é pH (I). [1] No entanto, pI também é usado. [2] Para resumir, este artigo usa pI. A carga líquida na molécula é afetada pelo pH do ambiente circundante e pode se tornar mais carregada positiva ou negativamente devido ao ganho ou perda, respectivamente, de prótons (H +).

As superfícies carregam naturalmente para formar uma camada dupla. No caso comum, quando os íons determinantes da carga superficial são H + / HO -, a carga superficial líquida é afetada pelo pH do líquido no qual o sólido está submerso.

O valor pI pode afetar a solubilidade de uma molécula em um determinado pH. Essas moléculas têm solubilidade mínima em água ou soluções salinas no pH que corresponde ao seu pI e freqüentemente precipitam fora da solução. Moléculas anfotéricas biológicas, como proteínas, contêm grupos funcionais ácidos e básicos. Os aminoácidos que constituem as proteínas podem ser de natureza positiva, negativa, neutra ou polar e, juntos, fornecem à proteína sua carga geral. Em um pH abaixo de seu pI, as proteínas carregam uma carga líquida positiva acima de seu pI, elas carregam uma carga líquida negativa. As proteínas podem, portanto, ser separadas por carga líquida em um gel de poliacrilamida usando eletroforese em gel preparativa, que usa um pH constante para separar proteínas, ou focagem isoelétrica, que usa um gradiente de pH para separar proteínas. A focagem isoelétrica também é o primeiro passo na eletroforese em gel de poliacrilamida 2-D.

Em biomoléculas, as proteínas podem ser separadas por cromatografia de troca iônica. As proteínas biológicas são constituídas por compostos de aminoácidos zwitteriônicos, a carga líquida dessas proteínas pode ser positiva ou negativa dependendo do pH do ambiente. O pI específico da proteína alvo pode ser usado para modelar o processo em torno e o composto pode então ser purificado do resto da mistura. Tampões de vários pH podem ser usados ​​para este processo de purificação para alterar o pH do ambiente. Quando uma mistura contendo uma proteína alvo é carregada em um trocador de íons, a matriz estacionária pode ser carregada positivamente (para ânions móveis) ou negativamente (para cátions móveis). Em valores de pH baixos, a carga líquida da maioria das proteínas na mistura é positiva - em trocadores de cátions, essas proteínas carregadas positivamente se ligam à matriz carregada negativamente. Em altos valores de pH, a carga líquida da maioria das proteínas é negativa, onde elas se ligam à matriz carregada positivamente em trocadores de ânions. Quando o ambiente está em um valor de pH igual ao pI da proteína, a carga líquida é zero e a proteína não está ligada a nenhum trocador e, portanto, pode ser eluída. [3]


Como posso avaliar a hidrofobicidade e / ou carga superficial de uma proteína? - Biologia

QUÍMICA DE PROTEÍNAS

INFORMAÇÕES DE FUNDO: Você pode querer consultar o Guia de Predição de Estrutura de Robert Russell. Para as propriedades bioquímicas dos aminoácidos, consulte PROWL, Amino Acid Hydrophobicity e Amino Acid Chart and Reference Table (GenScript). Se você estiver especificamente interessado em anticorpos, eu recomendo que você visite a & quotA página de recursos de anticorpos. & Quot

Composição de aminoácidos e massa & ndash ProtParam (ExPASy, Suíça)
Ponto de isolação eletrica - Ferramenta de cálculo de pI / Mw (ExPASy, Suíça). Se você quiser um gráfico da relação entre a carga e o pH, use o ProteinChemist (ProteinChemist.com) ou JVirGel Proteomic Tools (PRODORIC Net, Alemanha).
Massa, pI, composição e mol% ácidos, básicos, aromáticos, polares, etc. aminoácidos - PEPSTATS (EMBOSS). Bioquímica - online (Vitalonic, Rússia) dá um% de composição, peso molecular, pI e carga em qualquer pH desejado.

Calculadora de peso molecular de peptídeos (GenScript) - a calculadora online determina a fórmula química e o peso molecular do seu peptídeo de interesse. Você também pode especificar modificações pós-translacionais, como modificações dos terminais N e C e posicionamento de pontes dissulfeto, para obter resultados mais precisos.

Calculadora de ponto isoelétrico 2.0 (IPC 2.0) - é um servidor para a previsão de pontos isoelétricos e pKuma valores usando uma mistura de aprendizagem profunda e modelos de regressão de vetor de suporte. A precisão de predição (RMSD) do IPC 2.0 para proteínas e peptídeos supera os algoritmos anteriores. (Referência: Kozlowski LP (2021) Nucl. Acids Res. Web Server issue).

Cálculo de Composição / Peso Molecular (Georgetown University Medical Center, EUA) - o único problema com este site é que quando executado em modo batch não identifica a sequência pelo nome, apenas pelo número sequencial

Calculadora de proteína (C. Putnam, The Scripps Research Institute, EUA) - calcula a massa, pI, carga em um determinado pH, conta os resíduos de aminoácidos etc.

Predictor Tm (P.C. Lyu Lab., National Tsing-Hua University, Taiwan) - calcula a temperatura teórica de fusão da proteína.

Antigenicidade e alergenicidade: um bom lugar para começar seria The Immune Epitope Database (IEDB)

Abie Pro Peptide Anticorpo Design (Chang Bioscience)

Servidores de alergenicidade: AllerTOP (Referência: Dimitrov, I. et al. 2013. BMC Bioinformatics 14(Suplemento 6): S4), AlgPred - predição de proteínas alergênicas e mapeamento de epítopos IgE (Referência: Saha, S. e Raghava, G.P.S. 2006. Nucleic Acids Research 34: W202-W209.), E SDAP - Structural Database of Allergenic Proteins (Referência: Ivanciuc, O. et al. 2003. Nucleic Acids Res. 31: 359-362).

EpiToolKit - é uma bancada de trabalho virtual para questões imunológicas com foco no design de vacinas. Ele oferece uma variedade de ferramentas de imunoinformática cobrindo genotipagem MHC, predição de epítopos e neoepítopos, seleção de epítopos para projeto de vacina e montagem de epítopos. Em sua versão 2.0 recentemente reimplementada, o EpiToolKit oferece uma gama de novas funcionalidades e, pela primeira vez, permite combinar ferramentas em fluxos de trabalho complexos. Para usuários inexperientes, ele oferece interfaces simplificadas para guiá-los na análise de conjuntos de dados imunológicos complexos. (Referência: Schubert S et al. (2015) Bioinformatics 31(13): 2211 e ndash2213).

VIOLIN - Vacine euinvestigação e Oneuine euinformação Network - permite fácil curadoria, comparação e análise de dados de pesquisa relacionados a vacinas em vários patógenos humanos. VIOLIN deve se tornar uma fonte centralizada de informações de vacinas e fornecer aos investigadores em ciências básicas e clínicas dados com curadoria e ferramentas de bioinformática para pesquisa e desenvolvimento de vacinas . VBLAST: Customized BLAST Search for Vaccine Research permite várias estratégias de pesquisa contra 77 genomas de 34 patógenos. (Referência: He, Y. et al. 2014. Nucleic Acids Res. 42 (problema de banco de dados): D1124-32).

SVMTriP - é um novo método para prever o epítopo antigênico com a última entrada de sequência do banco de dados IEDB. Em nosso método, Support Vector Machine (SVM) foi utilizado combinando a similaridade Tri-peptídeo e pontuações de propensão (SVMTriP) a fim de alcançar o melhor desempenho de predição. Além disso, o SVMTriP é capaz de reconhecer peptídeos virais de um fundo de sequência de proteína humana. (Referência: Yao B et al. (2012) PLoS One 7(9): e45152).

Solubilidade e cristalizabilidade:

EnzymeMiner - oferece mineração automatizada de enzimas solúveis com diversas estruturas, propriedades catalíticas e estabilidades. A previsão de solubilidade emprega o preditor SoluProt interno desenvolvido usando aprendizado de máquina. (Referência: Hon J et al. 2020. Nucl Acids Res 48 (W1): W104 e ndashW109).

ESPRESSO (ESestimativa de PRoteína ExpreSSion e TÃOlubilidade) - é um preditor baseado em sequência para estimar a expressão e solubilidade de proteínas para três sistemas de expressão de proteínas diferentes: Escherichia coli in vivo, Brevibacilluse livre de células de germe de trigo. (Referência: Hirose S, & amp Noguchi T. 2013. Proteomics. 13:1444-1456).

SABLE - Predição baseada em sequência precisa de acessibilidades relativas a solventes, estruturas secundárias e domínios transmembrana para proteínas de estrutura desconhecida. (Referência: Adamczak R et al. 2004. Proteins 56:753-767).

SPpred (Solúvel Ppredição de proteína) (Centro de Bioinformática, Instituto de Tecnologia Microbiana, Chandigarh, Índia) - é um servidor web para prever a solubilidade de uma proteína na superexpressão em E.coli. A predição é feita por híbrido do modelo SVM treinado no perfil PSSM gerado pela pesquisa PSI-BLAST do banco de dados de proteínas & # 39nr & # 39 e composição de aminoácidos dividida.

Protein & ndashSol - é um servidor da web para prever a solubilidade de proteínas. Usando os dados disponíveis para a solubilidade da proteína Escherichia coli em um sistema de expressão livre de células, 35 propriedades baseadas em sequência são calculadas. Os pesos dos recursos são determinados a partir da separação de subconjuntos de baixa e alta solubilidade. O modelo retorna uma solubilidade prevista e uma indicação dos recursos que mais se desviam dos valores médios. (Referência: Hebditch M et al. 2017. Bioinformática 33(19): 3098 e ndash3100).

CamSol - para o design racional de variantes de proteínas com solubilidade aprimorada. O método funciona realizando uma rápida triagem computacional de dezenas de milhares de mutações para identificar aquelas com maior impacto na solubilidade da proteína alvo, mantendo seu estado nativo e atividade biológica. (Referência: Sormanni P et al. (2015) J Molec Biol 427(2): 478-490). N.B. Requer registro.

Sseu rosto Entropy Redução p rediction (SERp) - esta ferramenta exploratória visa auxiliar a identificação de locais que são mais adequados para mutação projetada para aumentar a cristalização por uma abordagem de Redução de Entropia de Superfície. (Referência: Goldschmidt L. et al. 2007. Protein Science. 16:1569-1576)

CRYSTALP2 - para em sílico previsão da propensão à cristalização de proteínas. (Referência: Kurgan L, et al. 2009. BMC Structural Biology 9: 50) e PPCpred - previsão baseada em sequência da propensão para a produção de cristais de qualidade de difração, produção de cristais, purificação e produção do material proteico. (Referência: M.J. Mizianty & amp L. Kurgan. 2011. Bioinformática 27: i24-i33).

Peptídeos antimicrobianos, vacinas e toxinas:

APD (UMAantimicrobiano Peptide Database) (Referência: Wang, Z. e Wang, G 2004. Nucl. Acids Res.32: D590-D592)

O Sistema de Secreção Tipo III (T3SS) é um mecanismo essencial para a interação patógeno-hospedeiro no processo de infecção. As proteínas secretadas pela máquina T3SS de muitas bactérias Gram-negativas são conhecidas como efetores T3SS (T3SEs). Estes podem estar localizados subcelularmente no hospedeiro ou fazer parte da ponta da agulha do T3SS que interage diretamente com a membrana do hospedeiro para trazer outros efetores para a célula-alvo. T3SEdb representa esse esforço para montar um banco de dados abrangente de todos os T3SEs determinados experimentalmente e putativos em um site acessível pela web. A pesquisa BLAST está disponível. (Referência: Tay DM et al. 2010. BMC Bioinformatics. 11 Suplemento 7: S4).

Eficaz (Universidade de Viena, Áustria e Universidade Técnica de Munique, Alemanha) - A secreção de proteínas bacterianas é o principal mecanismo de virulência de bactérias simbióticas e patogênicas. Assim, as proteínas efetoras são transportadas do citosol bacteriano para o meio extracelular ou diretamente para a célula hospedeira eucariótica. O portal Effective fornece previsões pré-calculadas sobre efetores bacterianos em todos os genomas patogênicos e simbiônicos publicamente disponíveis, bem como a possibilidade para o usuário predizer efetores em dados da própria sequência de proteínas.

Vaxign é o primeiro sistema de design de vacina baseado na web que prevê alvos de vacina com base em sequências de genoma usando a estratégia de vacinologia reversa. As características previstas no pipeline Vaxign incluem localização subcelular de proteína, hélices transmembrana, probabilidade de adesina, conservação de proteínas humanas e / ou de camundongo, exclusão de sequência de genoma (s) de cepa (s) não patogênica (s) e ligação de epítopo a MHC classe I e classe II . O banco de dados Vaxign pré-computado contém previsão de alvos de vacina para genomas & gt350. (Referência: He Y et al. 2010. J Biomed Biotechnol. 2010: 297505). Uma versão mais recente do Vaxign 2 Beta está disponível aqui.

VacTarBac é uma plataforma que armazena vacinas candidatas contra várias bactérias patogênicas. As vacinas são projetadas com base em sua probabilidade de atuar como epítopo, portanto, têm o potencial de induzir qualquer um dos vários braços do sistema imunológico. Esses epítopos foram previstos contra o fator de virulência e genes essenciais de 14 espécies bacterianas. (Referência: Nagpal G et al. (2018) Front Immunol. 9: 2280).

Abpred - pegará uma única sequência de aminoácidos para um Fv e calculará o desempenho previsto em 12 plataformas biofísicas (Referência: Hebditch M & amp J Warwicker (2019) PeerJ. 7: e8199).

T3SE - Predição do efetor do sistema de secreção Tipo III (Referência: L & oumlwer M, & amp Schneider G. 2009. PLoS One. 4:e5917. Errata em: PLoS One. 20094 (7).

SIEVE Server é uma ferramenta pública da web para predição de efetores secretados tipo III. O SIEVE Server classifica potenciais efetores secretados de genomas de patógenos bacterianos com sistemas de secreção do tipo III usando um modelo aprendido de proteínas secretadas conhecidas. O SIEVE Server requer que apenas sequências de proteínas de proteínas sejam rastreadas e retorna uma probabilidade conservadora de que cada proteína de entrada seja um efetor secretado tipo III. (Referência: McDermott JE et al. 2011. Infect Immun. 79:23-32).

Dicroísmo circular:

Dicroísmo circular (Birkbeck College, School of Crystalography, Inglaterra) DICHROWEB é um site interativo que permite a deconvolução de dados de experimentos de espectroscopia de dicroísmo circular. Ele oferece uma interface para uma variedade de algoritmos de deconvolução (CONTINLL, SELCON3, CDSSTR, VARSLC, K2D).

K2D2: Predição de porcentagens de estrutura secundária de proteína a partir de espectros de CD - permite a análise de 41 pontos de dados do espectro de CD variando de 200 nm a 240 nm ou ou 51 pontos de dados para a faixa de 190-240 nm (Referência: Perez-Iratxeta C & amp Andrade- Navarro MA. 2008. BMC Structural Biology 2008, 8:25)

K2D3 é um servidor da web para estimar o conteúdo da hélice e da fita & szlig de uma proteína a partir de seu espectro de dicroísmo circular. K2D3 usa um banco de dados de espectros teóricos derivados com Dichrocalc (Referência: Louis-Jeune C et al. 2012. Proteínas: Estrutura, Função e Bioinformática 80: 374 e ndash381)

Resíduos de cisteína:

DiANNA - irá prever o estado de oxidação da cisteína (precisão de 76%), pares de cisteína (precisão de 81%) e conectividade da ligação dissulfeto (precisão de 86%). (Referência: Nucl. Acids Res. 33: W230-W232).

CYSREDOX (Rockefeller University, EUA) e CYSPRED (Grupo de Biocomputação CIRB, Universidade de Bolonha, Itália) calcular o estado redox dos resíduos de cisteína nas proteínas.

Plotador de hidrofobicidade ( Innovagen ) - e Protein Hydroplotter - sellect em Ferramentas (ProteinLounge, San Diego, CA ).

Proteólise e espectrometria de massa:

Proteólise - PeptideCutter (ExPASy, Suíça) que também prevê locais de clivagem para enzimas e produtos químicos. Um local de proteólise alternativo é Mobility_plot 4.1 (Impressão digital proteolítica avançada, IGH, França).
Para análises de proteínas mais sofisticadas envolvendo espectroscopia de massa, a ExPasy introduziu FindMod para prever potenciais modificações pós-tradução de proteínas em peptídeos e, GlycoMod, que pode prever as possíveis estruturas de oligossacarídeos que ocorrem em proteínas a partir de suas massas experimentalmente determinadas.

ProFound - é uma ferramenta para pesquisar um banco de dados de sequência de proteínas usando informações de espectros de massa de mapas de peptídeos. Um algoritmo Bayesiano é usado para classificar as sequências de proteínas no banco de dados de acordo com sua probabilidade de produzir o mapa de peptídeos. Uma versão simplificada pode ser acessada aqui (Rockefeller University, New York, U.S.A.). Não se pode usar um banco de dados de proteínas próprio.

ProteinProspector (Universidade da Califórnia) - oferece uma ampla variedade de ferramentas (por exemplo, MS-Fit, MS-Tag, MS-Seq, MS-Pattern, MS-Homology) para o espectroscopista de massa de proteína.

Repetições em sequências de proteínas podem ser descobertas usando Radar ( R apid UMA utomático D etecção e UMA alinhamento de R epeats, Instituto Europeu de Bioinformática) ou REPRO (Referência: George RA.& amp Heringa J. 2000. Trends Biochem. Sci. 25: 515-517).

REPPER (REPcome e seu PORiodicidades) - detecta e analisa regiões com repetições curtas sem intervalos em proteínas. Ele encontra periodicidades por transformada de Fourier (FTwin) e análise de similaridade interna (REPwin). O FTwin atribui valores numéricos aos aminoácidos que refletem certas propriedades, por exemplo hidrofobicidade, e fornece informações sobre as periodicidades correspondentes. O REPwin usa autoalinhamentos e exibe repetições que revelam semelhanças internas significativas. Eles são complementados por PSIPRED e previsão de bobina enrolada (COILS), tornando o servidor uma ferramenta analítica útil para proteínas fibrosas. (Referência: M. Gruber et al. 2005. Nucl. Acids Res. 33: W239-W243).

Géis bidimensionais:

Cálculo JVirGel de géis de proteína bidimensionais virtuais - cria proteomas 2D virtuais de uma lista enorme de eucariotos e procariotos amp (ou uma proteína individual). Duas versões: html (limitada) e miniaplicativo Java (incrível, mas você precisa instalar o Java Runtime Environment. (Referência: K. Hiller et al. 2003. Nucl. Acids Res. 31: 3862-3865).

Desenhe géis de proteína bidimensionais virtuais (PRODORIC Net, Alemanha) - usando seus próprios dados de sequência de proteínas ou para diferentes organismos.

Scratch Protein Predictor - (Instituto de Genômica e Bioinformática, Universidade da Califórnia, Irvine) - os programas incluem: ACCpro: a acessibilidade relativa a solventes de resíduos de proteína CMAPpro: Previsão de mapas de contato de aminoácidos COBEpro: Previsão de epítopos de células B contínuos CONpro: prevê se o número de contatos de cada resíduo em uma proteína está acima ou abaixo da média para aquele resíduo DIpro: Predição de pontes dissulfeto DISpro: Predição de regiões desordenadas DOMpro: Predição de domínios SSpro: Predição de estrutura secundária de proteína SVMcon: Predição de mapas de contato de aminoácidos usando Support Vector Machines e, 3Dpro: Predição de estrutura terciária de proteína (Ab Initio).

Mutagênese:

Designer de mutagênese genética (GenScript) foi desenvolvido para tornar seu projeto de mutagênese pontual de DNA simples para facilitar a mutação genética. Para realizar a mutagênese do DNA do tipo selvagem, basta inserir sua sequência inicial do gene do tipo selvagem no campo abaixo e, em seguida, clicar no botão & ldquofrom selection & rdquo para selecionar o (s) aminoácido (s) de interesse. Consequentemente, a nova sequência de gene que codifica a proteína mutada será gerada com um clique & ldquosubmit & rdquo. Você pode selecionar vários sistemas de expressão.

I-Mutant2.0: preditor de mudanças na estabilidade da proteína após a mutação - escolha um número de referência PDB ou cole sua própria proteína. A resposta (por e-mail) indica se a proteína é mais ou menos estável, um fato que pode ser útil para projetar proteínas "melhores". (Referência: E. Capriotti et al. 2005. Nucl. Acids Res. 33: W306-W310).

SIFT - o Sorting eutolerante fROM TO algoritmo olerant (SIFT) prevê o efeito das variantes de codificação na função da proteína, isto é, prevê se uma substituição de aminoácido afeta a função da proteína com base na homologia de sequência e nas propriedades físicas dos aminoácidos. SIFT pode ser aplicado a polimorfismos não sinônimos de ocorrência natural e mutações missense induzidas por laboratório. (Referência: N-L Sim et al. 2012. Pesquisa de ácidos nucléicos 40(1): W452 e ndashW457).

Membrana mCSM - prevê os efeitos de mutações nas proteínas transmembrana. (Referência: Pires DEV et al. 2020. Nucl Acids Res 48 (W1): W147 e ndashW153).


Materiais para sistemas implantáveis

1.7.1 Adaptando as propriedades físicas e químicas das superfícies

A adsorção de proteínas pode, em princípio, ser mitigada ajustando a hidrofobicidade da superfície (Wang et al., 2004), textura (Curtis e Wilkinson, 2001) e funcionalização da superfície (Elbert e Hubbell, 1996) do implante. No entanto, esta não é uma tarefa fácil: mesmo quando quantidades muito diminutas de proteínas adsorvidas estão presentes, o recrutamento de células ainda ocorre (Shen et al., 2002). Existem vários relatórios na literatura atual de experimentos sistemáticos envolvendo uma gama de químicas de superfície, resultando em vários graus de hidrofobicidade para tentar atingir este objetivo (Tang et al., 1998 Anderson et al., 1999). Em geral, isso é conseguido imobilizando vários grupos funcionais por meio de silanização. Embora a adesão celular correlacionada à inflamação aguda tenha sido reduzida com sucesso em alguns casos, há consenso de que a funcionalidade da superfície não tem efeito apreciável nos processos inflamatórios crônicos (ver, por exemplo, Tang et al., 1998, Ratner, 2002, Bridges e Garcia, 2008). Independentemente da composição da superfície, proteínas não específicas e orientadas aleatoriamente se adsorvem à superfície de uma forma que é fundamentalmente diferente de qualquer processo natural, levando, portanto, à hipótese de que a busca deve ser por um controlada processo de adsorção de proteínas e não para sua evitação (Ratner, 2002).


Introdução

Apesar do crescente uso comercial e industrial de nanopartículas (NPs) em áreas como protetores solares, cosméticos, catalisadores, pigmentos e antimicrobianos, pouco se sabe sobre seu impacto ambiental [1]. As estimativas preveem um aumento no consumo global de nanomateriais de aproximadamente 308.322 toneladas métricas em 2016 para 733.220 toneladas métricas em 2021 [2]. No final de sua vida, os NPs são liberados e encontram ambientes dinâmicos e complexos que transformam sua superfície. Atualmente não há informações suficientes para estabelecer relações preditivas de estrutura-atividade para avaliação de risco, principalmente devido à falta de caracterização físico-química dos nanomateriais em condições relevantes [3]. Os coeficientes de distribuição são amplamente usados ​​para modelar o destino ambiental e a biodisponibilidade de produtos químicos, mas descritores paralelos para nanomateriais não foram amplamente implementados [4]

Um dos descritores mais poderosos e úteis de produtos químicos é a hidrofobicidade relativa. A hidrofobicidade é um parâmetro importante na avaliação de risco que pode ser usado para prever o movimento através do solo, transporte em ambientes aquosos, biodisponibilidade para organismos e partição em sistemas fisiológicos [5]. A hidrofobicidade também é considerada um parâmetro chave para a previsão do comportamento ambiental e das interações biológicas dos nanomateriais [6,7]. Tal como acontece com os produtos químicos, os NPs hidrofílicos têm maior probabilidade de permanecer na coluna de água e, potencialmente, ter maior mobilidade, enquanto as partículas hidrofóbicas têm maior probabilidade de se anexar à matéria orgânica dos sedimentos. Quando NPs entram no ambiente, eles encontram constituintes ambientais, como matéria orgânica natural (NOM), íons e polissacarídeos, que se adsorvem à superfície NP e formam uma coroa dinâmica, alterando as propriedades da superfície NP e influenciando o destino, as transformações e a absorção [8 ] A hidrofobicidade de superfície de NPs provavelmente influencia a composição da coroa e afinidade para as superfícies ambientais circundantes [9,10].

Este conceito é posteriormente aplicado para descrever a interação de NPs com organismos. NPs hidrofóbicos mostraram interagir com a bicamada lipídica dos organismos, e as evidências sugerem aumento da captação em relação aos NPs hidrofílicos [11]. Após a absorção, foi demonstrado que a hidrofobicidade da superfície do NP afeta diretamente a toxicidade, o tempo de circulação e a bioacumulação [12,13]. Além disso, a hidrofobicidade dita a interação da superfície do NP com componentes biológicos, como proteínas e biomoléculas que se adsorvem à superfície, alterando ainda mais a interação biológica [14].

Considerações específicas de nanopartículas aumentam a complexidade da medição e interpretação das métricas de hidrofobicidade. NPs podem ser compostos de vários tamanhos e funcionalização de superfície, os quais afetam o comportamento de particionamento e as interações. Hou et al. descobriram que o tamanho dos NPs do Au afetou a rapidez com que os NPs se distribuíram para uma membrana lipídica com suporte sólido, enquanto a funcionalidade da superfície e a química da solução determinaram as concentrações "aparentes" em estado estacionário [15]. A aglomeração também pode afetar o destino e complicar as medições, causando o assentamento de NPs ao longo do tempo e impedindo o verdadeiro comportamento de particionamento [16]. NPs são frequentemente funcionalizados com vários revestimentos de superfície que também podem alterar a hidrofobicidade da superfície. Estudos anteriores descobriram que mudanças na hidrofobicidade da superfície da partícula podem alterar as interações celulares e consequente captação [17]. Outro estudo descobriu que a fixação de Ag NPs a superfícies de coletores hidrofóbicos era diretamente proporcional à hidrofobicidade dos revestimentos (citrato, PVP e GA) [18]. Portanto, uma medida útil de hidrofobicidade é necessária que represente com precisão o comportamento NP complexo e dinâmico.

Os métodos convencionais para quantificar a hidrofobicidade de produtos químicos e superfícies sólidas dependem de partição ou outras medições dependentes de equilíbrio. No entanto, NPs não atingem o equilíbrio termodinâmico, então parâmetros controlados cineticamente são mais relevantes e apropriados [19]. Uma abordagem é obter valores para a eficiência de fixação (α) de NPs que podem ser aplicados diretamente para modelar a deposição de NPs em uma superfície de coletor usando a equação de Smoluchowski. Este método está bem estabelecido para modelar a coagulação de partículas e foi mostrado para quantificar com sucesso a fixação de certos NPs a superfícies em ambientes complexos [20-24]. No entanto, α deve ser determinado experimentalmente para cada par de superfícies e depende das propriedades do meio, como força iônica, pH e concentração de matéria orgânica. Há uma necessidade de quantificar a hidrofobicidade de superfície inerente de NPs para prever o apego a superfícies usando modelos de destino computacionais de uma maneira paralela à previsão da partição de produtos químicos em compartimentos ambientais. Para resolver isso, Valsesia et al. desenvolveu um método para quantificar a eficiência de fixação para NPs e superfícies de coletor projetadas padrão [25]. Este método é promissor, mas até agora foi aplicado apenas a NPs esféricos idealizados em condições controladas.

Os métodos existentes para caracterizar a hidrofobicidade de substâncias foram aplicados a NPs e encontraram vários graus de sucesso. Exemplos desses métodos incluem ângulo de contato, que é tipicamente usado para avaliar a hidrofobicidade de superfícies sólidas, partição octanol-água, que é comumente usada para produtos químicos, e cromatografia de interação hidrofóbica, que fornece uma medida relativa da hidrofobicidade das proteínas. Em alguns casos, esses métodos foram modificados para o comportamento específico do NP.

O ângulo de contato mede a molhabilidade de uma superfície sólida por uma sonda líquida, normalmente usando a técnica da gota séssil e medindo o ângulo na interface sólido-líquido-vapor. Para aplicar esta técnica aos nanomateriais, uma suspensão NP é primeiro filtrada e prensada em um disco plano antes de aplicar o líquido da sonda. Este método foi realizado através de uma série de NPs de óxidos de terras raras e todos foram considerados hidrofóbicos, com ângulos de contato de água entre 100 ° e 115 ° [26]. Um método semelhante foi aplicado a fulerenos, fuleróis e NPs de Ag revestidos na interface líquido, líquido e sólido e todos foram considerados hidrofílicos, o que era inconsistente com outras medições [27]. Arnaudov et al. usou uma técnica de captura de gel para eliminar a necessidade de pressionar NPs em um disco plano, mas este método requer técnicas avançadas, como microscopia de força atômica, e não considera efeitos de aglomeração ou funcionalização [28]. A principal limitação do uso do ângulo de contato para hidrofobicidade é que ele não permite o uso experimental no local medições [26,27,29]. Além disso, não leva em consideração o tamanho, a forma, a rugosidade da superfície ou a heterogeneidade do NP [30].

Se as suspensões de NP forem modeladas como soluções homogêneas, o comportamento de partição entre duas fases líquidas imiscíveis (octanol e água) pode ser usado para avaliar a hidrofobicidade. O coeficiente de partição octanol-água (KOW) é comumente usado para produtos químicos e é um descritor poderoso para modelar o destino ambiental e a biodisponibilidade para avaliação de risco [31]. O octanol é usado como substituto de material orgânico rico, como o sedimento ou a membrana lipídica. Esta medição, quando aplicada a produtos químicos dissolvidos, assume que os solutos se movem livremente entre duas fases e as concentrações de equilíbrio representam a “afinidade” para cada fase.

As suspensões NP violam os pressupostos básicos de solubilidade e equilíbrio associados com KOW, mas muitos estudos ainda aplicam esta medida para avaliar a hidrofobicidade dos NPs [19]. O método tem sido mais comumente aplicado a fulerenos e, embora sejam geralmente caracterizados como muito hidrofóbicos, os valores exatos não são consistentes entre os estudos e abrangem ordens de magnitude [27,32]. Quando aplicado a nanotubos de carbono, mediu KOW os valores não foram considerados preditivos de bioacumulação em minhocas ou oligoquetas. O KOW de nanomateriais foi relatado ser inconsistente com compostos orgânicos de uma estrutura química semelhante, com agregação, tamanho e revestimentos de superfície sendo citados como possíveis explicações [33].

Alguns estudos tentaram obter um KOW valor para NPs enquanto reconhece as deficiências ou faz esforços para adaptar os resultados para sistemas baseados em partículas. Ao aplicar o método do frasco agitado para medir KOW, alguns nanomateriais foram observados para partição na interface entre as fases aquosa e octanol. Um coeficiente de distribuição de dois parâmetros foi proposto para analisar medidas neste cenário, onde a razão de massa de NPs no aquoso, orgânico e interface são todos levados em consideração [34]. As medições resultantes são dependentes do sistema e uma função da área da interface, contagem de partículas e tempo. Outra adaptação proposta é avaliar o KOW dos grupos funcionais de superfície por si só, e assumir que o núcleo tem um efeito insignificante na hidrofobicidade da superfície [7]. Isso é provavelmente mais adequado para NPs com pequenos núcleos e revestimentos orgânicos grandes e ramificados. KOW medições desta natureza podem ser úteis para comparar dentro de uma classe de nanomateriais, mas não foram amplamente implementadas até o momento.

Um método alternativo para avaliar a hidrofobicidade de NPs é a cromatografia de interação hidrofóbica (HIC). HIC é normalmente usado para separar proteínas com base em sua hidrofobicidade relativa [35]. As proteínas são eluídas através de uma coluna por uma diminuição gradual na concentração de sal, onde as proteínas mais hidrofóbicas são eluídas na concentração de sal mais baixa. A matriz estacionária da coluna é tipicamente composta por grânulos de agarose funcionalizados com cadeias alquil de vários comprimentos. Embora este método seja potencialmente adequado para aplicação com NPs devido à faixa de tamanho semelhante de proteínas, ele só foi aplicado para medir a hidrofobicidade de NPs em um número limitado de estudos. Poliestireno NPs foram avaliados em uma concentração de sal constante e o volume de eluição necessário para remover completamente as partículas de uma coluna de alquil-agarose foi usado como uma medida de hidrofobicidade [36]. Outra adaptação foi usar várias colunas com comprimentos de cadeia de alquil variáveis ​​para comparar a hidrofobicidade de vários NPs poliméricos [37]. O HIC pode ser potencialmente usado para partículas com uma ampla faixa de hidrofobicidade porque a fase estacionária pode ser selecionada pelo usuário.

A adsorção de corantes hidrofóbicos à superfície da partícula é outro método potencialmente adequado para NPs. Este método foi aplicado a NPs de poliestireno marcados com fluorescência, partículas de látex com vários grupos funcionais e NPs de lipídios sólidos usando Rose Bengal, um corante orgânico, como uma sonda hidrofóbica [17,38,39]. Algumas dificuldades identificadas com este método foram a interferência de surfactantes, tempo intensivo para encontrar concentrações de NPs adequadas e dificuldade em separar NPs da suspensão para análise de absorbância. Rose Bengal fornece medições robustas para NPs hidrofóbicos, mas fornece informações limitadas sobre superfícies hidrofílicas. O uso de um corante hidrofílico, Nile Blue, foi demonstrado como um meio de fornecer resolução para medições de partículas hidrofílicas [27]. O uso de corantes hidrofóbicos e hidrofílicos é promissor para fornecer medições com boa resolução para comparar NPs com uma ampla gama de composições.

Neste estudo, avaliamos o HIC e a adsorção de corante (Rosa de Bengala e Azul do Nilo) para avaliar a hidrofobicidade dos NPs e compará-los ao K tradicionalOW métodos. Os resultados foram avaliados com base na capacidade de cada método para superar os principais desafios associados às NPs: aglomeração, funcionalização de superfície e transformações ambientais. NPs de ouro não revestido (Au) foram selecionados por seu pequeno tamanho e capacidade de serem facilmente quantificados por espectroscopia de absorção. NPs de óxido de cobre não revestido (CuO) foram usados ​​por sua conhecida propensão para aglomerar em solução. Sílica (SiO2) NPs com e sem funcionalização de superfície de amina foram escolhidos para observar mudanças na hidrofobicidade devido aos revestimentos de superfície. Pesquisamos, modificamos e avaliamos os métodos com base na potencial aplicabilidade generalizada a NPs, com o objetivo final de obter no local medições para futuros modelos de destino ambiental.


Resumo

Nanopartículas de proteínas são biomateriais compostos inteiramente por proteínas, com a sequência e estrutura da proteína determinando as propriedades físico-químicas das nanopartículas. Após a exposição a fluidos fisiológicos ou ambientais, é provável que nanopartículas de proteínas, como nanopartículas sintéticas, irão adsorver proteínas e esta coroa de proteína será dependente das propriedades de superfície das nanopartículas de proteína. Como há pouca compreensão desse fenômeno para nanopartículas de proteínas projetadas, o objetivo deste trabalho foi criar nanopartículas de proteínas com hidrofobia de superfície e carga superficial variáveis ​​e estabelecer o efeito dessas propriedades na massa e composição da corona adsorvida, usando o feto soro bovino como solução fisiológica modelo. Albumina, albumina catiônica e nanopartículas reticuladas de ovalbumina foram desenvolvidas para esta investigação e suas coronas de proteína adsorvida foram isoladas e caracterizadas por eletroforese em gel e cromatografia nanolíquida por espectrometria de massa.Tendências distintas na massa e composição da corona foram identificadas para nanopartículas de proteína com base na carga superficial e na hidrofobicidade superficial. Análises proteômicas revelaram padrões únicos de proteína corona e identificaram proteínas distintas que são conhecidas por afetar a depuração de nanopartículas na Vivo. Além disso, a proteína corona influenciou a internalização de nanopartículas em vitro em uma linha de células de macrófagos. Juntos, esses resultados demonstram o forte efeito que a identidade e as propriedades da proteína têm na coroa formada nas nanopartículas feitas a partir dessa proteína. Este trabalho constrói a base para estudos futuros de proteínas coronas na ampla gama de nanopartículas de proteínas usadas em nanomedicina e aplicações ambientais.


Relação entre Estrutura Secundária e Hidrofobicidade de Superfície do Isolado de Proteína de Soja Submetido a Tratamento Térmico

90 ° C. A desnaturação por calor aumentou a hidrofobicidade da superfície e a hidrofobicidade da superfície diminuiu conforme o agregado se formou. O calor causou um aumento na quantidade relativa de α- estruturas helicoidais e uma diminuição geral na quantidade de β- estruturas de folha quando comparadas com SPI não tratado. As quantidades relativas de estruturas secundárias variaram com o tempo, temperatura e intensidade do tratamento térmico aplicado. o βA estrutura da folha foi mais importante pelo seu papel significativo na desnaturação da globulina 7S e agregados formados a seguir e mesmo na desnaturação da globulina 11S. A quantidade de βA estrutura da folha em SPI teve uma correlação inversa com a hidrofobicidade da superfície quando a temperatura foi mantida abaixo de 90 ° C. Além do mais, β- estrutura de giro aumentou conforme βAgregado -7S / B-11S formatado. & # 13 e # 13

1. Introdução

Definir e medir a funcionalidade da proteína começa no nível da estrutura da proteína. As relações biológicas estruturais-funcionais são freqüentemente reveladas para ajustar as aplicações de proteínas que geralmente estão associadas a transições estruturais [1]. O tratamento térmico é um método comumente usado para melhorar a funcionalidade das proteínas de soja, como solubilidade, absorção de água, gelificação, emulsificação ou formação de espuma [2-6]. Pesquisas anteriores mostraram que essas propriedades funcionais dependem da composição, estrutura, grau de dissociação, desnaturação e agregação das globulinas 7S e 11S [7-9].

O aumento da temperatura faz com que as proteínas se desdobrem, expondo os grupos sulfidrila e hidrofóbico. Por exemplo, a glicinina tem alterações na estrutura secundária e a hidrofobicidade da superfície aumenta com o aquecimento [8, 9]. SPI de aquecimento, que consiste em glicinina e β-conglicinina, induz o desenvolvimento de interações específicas entre as subunidades [10] e a formação de complexos solúveis entre as β-subunidade de β-conglicinina e a subunidade básica da glicinina [11]. Em contraste, o aquecimento apenas da glicinina causa agregação de suas subunidades básicas. O aquecimento de dispersões de proteínas de soja em temperaturas acima de 70 ° C causa o desdobramento da estrutura globular, levando à desnaturação da proteína e à formação de novas ligações intra e intermoleculares, como ligações de hidrogênio e interações eletrostáticas e hidrofóbicas [11].

A hidrofobicidade da superfície é um dos fatores relacionados à estrutura mais importantes que influenciam as propriedades funcionais das proteínas. A hidrofobicidade da superfície está significativamente correlacionada com a gelificação, emulsão e formação de espuma de proteínas, que são propriedades críticas em sua aplicação como ingredientes alimentícios [2, 12]. Em diferentes amostras de proteínas, foi detectada uma relação positiva entre a constante de taxa de floculação-creme e a fração de equilíbrio do volume de óleo das emulsões com hidrofobicidade superficial [13]. Hettiarachchy et al. [14] relataram que os adesivos de proteína de soja modificados por álcali com alta hidrofobicidades aumentaram as propriedades de resistência à água. Jiang et al. [15] relataram propriedades de resistência à água em filmes de proteínas de soja que apresentaram uma relação próxima com a hidrofobicidade de superfície.

Wang et al. [16] apontaram que o aumento da hidrofobicidade da superfície devido ao desdobramento de uma proteína aquecida, acompanhada pela formação de agregados ligados por ligações dissulfeto, pode levar a uma pressão superficial mais baixa na adsorção de longo prazo e reologia interfacial dinâmica semelhante. Explorar a hidrofobicidade da superfície pode ser uma etapa importante no ajuste das funções e propriedades de uma proteína no nível molecular.

A hidrofobicidade de superfície é uma função relacionada à estrutura, dependente do tamanho e forma da molécula de proteína, composição e sequência de aminoácidos e quaisquer ligações cruzadas intramoleculares ou intermoleculares [17-19]. Embora pesquisas anteriores sobre propriedades / funções interfaciais, como formação de espuma e emulsificação, tenham fornecido algumas informações sobre a hidrofobicidade da superfície a partir de uma perspectiva estrutural [14-18], a relação entre as conformações espaciais e a hidrofobicidade da superfície ainda precisa ser claramente definida.

A desnaturação de proteínas é conhecida por expor grupos hidrofóbicos e, portanto, causar um aumento na hidrofobicidade da superfície. Além disso, a variação na hidrofobicidade da superfície indica mudanças nas interações hidrofóbicas que afetam a formação de agregados e a desnaturação de proteínas [20]. Assim, o estudo sobre tratamentos térmicos explicou que é necessário usar o conceito de hidrofobicidade de superfície.

O objetivo deste estudo foi analisar as mudanças estruturais do SPI após o aquecimento e o efeito na hidrofobicidade da superfície para avaliar a relação entre as mudanças na estrutura secundária e a hidrofobicidade da superfície do SPI, o que é útil para dar uma nova perspectiva à elucidação da funcionalidade da proteína de soja.

2. Materiais e métodos

2.1. Preparação de SPI

O SPI foi preparado suspendendo flocos de soja desengordurada (doados pelo Laboratório Principal de Biologia da Soja do Ministério da Educação, Centro de Pesquisa de Soja da Universidade de Agricultura do Nordeste, China) em 15 vezes de água e ajustado para um pH de 7 com NaOH 2 mol / L. Após agitação durante 1 h, a suspensão foi centrifugada a 8.000 g durante 30 min. O sobrenadante foi ainda sujeito a precipitação isoelétrica ajustando o pH a 4,5 com 2 mol / L de HCl. O precipitado de proteína foi obtido por centrifugação (5.000 g, 30 min), ressuspenso em água e ajustado a um pH de 7 com NaOH 2 mol / L. Após a remoção de uma pequena quantidade de substâncias insolúveis por centrifugação a 10.000 g por 30 min, a solução de proteína foi seca por congelamento e moída para produzir o pó de SPI. Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente. O conteúdo de proteína do SPI foi determinado pelo método Kjeldahl como

) Todos os outros produtos químicos usados ​​neste estudo eram de grau reagente, a menos que especificado de outra forma.

2.2. Tratamento Térmico de SPI

Três gramas de SPI foram primeiro dispersos em 50 mL de tampão padrão, nomeadamente, tampão de fosfato 0,1 M (pH 7,0), seguido de mistura com tampão padrão, para dar dispersões com as concentrações desejadas. A concentração de proteína nas soluções foi determinada pelo ensaio de Lowry Lowry et al. [21], com BSA como a proteína padrão. A dispersão aquosa foi então agitada em um tubo de vidro (selado) e aquecida a temperaturas de 70 a 90 ° C por 15, 30, 45, 60 ou 90 min, respectivamente, em um banho de temperatura controlada com desvios de temperatura inferiores a 1 ° C. Após o tratamento térmico, as amostras foram centrifugadas a 10.000 g por 30 min para remoção do SPI insolúvel, em seguida resfriadas imediatamente em banho de gelo e submetidas diretamente a novos experimentos.

2.3. Calorimetria de varredura diferencial (DSC)

Os termogramas DSC foram registrados em um DSC modulado 2920 (TA Inc., New Castle, DE, EUA) com uma taxa de aquecimento de 5 ° C / min e faixas de temperatura de 25-120 ° C. O instrumento foi calibrado para temperatura e entalpia usando índio. As amostras de SPI aquecidas foram primeiro liofilizadas, em seguida, preenchidas em uma panela de alumínio hermética com 15 mg de dispersões de proteína de soja a 10% (p / p) em água destilada e seladas. Uma panela vazia foi usada como referência. A entalpia de desnaturação (ΔH) e a temperatura de desnaturação (

) foram calculados usando o software DSC após definir manualmente os pontos inicial e final do pico endotérmico.

2.4. Hidrofobicidade de superfície

A hidrofobicidade de superfície foi determinada usando 1-anilino-8-naftaleno-sulfonato (ANS) como uma sonda de fluorescência [22]. A proteína foi suspensa em tampão fosfato (0,1 M, pH 7) na concentração de 4 mg / mL à temperatura ambiente, com agitação ocasional por 30 min. A suspensão foi centrifugada a 10.000 g durante 30 min. Diluições em série do sobrenadante foram feitas com o mesmo tampão em uma faixa de concentração de 0,0025–4 mg / mL. A concentração de proteína foi determinada por um método descrito por Lowry et al. [21]. Para 2 mL de solução de proteína, 40 µL de solução ANS (8 mmol / L em 0,1 mol / L, pH 7,0, tampão de fosfato) foi adicionado. A intensidade da fluorescência (FI) foi medida a 365 nm (excitação) e 484 nm (emissão) em um espectrofotômetro de fluorescência Cary Eclipse (Varian Inc., Palo Alto, CA, EUA). Um gráfico da inclinação inicial de FI em comparação com o gráfico de concentração de proteína foi tomado como um índice de hidrofobicidade de superfície.

2,5. Microspectroscopia FT-IR

Os espectros de absorção FT-IR de 4.000 a 400 cm −1 foram adquiridos no modo de transmissão por um espectrômetro Nicolet Magna IR 550 FT-IR (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EUA) purgado continuamente com ar seco e equipado com líquido detector MCT de resfriamento de nitrogênio. As amostras de SPI aquecidas foram primeiro liofilizadas e depois produzidas por prensagem em janelas de KBr (1,5 mg de proteína a 200 mg de KBr) em uma prensa Carver a 5-6 T de pressão. Cada espectro foi obtido pela associação de 256 interferogramas com uma resolução de espectro de 2,0 cm −1. A decomposição da banda da amida I foi realizada na região de 1700–1600 cm −1. Uma segunda análise derivada (procedimento de “ajuste de pico”) do IR-SD, que foi mostrado anteriormente para fornecer informações quantitativas confiáveis, foi usada para obter uma análise quantitativa dos componentes estruturais secundários do SPI. O procedimento de “ajuste de pico” foi aplicado à correção linear da linha de base, à autodeconvolução de Fourier e ao espectro deconvoluído (diferença) para resolver e quantificar suas bandas de componentes individuais de acordo com um ajuste de curva gaussiana (GCF). O procedimento manteve as posições iniciais da banda em um intervalo de

cm −1, excluiu bandas com alturas negativas e manteve a largura de banda dentro dos limites esperados de acordo com os limites teóricos ou previsões. As quantidades relativas das diferentes estruturas secundárias de SPI foram determinadas a partir da segunda derivada da amida I, computando manualmente as áreas sob as bandas atribuídas a uma subestrutura particular. A diferença do espectro medido e do ajuste da curva foi calculada como um controle interno do sucesso do processo de ajuste da curva.

2.6. Análise Estatística

Cada tratamento foi realizado em pelo menos triplicado. Os resultados foram submetidos a uma análise de variância unilateral de acordo com o procedimento do modelo linear geral com efeitos de média dos mínimos quadrados. Vários testes de alcance foram aplicados para determinar quais médias eram significativamente diferentes (

) de acordo com as diferenças mínimas significativas de Fisher (LSD). A análise estatística foi realizada com o software SYSTAT (SYSTAT, Inc., Evanston, IL, EUA).

3 Resultados e discussão

3.1. Características térmicas de SPI determinadas por DSC

DSC pode revelar mudanças estruturais e conformacionais de proteínas. Além disso, as temperaturas de desnaturação (pico da curva de desnaturação) e ΔH (entalpia de desnaturação) podem ser determinadas a partir dos termogramas. As temperaturas de desnaturação indicam termoestabilidade da proteína, enquanto ΔH é uma indicação de interações hidrofóbicas / hidrofílicas e compactação da proteína [23, 24]. A desnaturação das duas principais proteínas globulares no SPI, β-conglicinina e glicinina foram associadas a dois picos de transição térmica distintos, variando de 68 a 75 ° C e 85 a 93 ° C, respectivamente. Neste estudo, a temperatura de desnaturação do SPI não aquecido, medida por DSC, para 7S e 11S foi consistente com trabalhos publicados anteriormente [24, 25]. O primeiro pico foi observado a 74,2 ° C e o segundo a 93,7 ° C, atribuível a β-conglicinina e desnaturação da glicinina, respectivamente. A entalpia de desnaturação parece variar notavelmente de laboratório para laboratório. Hua et al. [2] relataram que a entalpia de desnaturação de β-conglicinina e glicinina eram 1,4 J / ge 5,3 J / g, respectivamente, enquanto Tang et al. [26] relatou um valor de 7,2 J / g para a glicinina.

Neste estudo, a variação na concentração de proteína trouxe apenas uma ligeira alteração no pico endotérmico e ΔH em todas as temperaturas aquecidas e tempo detectado (parcialmente listado na Tabela 1). Neste estudo, após um tratamento térmico de 70 ° C, não houve mudanças marcantes no pico endotérmico e no ΔH. Conforme mostrado na Tabela 1, após o tratamento térmico a 80 ° C por 15 min, o pico endotérmico de β-conglicinina desapareceu, indicando desnaturação completa do βcomponente -conglicinina. O ΔH do componente glicinina diminuiu ligeiramente em

12% após este tratamento térmico, e o foi aumentado de 93,7 para 95,3–95,6 ° C. Tomados em conjunto, esses resultados sugerem que embora esse tratamento tenha ocorrido a uma temperatura muito inferior à da glicinina (93,7 ° C), sua conformação protéica foi parcialmente afetada sob tratamento térmico a 80 ° C, núcleos hidrofóbicos inicialmente enterrados no interior exposto [25 ], e então os componentes de glicinina parcialmente dissociados são redobrados para formar agregados mais estáveis ​​com um maior [26]. Assim, pode-se inferir que existem dois tipos de agregados no SPI pré-aquecido (80 ° C por 15 min), principalmente formados a partir de totalmente desnaturados. β-conglicinina (insolúvel) e alguns formados a partir de glicinina parcialmente desnaturada (solúvel) [26]. Em contraste, tanto a glicinina quanto β-conglicinina foi completamente desnaturada após um tratamento térmico a uma temperatura de 90 ° C, que é mais próxima da glicinina. Neste caso, os agregados pareciam ser compostos simultaneamente de glicinina completamente desnaturada e β-conglicinina.

3.2. Hidrofobicidade de superfície

A hidrofobicidade da superfície é uma das propriedades mais importantes relacionadas à superfície das proteínas. Esta propriedade permite a detecção de alterações na distribuição de grupos hidrofóbicos na superfície, que são causadas por alterações na estrutura molecular do SPI após a desnaturação. A desnaturação do SPI é conhecida por expor os grupos hidrofóbicos, aumentando a hidrofobicidade da superfície. Os outros fatores que podem causar um aumento na hidrofobicidade da superfície incluem a dissociação de subunidades de proteínas ou a expansão de cadeias de peptídeos [27]. No entanto, a formação de agregados insolúveis ou solúveis pode causar uma diminuição na hidrofobicidade da superfície.

& # 13 Petruccelli e Añón [28] relataram que as condições de tratamento, incluindo temperatura, tempo e concentração de proteína, influenciaram a hidrofobicidade da superfície da proteína. Em nosso estudo, conforme mostrado na Figura 1, o tratamento térmico exibiu uma influência notável na hidrofobicidade superficial do SPI. O tratamento térmico a 80 ° C ou 90 ° C com uma concentração de proteína de 2% por períodos menores que 45 min aumentou a hidrofobicidade da superfície do SPI. O aumento da hidrofobicidade da superfície principalmente relacionado à desnaturação de β-conglicinina. Em contraste, períodos mais longos de tratamento causaram a diminuição da hidrofobicidade da superfície. Além disso, a hidrofobicidade da superfície do SPI aquecido a 70 ° C foi maior do que a 80 ° C ou a 90 ° C para o mesmo tempo de tratamento. O aquecimento a 70 ° C geralmente afetou a estrutura da glicinina e β-conglicinina e convolve a ruptura parcial da estrutura secundária e terciária do SPI, desenrolamento de cadeias polipeptídicas e exposição de grupos sulfidrila e locais hidrofóbicos, mas nenhuma certa quantidade de agregado formado, o que leva a uma maior hidrofobicidade de superfície. A hidrofobicidade máxima da superfície ocorreu na temperatura de tratamento de 70 ° C por 60 min.


(uma)
(b)
(uma)
(b) A influência do tratamento térmico na hidrofobicidade superficial do SPI. Concentração de proteína em (a) 2% (p / v) e (b) 5% (p / v).

A hidrofobicidade da superfície do SPI aquecido a 80 ° C ou 90 ° C com 5% de concentração de proteína aumentou linearmente até um tempo de tratamento de 30 min. Após esse período, a hidrofobicidade da superfície do SPI aquecido a 90 ° C atingiu um patamar que não se alterou por longos períodos de tratamento, e esse fenômeno pode ser explicado da seguinte forma: (1) subunidades desdobradas e desassociadas por calor que compõem a molécula de proteína causam exposição de domínios hidrofóbicos anteriormente enterrados no interior das subunidades. Essa exposição de locais hidrofóbicos à superfície da proteína aumentou a hidrofobicidade da superfície. (2) Como algumas subunidades ácidas da globulina 11S ligada à sua contraparte do polipeptídeo B apenas por meio de interações não covalentes, que poderiam quebrar devido ao tratamento térmico para formar um agregado solúvel [29]. Enquanto isso, os peptídeos da subunidade básica coagulam por meio de interações hidrofóbicas para formar agregados insolúveis. A formação de agregados formados por polipeptídeo ácido e polipeptídeo básico da globulina 11S inibiu a elevação da hidrofobicidade superficial. (3) Agregados insolúveis formados pelo polipeptídeo básico da globulina 11S e o β-subunidades da globulina 7S inibem a elevação da hidrofobicidade de superfície [30] Petruccelli e Añón [28] apontaram que aqueles βOs agregados -7S / B-11S foram inicialmente estabilizados por interações hidrofóbicas e posteriormente por ligações SS. Além disso, tempos de aquecimento mais longos promoveram a dissociação de agregação de agregados AB-11S para formar βAgregados insolúveis -7S / B-11S podem inibir a elevação da hidrofobicidade da superfície [28].

Além disso, a interação hidrofóbica do SPI aquecido a 80 ° C também não mudou para tempos de aquecimento mais longos, o que pode ser atribuído principalmente à formação de α e αAgregados ′ -7S, como aquecimento SPI a 80 ° C globulina 7S totalmente desnaturada e globulina 11S parcialmente desnaturada. Sorgentini et al. [29] relataram que a hidrofobicidade superficial do SPI aumentou nas frações solúveis, enquanto as interações hidrofóbicas não desempenharam um papel importante na agregação de proteínas presentes nas frações insolúveis.

O aquecimento pode causar associação / dissociação de subunidades e ruptura da estrutura quaternária, resultando em agregação, portanto, a diminuição da hidrofobicidade de superfície de SPI com concentração de proteína de 2% após tratamentos térmicos mais longos está provavelmente relacionada à formação de agregados solúveis e insolúveis de subunidades [6 , 31]. Resultados semelhantes foram relatados anteriormente, em que o polipeptídeo básico de 11S interagiu preferencialmente com o β subunidades de 7S, resultando na precipitação de agregados [30, 31]. Também o α e α′ Subunidades e os polipeptídeos ácidos interagiram através de ligações dissulfeto para formar agregados solúveis. Em nosso estudo, a hidrofobicidade de superfície elevada promove interações hidrofóbicas no estágio inicial de tratamento térmico, enquanto interações hidrofóbicas, ligações de hidrogênio e ligações dissulfeto desempenham papéis importantes na formação de agregados. O SPI com uma concentração de proteína superior (5%) exibiu uma hidrofobicidade de superfície relativamente mais estável do que aquela com uma concentração de proteína de 2% após períodos mais longos de tratamento térmico. Li et al. [6] relataram que suas amostras tratadas termicamente eram compostas de três frações principais: agregados, frações intermediárias e moléculas não agregadas. A proporção relativa da fração agregada aumentou com o aumento da concentração de proteína. Neste estudo, uma proporção relativa maior da fração agregada e o equilíbrio das três frações principais a uma concentração de proteína de 5% podem ter contribuído para nossos achados.

O aumento da hidrofobicidade da superfície a 80 ° C por 15 minutos foi relacionado com a desnaturação da globulina 7S. Curiosamente, a desnaturação da globulina 11S a 90 ° C por 45 min causou um aumento na hidrofobicidade de superfície do SPI com uma concentração de proteína de 2%, mas não foi observada uma mudança com uma concentração de proteína de 5%. Além disso, o aumento acentuado na hidrofobicidade de superfície após o tratamento de 90 ° C por 30 min foi relacionado à desnaturação da globulina 7S. A interação entre o polipeptídeo básico da globulina 11S e o β-subunidades da globulina 7S inibe a elevação da hidrofobicidade de superfície [28].

3.3. Atribuições dos componentes da banda Amide I a elementos distintos da estrutura secundária

A Figura 2 mostra os espectros FT-IR de SPI com diferentes tempos de tratamento térmico, enquanto a banda da amida I foi marcada na Figura 2. O modo da amida I se origina principalmente da vibração de alongamento C = O da estrutura polipeptídica [32]. Os principais fatores responsáveis ​​pela especificidade conformacional da banda da amida I são sua sensibilidade à ligação de hidrogênio e o acoplamento característico entre dipolos de transição, o último levando a efeitos de divisão característicos. A magnitude desta divisão depende da orientação e distância dos dipolos interagindo e, portanto, fornece informações sobre os arranjos geométricos de grupos de peptídeos em uma cadeia polipeptídica [33].


(uma)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(uma)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f) Espectros FT-IR de SPI com diferentes tempos de tratamento térmico: (a) 70 ° C, 2% (b) 70 ° C, 5% (c) 80 ° C, 2% (d) 80 ° C, 5% ( e) 90 ° C, 2% (f) 90 ° C, 5%.

A análise quantitativa dos componentes estruturais secundários das proteínas pode ser obtida por vários métodos experimentais. A análise da segunda derivada do IR-SD foi mostrada anteriormente para fornecer informações quantitativas confiáveis ​​[34]. As áreas das bandas amida I atribuídas nos espectros da segunda derivada correspondem linearmente à quantidade dos diferentes tipos de estruturas secundárias presentes na proteína. Neste estudo, antes da análise da segunda derivada, um ajuste de linha de base foi realizado para medir com precisão as áreas da banda dos espectros da segunda derivada na amida I e um estudo mais aprofundado da autodeconvolução de Fourier (FSD), que pode influenciar substancialmente o número, a posição e intensidade das bandas resolvidas por um ajuste de curva gaussiana (GCF) [35, 36]. O GCF foi ajustado para dar o melhor ajuste de mínimos quadrados das bandas individuais para cada espectro deconvoluído, seguido por uma análise de segunda derivada [36]. Nesta análise, combinamos FSD, segunda derivada e GCF para analisar quantitativamente a segunda derivada dos espectros (Figura 3). Nossas posições de banda de segunda derivada seguidas com dados anteriores da literatura [37] que relataram uma banda forte para α-hélice com uma frequência em torno de 1650–1660 cm −1. Também obtivemos várias bandas correspondentes a β- folha na região de frequência de 1618–1640 cm −1 e 1670–1690 cm −1 [38]. Uma série de bandas correspondendo a β-virar apareceu na faixa de 1660-1670 e 1690-1700 cm -1 [37, 38]. A estrutura da bobina aleatória tinha uma banda forte próxima a 1645 cm −1 [37]. As percentagens de α-hélice, β-sheet, unordered e β- estruturas giratórias em SPI são mostradas na Figura 4.


Deconvolução dos espectros de amida I (curva contínua), suas bandas GCF (linha de ponto) e os espectros de segunda derivada de SPI.

(uma)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(uma)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f) Efeitos do tratamento térmico nas estruturas secundárias do SPI (amostra de SPI não aquecida considerada como 0). (a) SPI aquecido a 70 ° C com uma concentração de proteína de 2% (b) SPI aquecido a 70 ° C com uma concentração de proteína de 5% (c) SPI aquecido a 80 ° C com uma concentração de proteína de 2% (d) SPI aquecido a 80 ° C com uma concentração de proteína de 5% (e) SPI aquecido a 90 ° C com uma concentração de proteína de 2% (f) SPI aquecido a 90 ° C com uma concentração de proteína de 5%.

Neste estudo, a estrutura secundária predominante do SPI aquecido é β-folha, confirmando dados previamente relatados em outros estudos [39, 40]. O conteúdo relativo dos elementos da estrutura secundária variou com os diferentes tratamentos térmicos. Os tratamentos térmicos causaram um aumento no α-helix estrutura conteúdo e diminuiu o β- conteúdo da estrutura da folha em comparação com a amostra SPI não tratada. As alterações estruturais secundárias de proteína observadas no aquecimento (diminuição em β-estrutura da folha) são consistentes com a literatura [41].

Além disso, o β- o conteúdo da folha diminuiu e α-helix e β- a estrutura de rotação geralmente aumentou, enquanto o conteúdo da estrutura não ordenada teve pequenas diferenças quando aquecido a 70 ° C com uma concentração de proteína de 2% por 45 min. Sugeriu que o calor induziu uma auto-remontagem de β-sheet para α-helix e β- estrutura de rotação, como β- estrutura da folha sempre foi encontrada no interior da molécula dobrada, e perda parcial de β- a estrutura da folha indicou a exposição de locais hidrofóbicos da proteína que podem causar um aumento na hidrofobicidade da superfície.

Conforme mostrado na Figura 4 (b), o conteúdo geral dos elementos da estrutura secundária após o tratamento térmico com 5% de concentração de proteína foi semelhante ao da amostra de SPI não aquecida, indicando que o SPI aquecido a 70 ° C com 5% de concentração de proteína permanece parcialmente seu original estrutura, mas o SPI aquecido a 70 ° C com 5% de concentração de proteína não teve uma tendência contínua em comparação com a de 2% de concentração de proteína.

A partir dos resultados mostrados em experimentos DSC, a globulina 7S desnaturou após aquecimento por 15 min a 80 ° C. A desnaturação da globulina 7S aumentou α- estrutura em hélice e reduziu o β- estrutura de folha (como mostrado nas Figuras 4 (c) e 4 (d)). O conteúdo da estrutura desordenada do SPI tratado com uma concentração de proteína de 5% aumentou e permaneceu constante com uma concentração de proteína de 2% em comparação com o SPI não aquecido.

Conforme mostrado nas Figuras 4 (c) e 4 (d), o α-helix e β-vire o conteúdo da estrutura aumentou e depois diminuiu, enquanto o β- o conteúdo da estrutura da folha diminuiu e, em seguida, aumentou após o tratamento térmico a 80 ° C, independentemente da concentração considerada. Pode ser atribuído à desnaturação de β-conglicinina e agregação formada gradualmente. A desnaturação da globulina 7S por 15 min de tratamento térmico a 80 ° C aumentou α-estrutura em hélice, mas reduzida β-sheet structure. O antiparalelo aumentado β- estrutura de folha de aquecimento de proteína de soja em período mais longo foi relatada como associada ao agregado formado por α' e αSubunidades -7S [28]. Lee et al. [42] relataram que o envolvimento de β-folhas na estrutura secundária de agregados de proteínas podem ser atribuídas às áreas de superfície relativamente grandes para ligações de hidrogênio ordenadas. Além disso, a força de hidratação da água mais fraca de β-sheet, em comparação com α-estruturas helicoidais, podem desempenhar um papel na formação de agregados e redes. Isso se deve à geometria diferente das interações água-grupo carbonila nessas conformações [43]. Além disso, neste estudo, o tratamento térmico a 80 ° C geralmente aumentou β-vire a estrutura que pode ser um produto do desdobramento de quaisquer estruturas de ordem superior, onde antiparalela β-strands podem ser formados como intermoleculares β-folhas na interfase de algumas moléculas agregadas da proteína [33]. O aquecimento do SPI com uma concentração de proteína mais alta a 80 ° C aumentou ligeiramente o conteúdo da estrutura desordenada, enquanto diminuiu com uma concentração de proteína mais baixa. Algumas possíveis razões podem explicar esses resultados: maior concentração de proteína prejudicou a eficácia do tratamento térmico, pode formar mais agregados e alterar o equilíbrio da fração de agregado consistente original e, então, perturbar o conteúdo dos elementos da estrutura secundária.

Conforme mostrado nas Figuras 4 (e) e 4 (f), aqueça o SPI a 90 ° C com uma concentração de proteína de 2% aumentada em porcentagem de α-estrutura hélice e diminuída β-sheet structure. Conforme o tempo de tratamento aumentou, a porcentagem de α-estrutura hélice e β- a estrutura da folha aumentou e depois diminuiu, enquanto o conteúdo da estrutura não ordenada mostrou uma tendência oposta. Além disso, uma transformação de α-estrutura hélice e β- estrutura da folha para βA estrutura de volta foi observada aos 60 min, quando ambas as globulinas 7S e 11S estavam completamente desnaturadas. Pode-se deduzir que β- a estrutura de rotação desempenha um papel importante no novo agregado formado, β-conglobulina / B-globulina conforme relatado por Petruccelli e Añón [28]. O maior aumento em β-vire a estrutura em 5% de concentração de proteína pode estar relacionada ao agregado intermediário da subunidade AB-globulina aumentada pelo aumento da concentração de proteína [28]. O conteúdo da estrutura secundária do SPI tratado termicamente em concentrações mais altas teve um padrão semelhante de variação para todos os tempos de tratamento térmico. Tomados em conjunto, a desnaturação da globulina 11S em 45 min aumentou o conteúdo da estrutura desordenada e diminuiu βelementos estruturais, independentemente da concentração de proteínas. Aquecimento de globulina 11S desnaturada com aumento de 5% na concentração de proteína

4% em porcentagem de α-hélice estrutura, embora nenhum aumento marcante foi observado a uma concentração de proteína de 2%.

3.4. Relação entre Hidrofobicidade de Superfície e Estrutura Secundária

Kato e Nakai [22] determinaram a hidrofobicidade da superfície de proteínas nativas, proteínas desnaturadas e proteínas ligadas ao surfactante pelo método de partição hidrofóbica e descobriram que a hidrofobicidade da superfície da proteína estava negativamente correlacionada com o αconteúdo -helical. Mas, neste estudo, a análise de correlação mostrou que havia uma correlação negativa significativa entre o conteúdo do β- estrutura da folha e hidrofobicidade da superfície

. No entanto, a hidrofobia de superfície exibiu uma correlação positiva significativa com o β-vire a estrutura de SPI aquecida a 70 ° C com 2% de concentração de proteína (

) Embora nenhuma correlação significativa tenha sido encontrada em uma concentração de proteína de 5%, uma transformação de β-sheet para ambos α-helix e β-viramento ocorreu em SPI tratado termicamente por 30 min e 60 min, levando a um aumento da hidrofobicidade da superfície, sugerindo que a transformação para elementos de estrutura ordenados (como α-helix e β- estruturas de folha) pode ser um fator importante que influencia a hidrofobicidade da superfície. No entanto, o conteúdo da estrutura secundária após o tratamento térmico por 60 min com uma concentração de proteína de 5% foi semelhante ao da concentração de proteína de 2%.

Uma correlação negativa significativa semelhante entre β- estrutura de folha e hidrofobia de superfície foram encontrados em 80 ° C aquecido SPI com 2% de concentração de proteína () e 5% de concentração de proteína (

) Enquanto isso, uma correlação positiva significativa entre a hidrofobicidade da superfície e a quantidade de αA estrutura em hélice foi encontrada em tratamentos térmicos com 5% de concentração de proteína. Nenhuma correlação significativa foi encontrada entre a hidrofobicidade da superfície e a estrutura secundária do SPI após tratamentos térmicos a 90 ° C.

Nossos resultados indicam que a hidrofobicidade da superfície foi provavelmente relacionada ao β-Estrutura de folha de SPI tratado termicamente, apresentando uma correlação inversa. Uma explicação razoável para esse fenômeno é que o βA estrutura da folha é uma estrutura secundária conectada por meio de ligações de hidrogênio intermoleculares ou intramoleculares, o que facilita a manutenção dos aminoácidos hidrofóbicos na estrutura interna. Após o tratamento térmico, a estrutura interna do SPI foi parcialmente interrompida, fazendo com que os aminoácidos hidrofóbicos mantidos na estrutura interna fossem expostos. Isso levou às mudanças observadas na hidrofobicidade da superfície. Além disso, devido às áreas de superfície relativamente grandes para ligações de hidrogênio ordenadas, β- a estrutura da folha pode desempenhar um papel na formação do agregado, influenciada pela interação hidrofóbica que é essencial para a estabilidade, conformação e função das proteínas [44]. Lee et al. [42] também relataram o envolvimento de β-folhas na estrutura secundária relatadas para desempenhar um papel na formação do agregado e da rede. Enquanto a hidrofobicidade de superfície afeta as interações proteína-proteína e então funciona como um indicador de interação hidrofóbica. Além disso, ambas as estruturas interrompidas por desnaturação e associação de subunidades seguida da formação de agregado podem alterar a interação de hidrofobicidade e o conteúdo de β- folha, em seguida, impacto na hidrofobicidade da superfície. Assim, as mudanças no conteúdo de β- estrutura de folha bem traçada com variação na hidrofobicidade da superfície.

Nenhuma correlação significativa a 90 ° C foi encontrada devido à desnaturação da globulina 11S, no entanto, uma correlação significativa a 80 ° C foi observada na temperatura de desnaturação da globulina 7S. A formação de agregados é uma explicação razoável para este fenômeno porque conforme o tempo aumentou, o aquecimento do SPI a 90 ° C dissociou sua estrutura quaternária, desnaturou as globulinas 7S e 11S e também promoveu a formação de diferentes agregados, conforme discutido acima, a formação de βAgregado -7S / AB-11S seguido de desnaturação da globulina 11S principalmente alterada β-vire a estrutura, enquanto a formação de α, αO agregado ′ -7S seguido de desnaturação da globulina 7S relacionada com β-sheet structure.

4. Conclusões

Nossos resultados demonstraram que a desnaturação por calor induziu um aumento na hidrofobicidade superficial e a hidrofobicidade superficial diminuiu com a formação de agregados. O tratamento térmico aplicado aumentou o α-helix estrutura conteúdo e diminuiu o β- conteúdo da estrutura da folha em comparação com o SPI não aquecido. O conteúdo da estrutura secundária variou com o tempo e a temperatura e com a concentração de SPI. Esta variação foi provavelmente devido à desnaturação das globulinas 7S e 11S e à formação de agregados. O conteúdo de β- a estrutura da folha mostrou correlação inversa significativa com a hidrofobicidade da superfície quando a temperatura usada no tratamento térmico foi inferior a 90 ° C.

Conflito de interesses

Os autores declaram não haver conflito de interesses quanto à publicação deste artigo.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer à Fundação de Ciências Naturais da China (Projeto nº 31071493), ao Ministério da Agricultura de Projetos de Sistemas de Tecnologia Moderna da Indústria da Soja (número de bolsa de pesquisa: nycytx-004), ao Centro Nacional de Pesquisa de Engenharia e Tecnologia de Soja e a Universidade Agropecuária do Nordeste pelo financiamento deste trabalho.

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Direito autoral

Copyright & # xA9 2014 Zhongjiang Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob a Licença de Atribuição Creative Commons, que permite o uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o trabalho original seja devidamente citado.


Como posso avaliar a hidrofobicidade e / ou carga superficial de uma proteína? - Biologia

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Citando proteína-sol

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Protein-Sol: Uma ferramenta da web para prever a solubilidade da proteína a partir da sequência.
Bioinformática (2017)

Software de previsão de solubilidade de sequência

Para executar várias sequências, o algoritmo preditivo está disponível para download. Métodos para o software de sequência de proteína-sol são descritos no artigo.

Com base no trabalho publicado em

Warwicker J, Charonis S, Curtis R.

Patches e software de mapa de calor

Os patches e o software de mapa de calor calculam e visualizam a distribuição de carga e hidrofobia pela superfície da proteína. Veja aqui um exemplo de patches e aqui um exemplo de mapas de calor.

Dada uma estrutura de PDB de proteína, nosso software eletrostático interno, usando métodos de Poisson-Boltzmann (FDPB) de diferenças finitas, calcula a distribuição de potencial em uma superfície e pode calcular o grau de hidrofobia do patch de superfície comparando a razão de não polar para a área de superfície acessível ao solvente polar (razão NPP) (SASA) para todos os átomos que não sejam de hidrogênio. As propriedades de superfície resultantes são adicionadas ao arquivo PDB na coluna do fator B, que pode ser visualizado e manipulado no site Protein-sol diretamente usando o visualizador NGL incorporado ou localmente no software de visualização preferido do usuário.

Para a exibição potencial, o arquivo PDB correspondente pode ser baixado e visualizado com aproximadamente o mesmo esquema de cores em PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, Versão 2.0 Schrödinger, LLC.) Usando o comando.


espectro b, red_white_blue, mínimo = -86, máximo = 86

Para a exibição de superfície não polar / polar, o arquivo PDB correspondente pode ser baixado e visualizado com um esquema de cores semelhante em PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, Versão 2.0 Schrödinger, LLC.) Usando o comando.


espectro b, magenta_branco_verde, mínimo = 0,4, máximo = 2,5

Métodos

Os métodos são descritos em nosso artigo, com base em trabalhos publicados em

O software NGL é usado sob a licença MIT, com código de tela cheia adaptado daqui

AS Rose, AR Bradley, Y Valasatava, JM Duarte, A Prlić e PW Rose.
Gráficos moleculares baseados na Web para grandes complexos.
2016


Arquivos suplementares

Patches de superfície carregados e hidrofóbicos contíguos em peptídeos restritos por hélice curta conduzem a permeabilidade celular

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Resumo

No mundo das proteínas de membrana, a topologia define uma importante casa intermediária entre a sequência de aminoácidos e a estrutura tridimensional totalmente dobrada. Embora o conceito de topologia de proteína de membrana remonte a pelo menos 30 anos, avanços recentes no campo da montagem de proteína de membrana mediada por translocon, estudos de proteoma de topologia de proteína de membrana e um número exponencialmente crescente de proteína de membrana de alta resolução estruturas nos deram uma compreensão mais profunda de como a topologia é determinada e de como ela evolui.


Informação suplementar

Funções que correspondem a um modelo matemático das forças moleculares que determinam as estruturas e interações das proteínas. A escolha de uma função de energia define um mapa de estruturas em valores de energia, referido como uma paisagem de energia, que pode guiar a previsão de estrutura e simulações de projeto. Funções de energia de proteína típicas são combinações lineares de múltiplos termos, cada termo capturando uma contribuição energética distinta (interações de van der Waals, eletrostática, dessolvatação), com os pesos e parâmetros atômicos para esses termos escolhidos por um procedimento de parametrização que busca otimizar a concordância entre as quantidades previstas a partir da função de energia e os valores correspondentes derivados de experimentos ou de cálculos de química quântica em pequenos sistemas químicos.

Uma forma de aprendizado de máquina que emprega redes neurais artificiais com muitas camadas de processamento interno para reconhecer padrões em conjuntos de dados grandes e complexos, como imagens visuais e linguagem escrita e falada.

Interações de Van der Waals

Interações interatômicas ou intermoleculares que são individualmente fracas (muito mais fracas do que ligações covalentes ou iônicas) e de alcance relativamente curto.

Um conjunto discreto de conformações frequentemente adotadas por cadeias laterais de aminoácidos.

Os parâmetros livres em um sistema que determinam sua estrutura e, portanto, sua energia. Eles podem ser contínuos, como um ângulo de torção de backbone com valor real ou posição atômica, ou discretos (permitindo apenas um número finito de alternativas). Devido às fortes preferências de torção, as conformações de cadeia lateral podem ser modeladas com sucesso usando um conjunto discreto de rotâmeros, identificados pela análise do banco de dados estrutural.

Um ângulo de torção (ou ângulo diedro) que descreve a rotação em torno da ligação que conecta o nitrogênio da estrutura principal e o carbono Cα da estrutura principal de um aminoácido em uma cadeia polipeptídica. É um dos dois principais graus de liberdade (junto com o ângulo psi) por resíduo de aminoácido que as proteínas usam para adotar conformações alternativas.

Um ângulo de torção (ou ângulo diedro) que descreve a rotação em torno da ligação que conecta o carbono Cα do esqueleto e o carbono carbonil do esqueleto de um aminoácido em uma cadeia polipeptídica. É um dos dois principais graus de liberdade (junto com o ângulo phi) por resíduo de aminoácido que as proteínas usam para adotar conformações alternativas.

Um ângulo de torção (ou ângulo diedro) nas cadeias laterais de aminoácidos que é numerado com base na proximidade na conectividade química da ligação ao esqueleto da proteína. Chi1 refere-se à rotação em torno da ligação mais próxima da espinha dorsal, chi2 é a próxima posição mais próxima e assim por diante. Alguns aminoácidos, como alanina e glicina, não têm ligações rotativas ou ângulos de torção, enquanto outros, como lisina e arginina, têm até quatro.

Um pacote de software para a previsão e projeto de estruturas e interações de proteínas que implementa uma ampla gama de algoritmos de amostragem conformacional de backbone e de cadeia lateral e métodos de otimização de sequência.

Um algoritmo para otimização de rotâmero de cadeia lateral que funciona eliminando rotâmeros que não são compatíveis com a adoção da sequência com a menor energia possível.

Um protocolo para projetar sequências que atribui uma probabilidade à observação de cada aminoácido em cada posição de sequência na proteína e calcula uma energia média (campo médio) para a proteína com base nas probabilidades atribuídas. As probabilidades são então ajustadas para diminuir a energia do campo médio da proteína.

Uma abordagem probabilística para identificar sequências de baixa energia que aceita ou rejeita mudanças de sequência com base na mudança calculada na energia da proteína quando uma mudança de sequência é feita e na temperatura do sistema modelado. Se uma mudança diminui a energia da proteína, é automaticamente aceita se aumenta a energia do sistema, é aceita com alguma probabilidade que depende de quanto a energia aumentou (um aumento maior de energia é menos provável de ser aceito ) e a temperatura atual (em temperaturas mais altas é mais provável que aceite mudanças que aumentem a energia do sistema). A temperatura é reduzida à medida que a simulação avança, para identificar sequências de baixa energia.

Um protocolo de otimização de sequência que modifica repetidamente uma população de sequências aplicando rodadas de seleção baseada em energia. A energia de uma sequência é calculada modelando-a na conformação de proteína desejada. Seqüências de baixa energia têm maior probabilidade de progredir para a próxima geração. Antes de cada rodada de seleção, as sequências vencedoras anteriores são recombinadas umas com as outras e um pequeno número de mutações é incorporado às sequências, para procurar sequências de energia mais baixa.

Algoritmos de design multiestado

Uma abordagem para projetar sequências que satisfaçam várias restrições simultaneamente. Por exemplo, esses algoritmos podem ser usados ​​para encontrar sequências de proteínas que se prevêem que ligam o ligando X, mas não o ligando Y. Alternativamente, eles podem ser reaproveitados para encontrar sequências que são simultaneamente boas na ligação do ligando X e do ligando Y.

Uma abordagem experimental para sondar uma grande biblioteca de sequências de proteínas (até dezenas de milhões) para ligação a outra molécula. Na biblioteca final de levedura, cada célula de levedura contém o DNA de um membro da biblioteca de proteínas, e essa proteína é expressa como uma proteína de fusão que apresenta a proteína do lado de fora da célula. As células são misturadas com a molécula alvo, que foi marcada com um corante fluorescente, e então a seleção de células ativadas por fluorescência é usada para identificar as células que contêm uma proteína projetada que se liga à proteína alvo. O sequenciamento de DNA é usado para identificar os designs que passaram na seleção.

Família de proteínas estruturalmente relacionadas que interagem entre si para induzir ou reprimir a apoptose.

Um termo que descreve abordagens que usam a alta especificidade de sequência de interações de DNA para projetar sequências de DNA que se dobrarão em formas bidimensionais e tridimensionais complexas e previsíveis.

Principais complexos de histocompatibilidade

(MHCs). Conjunto de proteínas de superfície celular que se ligam a antígenos de patógenos estranhos e os apresentam para reconhecimento por outras proteínas e células do sistema imunológico. Eles são um componente chave do sistema imunológico adquirido.


Assista o vídeo: NanotechnologiaPG Warstwy Hydrofobowe cz. 2 (Janeiro 2022).