Em formação

Software para contagem de ovos de mosca


Existe algum software que poderia ser usado para rapidamente (mais rápido que humanos) conte os ovos postos por Drosófila em um substrato, colocando-os sob um microscópio com uma câmera acoplada? Os ovos são colocados na superfície dos alimentos e têm uma forma bastante uniforme - regularmente temos que contar o número de ovos em> 200 frascos, o que pode levar mais de 4-5 horas para cada 100 frascos.

Eu me pergunto se existe algum software que poderia ser vinculado a um microscópio com câmera montada conectada a um computador, o software poderia então contar a partir da transmissão ao vivo ou de uma fotografia tirada rapidamente. Não teria que ser perfeito, mas contanto que pudesse ser tão preciso quanto os humanos (o que é surpreendentemente baixo pela nossa experiência - contamos até uma determinada quantidade e removemos o resto, por exemplo, se eu pretendia deixar 180 ovos I ficaria muito feliz em obter algo entre 150-200 ovos). Seria usando um estereomicroscópio (também conhecido como microscópio de dissecação) com uma câmera montada.

A superfície da comida com ovos se parece com isto -> puramente para ilustração, tirada com o iPhone - imagens reais no microscópio seriam capazes de se aproximar (a superfície do alimento poderia preencher a tela) e ter uma iluminação mais uniforme para dar melhor contraste (isso foi tirado para mostrar em uma palestra, então eu queria mais bonito do que prático ) Os dois quartos inferiores da comida nesta imagem seriam semelhantes ao resultado real, apenas muito mais perto ...


ImageJ é um software multiplataforma que possui um módulo contador de células que pode ser de alguma utilidade, e ei, seu gratuitamente! É fácil de usar e tão absurdamente rudimentar que é muito versátil. Lembro-me de usá-lo na graduação para contar células sob o microscópio automaticamente após alguns ajustes de contraste de imagem. Não vejo por que isso não pode ser reaplicado para contar os ovos.

Download: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html

Documentação do contador de células: http://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html


Compreender o cérebro, em parte, significa compreender como o comportamento é criado.

A engenharia reversa de como os circuitos neurais conduzem o comportamento requer um rastreamento preciso e vigoroso do comportamento, mas as tarefas cada vez mais complexas que os animais realizam no laboratório tornaram isso desafiador.

Agora, uma equipe de pesquisadores do Rowland Institute em Harvard, da Harvard University e da University of Tübingen está recorrendo à tecnologia de inteligência artificial para resolver o problema.

O software que eles desenvolveram, apelidado de DeepLabCut, utiliza novas técnicas de aprendizado para rastrear recursos desde os dígitos de ratos até o comportamento de postura de ovos em Drosophila e além. O trabalho é descrito em um artigo de 20 de agosto publicado na Nature Neuroscience.

O software foi idealizado por Mackenzie Mathis, Rowland Fellow no Rowland Institute em Harvard Alexander Mathis, um pós-doutorando que trabalha no laboratório de Venkatesh N. Murthy, professor de biologia molecular e celular e presidente do Departamento de Biologia Molecular e Celular e Matthias Bethge, professor da Universidade de Tübingen e presidente do Centro Bernstein de Neurociência Computacional de Tübingen.

A noção de usar software para rastrear os movimentos dos animais nasceu em parte por necessidade. Tanto Mackenzie quanto Alexander Mathis tentaram usar técnicas tradicionais, que normalmente envolvem a colocação de marcadores de rastreamento em animais e o uso de heurísticas, como segmentação de objetos, com sucesso variável.

Essas técnicas costumam ser sensíveis à escolha dos parâmetros de análise, e os marcadores ou tatuagens são invasivos e podem impedir comportamentos naturais ou podem ser impossíveis de colocar em animais muito pequenos ou selvagens, disseram eles.

Felizmente, competições internacionais nos últimos anos impulsionaram avanços na visão computacional e no desenvolvimento de novos algoritmos capazes de estimar a pose humana (rastrear automaticamente as partes do corpo humano).

Esses algoritmos, no entanto, são amplamente vistos como ávidos por dados, exigindo milhares de exemplos rotulados para a rede neural artificial aprender. Isso é proibitivamente grande para experimentos de laboratório típicos e exigiria dias de rotulagem manual para cada comportamento.

A solução veio no que é chamado de “aprendizagem por transferência”, ou aplicação de uma rede já treinada para um problema diferente, semelhante à forma como os cientistas acreditam que os sistemas biológicos aprendem.

Usando um algoritmo de última geração para rastrear o movimento humano, chamado DeeperCut, os Mathises foram capazes de mostrar que o aprendizado profundo pode ser altamente eficiente em dados. O nome do novo software é uma homenagem aos autores do DeeperCut.

O software rastreia os movimentos de uma mosca pondo ovos e os dígitos de um mouse.

Assim como uma criança não precisa desenvolver outro sistema visual do zero para reconhecer um novo objeto, mas depende de milhares de horas de experiência e as adapta para reconhecer novos objetos, DeepLabCut é pré-treinado em milhares de imagens contendo objetos naturais, imagens de martelos, gatos, cães, alimentos e muito mais.

Com esse pré-treinamento implementado, o software precisava de apenas 100 exemplos de ratos realizando um experimento de navegação guiada por odores para reconhecer partes específicas do corpo do mouse tão bem quanto os humanos poderiam.

A equipe também foi capaz de aplicar a tecnologia a ratos fazendo movimentos de alcance e, em colaboração com Kevin Cury, um neurocientista da Universidade de Columbia, a moscas pondo ovos em uma câmara 3-D.

“Ficamos muito impressionados com o sucesso da abordagem de aprendizagem por transferência e a versatilidade do DeepLabCut”, disse Mackenzie Mathis. “Com apenas algumas centenas de quadros de dados de treinamento, fomos capazes de obter um rastreamento preciso e robusto em uma miríade de condições experimentais, animais e comportamentos.”

“Os experimentalistas têm intuições muito boas sobre quais partes do corpo devem ser analisadas para estudar um determinado comportamento, mas tradicionalmente extrair as coordenadas dos membros de vídeos tem sido muito desafiador - o DeepLabCut faz exatamente isso com base em alguns exemplos”, disse Alexander Mathis. “Uma vez que o programa é projetado como uma solução 'plug-and-play' amigável e não requer nenhuma habilidade de codificação, ele pode ser amplamente utilizado.”

“Queremos que o maior número possível de pesquisadores se beneficie de nosso trabalho”, disse Bethge. “DeepLabCut foi criado como um software aberto, pois o compartilhamento de resultados, dados e também algoritmos é essencial para o progresso científico.”

Mesmo com a publicação do artigo que descreve o software, a tecnologia foi usada por mais de 50 laboratórios para estudar tudo, desde o andar de cavalos até a dinâmica de bactérias e o movimento de robôs cirúrgicos.

A caixa de ferramentas do software pode ser usada com mínima ou nenhuma experiência de codificação e está disponível gratuitamente em mousemotorlab.org/deeplabcut.

Este estudo foi financiado com o financiamento da Marie Sklodowska-Curie International Fellowship, do Rowland Institute em Harvard, do Project ALS Women & amp the Brain Neuroscience Fellowship, da German Science Fundação (DFG) CRC 1233 em Visão Robusta e IARPA por meio do programa MICrONS.


Genética de Drosophila Melanogaster

Introdução:
Gregor Mendel revolucionou o estudo da genética. Ao estudar a herança genética em plantas de ervilha, Gregor Mendel estabeleceu duas leis básicas que servem como alicerces da genética moderna: Lei de Segregação de Mendel e Lei de Variedade Independente. A Lei da Segregação de Mendel diz que cada característica tem dois alelos e que cada gameta contém um e apenas um desses alelos. Esses alelos são uma fonte de variabilidade genética entre os descendentes. A Lei da Variedade Independente de Mendel diz que os alelos de uma característica se separam independentemente dos alelos de outra característica. Isso também ajuda a garantir a variabilidade genética entre os descendentes.
As leis de Mendel têm suas limitações. Por exemplo, se dois genes estão no mesmo cromossomo, a variedade de seus alelos não será independente. Além disso, para genes encontrados no cromossomo X, a expressão da característica pode ser ligada ao sexo da prole. Nosso conhecimento de genética e as ferramentas que usamos em seu estudo avançaram muito desde a época de Mendel, mas seus conceitos básicos ainda são verdadeiros.
Drosophila melanogaster, a mosca da fruta comum, tem sido usada para experimentos genéticos desde T.H. Morgan começou seus experimentos em 1907. Drosophila dá bons espécimes genéticos porque são pequenos, produzem muitos descendentes, têm mutações facilmente discerníveis, têm apenas quatro pares de cromossomos e completam todo o seu ciclo de vida em cerca de 12 dias. Eles também têm necessidades alimentares muito simples. Os cromossomos 1 (o cromossomo X), 2 e 3 são muito grandes, e o cromossomo Y - número 4 - é extremamente pequeno. Esses quatro cromossomos têm milhares de genes, muitos dos quais podem ser encontrados na maioria dos eucariotos, incluindo humanos.
Os embriões de Drosophila se desenvolvem na membrana do ovo. O ovo choca e produz uma larva que se alimenta escavando o meio. O período larval consiste em três estágios, ou instares, o final de cada estágio marcado por uma muda. Perto do final do período larval, o terceiro instar sobe pela lateral do frasco, se fixa em uma superfície seca e forma uma pupa. Depois de um tempo, os adultos emergem.
As diferenças nas características corporais ajudam a distinguir entre as moscas machos e fêmeas. As fêmeas são ligeiramente maiores e têm abdômen pontiagudo de cor clara. O abdômen dos homens será escuro e rombudo. As moscas machos também têm cerdas escuras, pentes sexuais, na parte superior das patas dianteiras.

Hipótese:
Após realizar um cruzamento dihíbrido entre machos com asas normais e olhos sépia e fêmeas com asas vestigiais e olhos vermelhos, esperamos ver apenas híbridos com asas normais e olhos vermelhos na primeira geração filial. Então, esperamos observar uma proporção de 9: 3: 3: 1 de fenótipos na segunda geração filial.

Materiais e métodos:
Os materiais usados ​​para este laboratório foram: frasco de cultura de cross dihybrid, álcool isopropílico 10%, escova de cabelo de camelo, termo-anestesiante, placa de Petri, 2 frascos e rótulos de Drosophila, meio de Drosophila, necrotério de mosca.

Um frasco de Drosophila do tipo selvagem foi imobilizado termicamente e as moscas foram colocadas em uma placa de Petri. Traços foram observados. Um frasco de Drosophila preparada foi imobilizado e então observado sob um microscópio de dissecação. Machos e fêmeas foram separados e as mutações foram observadas e registradas. A geração dos pais foi colocada no necrotério. O frasco foi colocado em uma incubadora para permitir que a geração F1 amadurecesse.
A geração F1 foi imobilizada e examinada em microscópio de dissecação. O sexo e as mutações de cada mosca foram registrados. Cinco pares de acasalamento da geração F1 foram colocados em um frasco de cultura fresco, e o frasco foi colocado em uma incubadora. As moscas F1 restantes foram colocadas no necrotério. As moscas F1 foram deixadas no frasco por cerca de uma semana para acasalar e botar ovos. Em seguida, os adultos foram removidos e colocados no necrotério. O frasco foi colocado de volta na incubadora para permitir que a geração F2 amadurecesse. A geração F2 foi imobilizada e examinada ao microscópio de dissecação. O sexo e as mutações de cada mosca foram registrados.

Tabela 1 Fenótipos da geração parental

Fenótipos Número de machos Número de Mulheres
Asas normais / olhos vermelhos 0 0
Asas normais / olhos sépia 3 0
asas vestigiais / olhos vermelhos 0 4
asas vestigiais / olhos sépia 0 0

Tabela 2 Fenótipos da geração F1

Fenótipo Número de machos Número de Mulheres
Asas normais / olhos vermelhos 78 95
Asas normais / olhos sépia 0 0
asas vestigiais / olhos vermelhos 0 0
asas vestigiais / olhos sépia 0 0

Tabela 3 Fenótipos da geração F2

Fenótipos Número de machos Número de Mulheres
Asas normais / olhos vermelhos 4 7
Asas normais / olhos sépia 4 5
asas vestigiais / olhos vermelhos 0 1
asas vestigiais / olhos sépia 0 0
forma normal do corpo vermelho / mutado 2 0
sépia normal / formato do corpo mutado 1 0
  1. Como os alelos para genes em diferentes cromossomos são distribuídos aos gametas? Que princípio genético isso ilustra?
    Os alelos em diferentes cromossomos são distribuídos independentemente uns dos outros, demonstrando a Lei da Variedade Independente de Mendel.
  2. Por que era importante ter fêmeas virgens no primeiro cruzamento (gerando a geração F1), mas não no segundo cruzamento (gerando a geração F2)?
    Era importante ter fêmeas virgens para o primeiro cruzamento para garantir que os descendentes fossem o resultado do cruzamento desejado. Não foi necessário isolar fêmeas virgens para o segundo cruzamento porque as únicas moscas machos às quais foram expostas também eram membros da geração F1.
  3. O que o teste do qui-quadrado revelou sobre a validade dos dados do seu experimento? Qual é a importância desse teste?
    O teste do qui-quadrado mostrou que os resultados do nosso primeiro cruzamento eram válidos, mas os resultados do nosso cruzamento F1 não eram normais. É importante conduzir esse teste para determinar o quanto seus dados experimentais se desviaram do que era esperado.

Discussão e conclusão:
Os resultados de nosso cruzamento parental saíram exatamente como o esperado, mas nossa geração F2 não foi normal. Deve ter ocorrido algum tipo de mutação que causou a estranha forma corporal observada em vários indivíduos de nossa geração F2.


por W.S. Cranshaw, D.A. Leatherman e J.R. Feucht * (7/14)

Fatos rápidos & # 8230

  • Mineiros são insetos que se alimentam dentro de uma folha, produzindo grandes manchas ou túneis sinuosos.
  • Embora as lesões da minadora sejam visíveis, a maioria delas produz lesões que têm pouco ou nenhum efeito sobre a saúde das plantas.
  • A maioria dos mineiros tem muitos controles naturais que normalmente proporcionam um bom controle dos mineiros.
  • Os inseticidas aplicados quando os mineiros põem ovos são úteis para o controle de muitos mineiros.
Figura 1: Massa de ovo de traça de espinafre.

Mineiros são insetos que têm o hábito de se alimentar dentro das folhas ou agulhas, causando lesões nos túneis. Vários tipos de insetos desenvolveram esse hábito, incluindo larvas de mariposas (Lepidoptera), besouros (Coleoptera), moscas (Hymenoptera) e moscas (Diptera). A maioria desses insetos se alimenta durante todo o período larval dentro da folha. Alguns também irão formar uma pupa dentro da mina de folhas, enquanto outros têm larvas que cortam seu caminho quando crescidas para formar uma pupa no solo.

Os mineiros de folhas às vezes são classificados pelo padrão da mina que eles criam. Serpentina folha minas vento como uma cobra através da folha, alargando-se gradualmente à medida que o inseto cresce. Mais comuns são vários mancha minas de folhas geralmente arredondadas de forma irregular. Um subgrupo desses são os tentiforme minadores de folha, que produzem minas protuberantes do tipo mancha que se curvam para cima, como uma tenda, conforme o tecido danificado da folha seca. Os padrões de mineração geralmente são combinações dos itens acima, como espécies que inicialmente produzem minas serpentinas, mas terminam criando a cavidade foliar alargada de uma mina manchada.

As áreas minadas por insetos morrem e secam. Embora as lesões produzidas por insetos minadores de folhas possam ser pouco atraentes, é raro que afetem significativamente a saúde das plantas. Além disso, a maioria dos mineiros tem controles naturais importantes que normalmente verificam as populações antes que muitos danos sejam causados ​​às plantas.

Lesões causadas por insetos mineradores de folhas e agulhas podem parecer superficialmente com sintomas produzidos por fungos manchadores de folhas ou outros problemas abióticos. Eles podem ser diferenciados separando a área manchada. Se danificada por insetos, a folha ou agulha terá uma área oca e pode expor qualquer um
o inseto e / ou seus excrementos (excrementos). Fungos manchadores de folhas causam o colapso dessas áreas, sem
qualquer tunelamento.

Figura 2: Lesão da traça do olmo.
Figura 3: Lesões de minadores tentiformes em choupos.
Figura 4: Lesão da traça lilás. Foto cortesia da coleção Ken Gray.

Mineiros de folhas comuns de árvores e arbustos

Sawfly Leafminers. A maioria das borboletas mastiga na superfície das folhas, mas quatro espécies encontradas no Colorado se desenvolvem como minadoras de folhas de plantas lenhosas. Os adultos são vespas pequenas, de cor escura e que não picam, que inserem ovos nas folhas recém-formadas. As larvas em desenvolvimento produzem grandes manchas nas folhas durante o final da primavera. As minas-serras produziram uma única geração a cada ano.

Minerador de olmo (Kaliofenusa ulmi) é a espécie mais importante, sendo localmente comum em várias cidades de Front Range onde se desenvolve em olmos americanos, ingleses e siberianos. Outras espécies incluem: traça do espinheiro-alvar (Profenusa canadensis) associado com Crateagus crus-galli, C. persimilis, e C. erectus minador de folhas de bétula (Fenusa Pusilla) presente em algumas plantações de bétulas brancas ou cinzas e garimpeira de amieiro (Fenusa dohrnii), uma espécie nativa que se desenvolve nas folhas de amieiro.

Mineradores tentiformes. Larvas de várias mariposas minúsculas (Phyllonorycter espécies) produzem manchas nas folhas que enrugam quando secam, parecendo um pouco com uma tenda de filhote. Essas minas tentiformes ocorrem em salgueiros, choupos e choupos, hackberry e macieiras, e as minas de folhas tendem a se concentrar nas folhas mais baixas e sombreadas. Provavelmente duas gerações são normalmente produzidas. Surtos são raros porque esses insetos são normalmente atacados por parasitas e outros inimigos naturais.

Minerador-da-folha lilás. Outra pequena mariposa, a traça lilás (Caloptilia Syringella) produz uma mina de mancha e, em seguida, dobra a borda das folhas de lilás e alfeneiro. Uma espécie relacionada, o traçador de folhas boxelder, Caloptilia negundella, produz lesões foliares semelhantes às folhas de boxelder. Existem duas gerações por ano e o ciclo de vida é provavelmente semelhante ao da minadora lilás.

Needleminers. Várias mariposas diminutas do gênero Coleotechnites têm larvas que se desenvolvem nas agulhas das coníferas. As agulhas afetadas parecem marrons além dos túneis das larvas. O mais importante é o pinheiro ponderosa (Coleotechnites ponderosae) que tem produzido surtos periódicos em áreas florestais de pinheiro ponderosa. Espécies relacionadas ocorrem em pinheiros, pinheiros e abetos.

Aspen leafminer. Minas delicadas e sinuosas na superfície da folha superior das folhas do álamo são características de outra pequena mariposa, Phyllocnistis populiella. A alimentação das lagartas que produzem as minas produz danos insignificantes e principalmente porque podem atrair a atenção.

Besouro choupo blackmine. Grandes manchas pretas nas folhas de choupo são produzidas por larvas de um besouro das folhas (Zeugophora scutellaris) Os adultos mastigam pequenos caroços na folha. Os surtos são extremamente raros e o inseto causa apenas danos menores às folhas.

Gorgulho-pulga do olmo-europeu. Provavelmente, o mais novo inseto minador de folhas a se estabelecer no Colorado é o gorgulho-pulga do olmo europeu (Orchestes Alni) As larvas fazem uma mina de folhas no olmo que superficialmente se assemelha à da mosca-serra da minadora-das-folhas do olmo. A mina do gorgulho-pulga do olmo europeu origina-se de uma nervura da folha, serpenteia em forma de serpente e termina em uma mancha ao longo da borda da folha. Os adultos são minúsculos besouros que saltam e fazem covas nas folhas, produzindo uma aparência rendada de folhagem quando abundantes.

Figura 5: Minerador serpentino em videira produzida por pequena mariposa.
Figura 6: Minas de serpentina produzidas em folha de choupo.
Figura 7: Mina de minador de folhas de espinafre exposta da mina de folhas.

Manejo de mineiros de árvores e arbustos

Poucos, se houver, minadores de folhas representam qualquer ameaça significativa à saúde de árvores ou arbustos. As lesões são cosméticas e as decisões de tratamento são baseadas na aparência da planta.

Além disso, a maioria das minas foliares tem vários inimigos naturais que normalmente regulam bem suas populações. Os surtos, se ocorrerem, costumam durar muito pouco. No entanto, exceções a isso podem ocorrer entre as espécies não nativas que não são tão bem regulamentadas por inimigos naturais em áreas como o Colorado, onde foram introduzidas recentemente. Exemplos de minadores não nativos são aqueles encontrados no olmo (traça do olmo, gorgulho da pulga do olmo europeu), bétula (traça do vidoeiro) e nos mineiros tentiformes da maçã.

Se os controles forem tentados com inseticidas, há duas abordagens a serem consideradas. O primeiro envolve sprays aplicados às folhas que são programados para coincidir com os períodos em que ocorre a postura dos ovos & # 8211 geralmente logo após as folhas terem se expandido na primavera. Inseticidas de contato persistentes podem ser usados ​​para essa finalidade, como os vários piretróides que atualmente predominam para o controle de insetos que mastigam as folhas (permetrina, bifentrina, lambda-cialotrina, ciflutrina, deltametrina). Nenhum deles se moverá sistemicamente em plantas tão ativas larvas dentro das minas não serão afetadas. Sprays de inseticidas neonicotinóides sistêmicos (imidacloprid, dinotefuran) podem fornecer algum controle desses estágios entre minadores da folha que são besouros (Coleoptera) ou moscas-serra (Hymenoptera). Os neonicotinóides tendem a ser precários no controle das lagartas, o estágio larval das mariposas (Lepidoptera).

Como alternativa, os inseticidas neonicotinóides podem ser aplicados ao solo para absorção pela raiz. O imidaclopride (Merit, vários genéricos) está amplamente disponível para esta aplicação, tanto na maioria dos viveiros quanto em aplicadores comerciais. Atualmente, o dinotefuran (Safari) está disponível apenas por meio de aplicadores comerciais.

Mineiros de vegetais e flores

Leafminers Columbine. Pelo menos duas espécies de moscas minadoras do gênero Phytomyza produzir minas de folha em columbine. Um produz minas manchadas, enquanto as minas serpentinas são características da segunda espécie. Os adultos são minúsculas moscas escuras e as fêmeas fazem furos nas folhas com seu ovipositor para que possam beber os fluidos das plantas. A presença de pequenas marcas de punção é uma indicação da atividade desses insetos e pode ser útil para cronometrar a aplicação de inseticidas para controle.

Mineradores de folhas vegetais. Várias espécies de Liriomyza de moscas minadoras de folhas fazem longas minas serpentinas através de folhas de flores e plantas de horta. Normalmente esses insetos são muito bem controlados por inimigos naturais e os surtos quase sempre estão associados ao uso de inseticidas.

Mineiros de espinafre. O único inseto que regularmente extrai partes comestíveis das plantas é o traçador de folhas do espinafre (Pegomya hyoscyami), que produz manchas grandes e escuras em folhas de espinafre, beterraba e ervas daninhas relacionadas. Os adultos são pequenas moscas cinzentas, com cerca de metade do tamanho de uma mosca doméstica e surgem na primavera para botar ovos na parte inferior das folhas. Os ovos deste inseto são bastante distintos, sendo brancos e colocados em pequenas massas. Os problemas são mais comuns em jardins onde espinafre e beterraba hibernam e são cultivados continuamente, fornecendo plantas hospedeiras para os insetos. As lesões ocorrem mais comumente na primavera, mas há duas ou mais gerações produzidas durante a estação de crescimento.

Controles de mineiros de árvores e arbustos

Os controles não foram avaliados para os minadores de columbina, mas provavelmente podem ser manejados da mesma forma que os minadores de folhas em árvores e arbustos. Além disso, as feridas de picada de alimentação que as moscas fazem podem fornecer um meio precoce de detecção de sua atividade, permitindo assim que os tratamentos sejam aplicados contra os adultos que põem ovos.

Nenhum controle para as minas vegetais é recomendado. Muitos inseticidas têm atividade fraca contra esses insetos e, muitas vezes, as aplicações de inseticidas pioram os problemas, destruindo de forma diferenciada os inimigos naturais.

As minas de espinafre apresentam problemas diferentes à medida que aparecem nas plantações comestíveis. Em jardins, o meio mais simples e eficaz de controlar este inseto é verificar regularmente as plantas quanto à presença de ovos, que podem ser esmagados manualmente. As folhas com larvas em crescimento ativo devem ser colhidas e destruídas, deixando as folhas colhidas no solo para permitir que as larvas terminem de se desenvolver.


Por que usar Drosophila?

Os professores devem usar as moscas da fruta para estudos genéticos do ensino médio por vários motivos:
1. Eles são pequenos e fáceis de manusear.
2. Eles podem ser facilmente anestesiados e manipulados individualmente com equipamentos não sofisticados.
3. São sexualmente dimórficos (homens e mulheres são diferentes), o que torna muito fácil diferenciar os sexos.
4. As moscas-das-frutas virgens são fisicamente distintas dos adultos maduros, tornando mais fácil obter machos e fêmeas virgens para cruzamentos genéticos.
5. As moscas têm um tempo de geração curto (10-12 dias) e se dão bem em temperatura ambiente.
6. O cuidado e a cultura das moscas-das-frutas requerem pouco equipamento, são de baixo custo e ocupam pouco espaço mesmo para grandes culturas.

Ao usar Drosophila, os alunos irão:
1. Compreender a genética mendeliana e a herança de características
2. Tirar conclusões dos padrões de hereditariedade a partir dos dados obtidos
3. Construir armadilhas para capturar populações selvagens de D. melanogaster
4. Obtenha uma compreensão do ciclo de vida de D. melanogaster, um inseto que exibe metamorfose completa
5. Construir cruzamentos de moscas do tipo selvagem e mutantes capturadas e conhecidas
6. Aprenda técnicas para manipular moscas, fazer sexo com elas e manter anotações concisas no diário
7. Aprenda técnicas de cultivo para manter as moscas saudáveis
8. Perceba que muitos experimentos científicos não podem ser realizados e concluídos dentro de uma ou duas sessões de laboratório

Padrões nacionais abordados nestas lições:
Contente:
1. Os organismos exigem um conjunto de instruções para especificar características (hereditariedade)
2. A informação hereditária está localizada nos genes.
3. Combinações de características podem descrever as características de um organismo.

Objetivos dos alunos:
1. Identificar questões e conceitos que orientam as investigações científicas
2. Projetar e conduzir investigações científicas
3. Formular e revisar explicações e modelos científicos usando lógica e evidências
4. Comunicar e defender um argumento científico

A genética da Drosophila está bem documentada e vários sites de domínio público apresentam o genoma anotado completo. Portanto, os professores ou alunos que desejam ver onde ocorrem suas mutações têm uma referência disponível.

Como a Drosophila tem sido amplamente usada na genética, existem muitos tipos diferentes de mutações disponíveis para compra. Além disso, o aluno atento pode encontrar mutações dentro de suas próprias culturas capturadas na natureza, pois, devido ao curto tempo de geração, as mutações são relativamente comuns em comparação com outras espécies animais.


Classificação
Domínio: Eukarya
Reino: Animalia
Filo: Arthropoda
Classe: Insecta
Ordem: Diptera
Família: Drosophilidae
Gênero: Drosophila (& # 8220 amante do orvalho & # 8221)
Espécie: melanogaster (& # 8220dark gut & # 8221)


Ciclo de vida de Drosophila melanogaster
Drosophila melanogaster exibe metamorfismo completo, o que significa que o ciclo de vida inclui um ovo, uma forma larval (semelhante a uma minhoca), pupa e finalmente a emergência (eclosão) como um adulto voador. É o mesmo que a conhecida metamorfose das borboletas. O estágio larval tem três instares, ou mudas.


Dia 0: Fêmea põe ovos
Dia 1: Os ovos eclodem
Dia 2: primeiro ínstar (um dia de duração)
Dia 3: segundo ínstar (um dia de duração)
Dia 5: terceiro e último ínstar (dois dias de duração)
Dia 7: As larvas começam a fase de roaming. A puparia (formação de pupa) ocorre 120 horas após a postura dos ovos
Dia 11-12: Eclosão (adultos emergem da caixa de pupa).

• O tempo de geração de Drosophila melanogaster varia com a temperatura. O ciclo acima é para uma temperatura de cerca de 22 ° C (72 ° F). Moscas criadas em temperaturas mais baixas (até 18 ° C ou 64 ° F) levarão cerca de duas vezes mais tempo para se desenvolver.
• As fêmeas podem colocar até 100 ovos / dia.
• As fêmeas virgens são capazes de botar ovos, mas são estéreis e em número reduzido.

Após a eclosão dos ovos, pequenas larvas devem ser visíveis no meio de cultivo. Se a mídia for branca, procure a pequena área preta (os ganchos da boca) na cabeça das larvas. Alguns meios pré-misturados secos são azuis para ajudar a identificar as larvas, mas isso não é uma necessidade e com um pouco de paciência e prática, as larvas são facilmente vistas. Além disso, à medida que as larvas se alimentam, elas rompem a superfície lisa do meio e, portanto, olhando apenas para a superfície, pode-se dizer se as larvas estão presentes. No entanto, é sempre uma boa ideia verificar novamente usando um microscópio estereoscópico. Após o terceiro ínstar, as larvas começarão a migrar para cima no frasco de cultura a fim de pupar.


Identificação e quantificação específica de RNAs circulares a partir de dados de sequenciamento

Motivação: Os RNAs circulares (circRNAs) são uma classe mal caracterizada de moléculas que foram identificadas décadas atrás. Métodos emergentes de sequenciamento de alto rendimento, bem como os primeiros relatórios sobre funções confirmadas, geraram novo interesse nesta espécie de RNA. No entanto, as ferramentas computacionais de detecção e quantificação ainda são limitadas.

Resultados: Desenvolvemos o tandem de software, DCC e CircTest DCC usa a saída do mapeador de leitura STAR para detectar sistematicamente junções de emenda de volta em dados de sequenciamento de próxima geração. O DCC aplica uma série de filtros e integra dados em conjuntos replicados para chegar a uma lista precisa de candidatos a circRNA. Avaliamos o desempenho de detecção de DCC em um conjunto de dados de cérebro de camundongo recém-gerado e dados de sequenciamento disponíveis publicamente. Nosso software atinge uma precisão muito maior do que os concorrentes de última geração em níveis de sensibilidade semelhantes. Além disso, o DCC estima circRNA versus expressão do gene do hospedeiro a partir da contagem de leituras de junção e não junção. Essas contagens de leitura são finalmente usadas para testar a independência do gene hospedeiro da expressão de circRNA em diferentes condições experimentais por nosso pacote R CircTest. Demonstramos os benefícios desta abordagem em circRNAs dependentes da idade relatados anteriormente na mosca da fruta.

Disponibilidade e implementação: O código-fonte do DCC e do CircTest está licenciado pela GNU General Public License (GPL) versão 3 e disponível em https://github.com/dieterich-lab/[DCC ou CircTest].

Contato: [email protected]

Informação suplementar: Dados suplementares estão disponíveis em Bioinformática online.


Métodos

Linhagens, criação e transformação da mosca-da-oliveira

A criação da mosca-da-oliveira foi realizada usando métodos padrão. Aproximadamente 4.500 embriões de mosca da oliveira no estágio de pré-blastoderme do laboratório de Demócrito (Grécia) B. oleae cepa foram microinjetados com o plasmídeo OX3097 e piggyBac mRNA. como descrito por Koukidou et al. [31]. Isso resultou em 138 sobreviventes de G0 adultos. Depois de pools de retrocruzamento de cinco sobreviventes do sexo masculino com dez fêmeas do tipo selvagem e cinco sobreviventes do sexo feminino com cinco machos do tipo selvagem, seis linhas OX3097 foram isoladas (eficiência de transformação

4%). Os transgênicos foram cruzados por cinco gerações com a cepa de tipo selvagem Argov (Israel), e esses derivados de Argov cruzados foram usados ​​para todos os experimentos. A cepa Argov foi derivada de coleções de campo de mosca-da-azeitona macho selvagem em Israel, cruzada com fêmeas de Demócrito. Para desenvolver uma cepa homozigótica, um pool de adultos OX3097D-Bol homozigotos e heterozigotos foi gerado pelo cruzamento de heterozigotos OX3097D-Bol. O DNA desses pais foi analisado por PCR usando iniciadores (5'-CCTGCGTTTGGAGATGACGAAATC-3 'e 5'-CTTACATATAGAGCAGTGCGCTCACATG-3') que anelam aos locais genômicos que flanqueiam o local de inserção produzindo um amplicon WT (sem inserção) foram descartados. Homozigotos foram assim identificados, e uma linha homozigótica foi desenvolvida a partir de 15 fêmeas e 13 moscas fundadoras machos. As principais propriedades fenotípicas identificadas nos heterozigotos OX3097D-Bol (Figura 1, 2) também foram encontradas na linha homozigótica.

PCR de transcriptase reversa

Transcritos de tTAV masculino e feminino [14, 34] foram amplificados por transcriptase reversa (RT) -PCR usando cDNA sintetizado usando um kit comercial (Superscript II Life Technologies, Grand Island, NY, EUA) em extratos de RNA preparados usando reagente TRI (Life Technologies ) Os principais produtos de RT-PCR foram sequenciados (GATC Biotech, Konstanz, Alemanha) e analisados ​​usando VectorNTi (Life Technologies).

Competição de mate e testes de re-acasalamento

Mating competitiveness tests were carried out in accordance with the United Nations Food and Agriculture Organization (FAO)/IAEA/United States Department of Agriculture (USDA) guidelines [20] in semi-natural caged conditions (cages were 1.25 m high with a base of 0.25 m 2 and contained a large olive branch) in greenhouse facilities at the University of Crete under natural light. Adult male OX3097D-Bol flies were obtained from larvae reared in the absence of tetracycline ("off-tet") at low density (1 larva/0.8 g larval medium). Wild pupae were recovered from infested olives gathered from olive orchards near to the University of Crete. Each mating test used 50 OX3097D-Bol males, 50 wild males, and 50 wild females. Mated males were scored for the presence of the DsRed2 fluorescent marker by epifluorescence microscopy [32, 33] (Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA, USA). OX3097D-Bol mating competition tests were performed in 15 replicates with more than 400 couples assessed in total. Each experiment yielded a mating propensity of greater than 0.2 [20]. Mating cages for the first step of re-mating tests contained either wild females and OX3097D-Bol males or wild females and wild males. Mating couples were removed from cages. Mated females were grouped in accordance with the genotype of the first mate (OX3097D-Bol, n = 188 or wild-type, n = 296) and were transferred the following day to new cages with sufficient fresh wild and OX3097D-Bol males to give a 1:1:1 ratio of mated females, wild males, and OX3097D-Bol males. Cages were checked daily for re-mating events over the following 15 days. Re-mating couples were removed, and the male genotype assessed by epifluorescence microscopy.

Caged suppression of stable wild-type populations

The protocol for the caged suppression experiment was based on that of Wise de Valdez et al. [17]. Stable populations of wild-type (Argov) olive flies were established in four field cages (each 8 m 3 and containing an olive tree 1.5 m tall all the cages were contained within a single large glasshouse) over a 12-week period by introducing a fixed number of pupae to each cage weekly (250 in week 1, and 200 from weeks 2 to 12). To assess egg production rates and to sustain caged olive fly populations, four ceresin-wax cones (combined surface area approximately 550 cm 2 ) were added to each cage daily for female oviposition. Pupal additions for the first 4 weeks during population establishment originated from a wild-type stock colony thereafter, experimental cages were self-sufficient. Eggs were collected from the cages and counted daily. On week 12, the experimental cages were randomly divided into two RIDL-treatment and two no-treatment (control) cages. From week 13 onwards, RIDL-treatment cages received weekly additions of 1,600 OX3097D-Bol male pupae reared off-tet (an initial recruitment rate ratio of approximately 16 OX3097D-Bol males to 1 wild-type male). Once the OX3097D-Bol introductions began, pupal introductions to the RIDL-treatment cages were proportional to the cage's respective rate of egg production, with the control cages providing a coefficient of weekly egg production to pupal return. Numbers of females in a cage were monitored by collecting and counting dead females. The ratio of RIDL heterozygous to wild-type pupae returning to RIDL-treatment cages was monitored by fluorescence microscopy (OX3097D-Bol heterozygous females reared off-tet pupate but fail to eclose). Larvae were screened only after the returning population was separated, to remove the possibility of bias in selecting individual flies for reintroduction to the cage populations.

Análise estatística

Comparison of mating competitiveness between OX3097D-Bol and wild males was performed using a likelihood ratio test for goodness of fit with numbers of successfully mated males from both genotypes pooled across experiments, and compared against a theoretical 1:1 genotype ratio expected in random mating. Differences in copulation initiation time between the two possible mating combinations (OX3097D-Bol/wild female and wild male/wild female) were analysed using a circular statistics F-test with the statistical software Oriana for Windows (Kovach Computing Services, Anglesey, UK). The Pearson's χ 2 test was used to compare numbers of re-mated to non-re-mated females for both initial mating combinations. The same test was used to compare initial and second-mate choice. Unless otherwise stated, all statistical tests were performed using SPSS for Windows (version 10.0 SPSS Inc., Chicago IL USA), with significance set at P & lt 0,05.


Drawing Conclusions & Student Assessment

After collecting and analyzing their data, students will be ready to draw conclusions based on their analysis. The text that accompanies each module (see “Web Link” below) includes questions to guide students through the conclusion process. Joinpoint graphs and regressions from Module 1 will illustrate that initial populations with more females can both grow faster and larger. This can be determined by examining the slopes of the regressions and comparing the graph for the trials with two adults to the graph for the trial with four adults. The same process is applied to the data from Module 3 (the exception, of course, being that the data analysis from Module 3 is compared to the comparable analysis performed in Module 1). The comparison should show that more space allows populations to grow faster and larger. Students should be required to use data they collect to substantiate claims they make in conclusions.

Conclusions from Module 2 are not as statistically obvious as those from Modules 1 and 3. Students will create bar graphs from their data and then make height comparisons across the bars to draw conclusions, rather than relying on statistical outcomes from a linear regression. By comparing the heights of the bars within the graph, students should observe a relationship in which more food corresponds to larger populations.

In addition to the questions used to guide students in drawing conclusions, each module includes two sets of questions at the end of the module. Conclusion questions guide students to describe their conclusions and reflect on how the results may have altered or built upon prior knowledge. Challenge questions allow students to bring components of the module together to synthesize new ideas and make predictions. They also require students to apply the principles discovered in the module to other scenarios.


Food Defect Levels Handbook

Title 21, Code of Federal Regulations, Part 110.110 allows the Food and Drug Administration (FDA) to establish maximum levels of natural or unavoidable defects in foods for human use that present no health hazard. These "Food Defect Action Levels" listed in this booklet are set on this premise--that they pose no inherent hazard to health.

Poor manufacturing practices may result in enforcement action without regard to the action level. Likewise, the mixing of blending of food with a defect at or above the current defect action level with another lot of the same or another food is not permitted. That practice renders the final food unlawful regardless of the defect level of the finished food.

The FDA set these action levels because it is economically impractical to grow, harvest, or process raw products that are totally free of non-hazardous, naturally occurring, unavoidable defects. Products harmful to consumers are subject to regulatory action whether or not they exceed the action levels.

It is incorrect to assume that because the FDA has an established defect action level for a food commodity, the food manufacturer need only stay just below that level. The defect levels do not represent an average of the defects that occur in any of the products--the averages are actually much lower. The levels represent limits at which FDA will regard the food product "adulterated" and subject to enforcement action under Section 402(a)(3) of the Food, Drug, and Cosmetics Act.

As technology improves, the FDA may review and change defect action levels on this list. Also, products may be added to the list. The FDA publishes these revisions as Avisos in the Federal Registro . It is the responsibility of the user of this booklet to stay current with any changes to this list.

PRODUCTS WITHOUT DEFECT LEVELS

If there is no defect action level for a product, or when findings show levels or types of defects that do not appear to fit the action level criteria, FDA evaluates the samples and decides on a case-by-case basis. In this procedure, FDA's technical and regulatory experts in filth and extraneous materials use a variety of criteria, often in combination, in determining the significance and regulatory impact of the findings.

The criteria considered is based on the reported findings (e.g., lengths of hairs, sizes of insect fragments, distribution of filth in the sample, and combinations of filth types found). Moreover, FDA interprets the findings considering available scientific information (e.g., ecology of animal species represented) and the knowledge of how a product is grown, harvested, and processed.

USE OF CHEMICAL SUBSTANCES TO ELIMINATE DEFECT LEVELS

It is FDA's position that pesticides are not the alternative to preventing food defects. The use of chemical substances to control insects, rodents and other natural contaminants has little, if any impact on natural and unavoidable defects in foods. The primary use of pesticides in the field is to protect food plants from being ravaged by destructive plant pests (leaf feeders, stem borers, etc.).

A secondary use of pesticides is for cosmetic purposes--to prevent some food products from becoming so severely damaged by pests that it becomes unfit to eat.

USING THIS FOOD DEFECT ACTION LEVEL BOOKLET

This edition of The Food Defect Action Level includes the source of each defect and the significance of it (i.e., how the defect affects the food). Food processors may find this information helpful as a quality control tool in their operation.

Food commodities (Product) are listed alphabetically. Each listing indicates the analytical methodology (Defect Method) used, as well as the parameters for the defect (Defect Action Level).

The Macroanalytical Procedures Manual (MPM) is out of print. However, it is available on the web at Macroanalytical Procedures Manual.

For information on the availability of the Official Methods of Analysis by AOAC International, you may contact them at:

www.aoac.org
AOAC INTERNATIONAL
2275 Research Blvd, Ste 300
Rockville, MD 20850-3250 USA
•+1 (800) 379-2622 (Toll Free North America)
•+1 (301) 924-7077 (Worldwide)

The Glossary describes terms used throughout this booklet.

GLOSSÁRIO

CONTAMINATION

Addition of foreign material, (e.g., dirt, hair, excreta, non-invasive insects, machinery mold) to a product.

Small free-swimming marine crustaceans, many of which are fish parasites. In some species the females enter the tissues of the host fish and may form pus pockets.

Refers to the condition of the product which shows the evidence of the pest habitation or feeding, (e.g., tunneling, gnawing, egg cases, etc.).

Consists of the bacterial breakdown of the normal product tissues and the subsequent enzyme induced chemical changes. These changes are manifested by abnormal odors, taste, texture, color, etc.

ECONOMIC ADULTERATION

Intentional failure to remove inedible materials from the finished product, or the intentional addition or substitution of cheaper food or ingredient to a product.

EXTRANEOUS MATERIALS

Any foreign matter in a product associated with objectionable conditions or practices in production, storage, or distribution. Includes: objectionable matter contributed by insects, rodents, and birds decomposed material and miscellaneous matter such as sand, soil, glass, rust, or other foreign substances.

FOREIGN MATTER

Includes objectionable matter such as sticks, stones, burlap bagging, cigarette butts, etc. Also includes the valueless parts of the raw plant material, such as stems.

A resinous glaze on an almond kernel that is induced by an insect injury or mechanical damage.

occurs during the harvesting process.

A condition due to the growth of an organism in a host, (e.g., rot or decay, visible mold mycelia).

INFESTATION

The presence of any live or dead life cycle stages of insects in a host product, (e.g., weevils in pecans, fly eggs and maggots in tomato products) or evidence of their presence (i.e., excreta, cast skins, chewed product residues, urine, etc.) or the establishment of an active breeding population, (e.g., rodents in a grain silo).

Refers to downy mildew which is a fungus infection that causes yellow-brown spots on the leaves of edible greens in the mustard family.

Refers to the results of the Howard mold count method which is reported as the percentage of positive microscopic fields that have been scored as either positive or negative based on the presence or absence of a minimum amount of mold hyphae. Performed only on comminuted fruits and vegetables, and some ground spices. The source of the mold hyphae is rotten raw material that is processed along with sound raw material but is no longer visible due to the comminution process.

Evidenced by the presence of bolor (mold hyphae and/or spore forming structures) that are visible to the unaided eye. Microscopic examination may be used to confirm the presence of characteristic hyphal filaments and fruiting structures.

POST HARVEST

occurs after harvest, for example:

field holding of the harvested crop prior to transit

farm storage of harvested crop

during transit by truck, ship, rail, etc.

at the processing facility, awaiting processing or proper storage

occurs while product is in the field, during growth or awaiting harvest.

occurs while in the processing facility, in storage or during processing.

A condition where a product has a disagreable odor or taste of decomposed oils or fat. For example, rancid nuts frequently are soft, with a yellow, dark, or oily appearance, a bitter taste and a stale odor.

Plant tissue that is visibly decomposed, usually discolored with disagreeable odors and taste. The plant tissue has been invaded and is being digested by microorganisms. Although rot can also be caused by bacteria and yeasts, these organisms are secondary invaders. Molds are the primary organisms of decomposition and the presence of mold hyphae in the tissue is used to confirm rot.

A condition where the nut kernel is shrunken and not fully developed, commonly a result of climatic stress or infection by certain molds.

SIGNIFICANCE OF DEFECT

Refers to the real or potential impact on the consumer due to the presence of a particular defect. A listed defect can have more than one significance to the consumer (e.g., the mold defect of whole cassia has an aesthetic significance, whereas the mold defect of green coffee beans has a potential health hazard significance due to the threat of mold toxins produced by the mold species known to infect coffee beans).

In fruits, consists of the bacterial breakdown of the product and the formation of lactic acid and subsequent sour taste.

WATER INSOLUBLE INORGANIC MATTER

A contaminant of the finished product that consists of fine grit that originates from the sand, dirt, and stones that contaminate the raw agricultural product at the time of harvest.

WHOLE OR EQUIVALENT INSECT

A whole insect, separate head, or body portions with head attached.

Any condition where the product has been affected by organisms or the environment that it has no food value.


Conclusão

As we begin the second century of using Drosófila as an experimental tool in the fields of genetics, cell biology, developmental biology, neurobiology, and evolutionary biology, the groundwork laid during the first century will enable the tractable complexity of the fly to continue offering valuable insights into basic science as well as applied, translational research toward human health. Students entering a research career will continue to find exciting and groundbreaking opportunities to contribute to scientific knowledge in the many Drosófila labs around the world.


Assista o vídeo: Tirando os parasita do filhote de coleiro (Janeiro 2022).