Em formação

Quanto tempo as amostras coradas de Ziehl-Neelsen duram?


Adquiri lâminas de TB no centro de saúde da minha cidade que são supostamente positivas para bactérias ácido-resistentes (AFB). No entanto, quando dei uma olhada nele, não vi basicamente nenhuma mancha de carbol-fucsina.

Eles foram dobrados individualmente em papel. Quando os abri, as manchas estavam levemente umedecidas com óleo de imersão, voltadas para baixo. Até agora, tudo bem (página 6). Mais tarde fui informado de que essas amostras foram preparadas 1º trimestre de 2019. Com base em minha pesquisa, as próprias soluções de coloração duram até 12 meses (página 33). Não consigo encontrar nenhum dado sobre quanto tempo uma amostra manchada duraria.

Eles descoloram com o tempo? Eu esperava que o AFB fosse brilhante, ou pelo menos ligeiramente rosa, mas não vejo tal coisa. Vejo bacilos, embora todos sejam quase transparentes / de cor azul de metileno.


Aqui estão alguns exemplos de imagens. Os 2 primeiros são como eu esperava que fosse o AFB, enquanto os próximos 2 são o que eu capturei (e eu acho que deveria conter o AFB). A última foto é um slide de calibração de 10um / div para referência.


Este estudo de TB pode ajudá-lo: página externa

Resumidamente, eles usaram amostras de 6 a 19 meses de idade, em sua maioria de má qualidade (devido à idade). A última frase da citação abaixo parece promissora.

Os 12.543 esfregaços de escarro armazenados no laboratório nacional de referência para TB por 6 a 19 meses foram armazenados em temperatura ambiente em uma caixa de lâminas de madeira sem lamínula. A maioria deles havia perdido a mancha refletindo a contracoloração com azul de metileno. A retenção de 436 slides duvidosos por ZN deu resultados decepcionantes ao longo de [...]

Após 6 a 19 meses de armazenamento de esfregaços de escarro corados com ZN em uma atmosfera sem ar condicionado, a cor vermelha brilhante dos ovos devido ao carbolfuchsin tinha virtualmente desaparecido. [...] Nesse caso, a recolocação ZN do esfregaço de escarro permite redescobrir os BAAR descoloridos.

Quando fiz isso da última vez, usamos amostras novas e com alguns meses de idade que se pareciam com a primeira de suas imagens. Basta dar uma olhada no jornal, eu acho.


Desenhar um círculo na parte inferior da lâmina usando uma caneta marcadora de vidro pode ser útil para designar claramente a área na qual você preparará o esfregaço. Você também pode rotular o slide com as iniciais do nome do organismo na borda do slide. Deve-se ter cuidado para que o rótulo não entre em contato com os reagentes de coloração.

  • Suspensões bacterianas em caldo: Com uma alça resfriada estéril, coloque uma alça cheia da cultura do caldo na lâmina. Espalhe por meio de movimento circular da alça de inoculação até cerca de um centímetro de diâmetro. A propagação excessiva pode resultar na interrupção do arranjo celular. Um esfregaço satisfatório permitirá o exame do arranjo celular típico e das células isoladas.
  • Culturas de placas bacterianas: Com uma alça resfriada estéril, coloque uma gota de água estéril ou solução salina na lâmina. Esterilize e resfrie o loop novamente e pegue uma amostra muito pequena de uma colônia bacteriana e mexa suavemente na gota de água / soro fisiológico na lâmina para criar uma emulsão.
  • Amostras de cotonete: Role o cotonete sobre a superfície limpa de uma lâmina de vidro.

Observe: É muito importante evitar a preparação de esfregaços espessos e densos que contenham excesso de amostra bacteriana. Um esfregaço muito espesso diminui a quantidade de luz que pode passar, dificultando a visualização da morfologia de células individuais. Os esfregaços normalmente requerem apenas uma pequena quantidade de cultura bacteriana. Um esfregaço eficaz aparece como uma fina camada esbranquiçada ou filme após a fixação por calor.


Quanto tempo as amostras coradas de Ziehl-Neelsen duram? - Biologia

Parasitol Latinoam 61: 117 - 120, 2006 FLAP

Detecção de Cryptosporidium oocistos por métodos de coloração de auramina e Ziehl Neelsen

ROSIL & EacuteIA M. DE QUADROS *, SANDRA M. T. MARQUES **, CAMILA R. AMENDOEIRA *, LARISSA A. DE SOUZA *, PAULA R. AMENDOEIRA * e CARLA C. COMPARIN *

* Departamento de Ci & ecircncias Biol & oacutegicas e da Sá & uacutede, Faculdade de Biologia, Universidade do Planalto Catarinense, Lages, Santa Catarina, Brasil.
** Laborat & oacuterio de Protozoologia, Faculdade de Medicina Veterin & aacuteria, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS,
Brasil.

Cryptosporidium spp é um patógeno intestinal comum em animais e humanos. Pode ter um impacto econômico importante nas fazendas e causar infecções potencialmente zoonóticas. Espécimes fecais foram coletados de 331 animais domésticos (81 bovinos de corte, 50 ovelhas, 100 porcos e 100 cães) e verificados quanto à presença de Cryptosporidium oocistos por meio de métodos de coloração de Ziehl Neelsen e auramina. Foi encontrada uma taxa de positividade geral de 7,5% (25/331), com taxas de 10% (10/100) entre os cães e 18,5% (15/81) entre os bovinos de corte. As fezes de ovelhas e porcos deram resultados negativos. Em bovinos de corte, 15 e 12 amostras positivas foram detectadas pelas técnicas de coloração com auramina e Ziehl Neelsen, respectivamente, sem diferença estatisticamente significante entre os dois métodos. Em cães, o mesmo número de amostras positivas foi encontrado por ambas as técnicas.

Palavras-chave: Cryptosporidium, animais domésticos, auramina, método Ziehl Neelsen.

Membros do gênero Cryptosporidium são organismos eucarióticos, incluindo parasitas obrigatórios e intracelulares. Cryptosporidium tem um ciclo de vida complexo, incluindo reprodução sexuada e assexuada, um ciclo auto-infeccioso e a capacidade de completar seu desenvolvimento em um único hospedeiro. A forma de transmissão é um oocisto robusto e resistente ao meio ambiente, excretado nas fezes, que pode permanecer por longos períodos no meio ambiente. Como os animais, em particular os animais domésticos, são seu hospedeiro primário, a infecção humana geralmente é zoonótica 1. Aqueles em maior risco são adultos e crianças imunocomprometidos, especialmente aqueles com AIDS, crianças em creches, viajantes para regiões endêmicas, trabalhadores de fazendas de gado leiteiro ou suas famílias ou contatos, contatos domésticos de casos ou portadores e, possivelmente, proprietários de cães infectados ou gatos ou seus vizinhos 2-4.

O gênero Cryptosporidium inclui 13 espécies atualmente consideradas válidas, distribuídas entre mamíferos domésticos e selvagens, aves, répteis e peixes. Outras espécies morfologicamente distintas foram encontradas em peixes, répteis, pássaros e mamíferos, mas não foram nomeadas 5. Cinco Cryptosporidium espécies (C. parvum, C. hominis, C. canis, C. meleagridis e C..felis ) são os agentes causadores da infecção em humanos 6.

C. parvum é um patógeno zoonótico composto de genótipos geneticamente distintos, mas morfologicamente idênticos. Embora estudos em larga escala de Cryptosporidium infecção em cães foram realizadas em vários países, os isolados não foram identificados com precisão devido à falta de um método para análise molecular. É importante identificar os isolados abrigados em cães, que entram em contato íntimo com humanos, a fim de controlar a criptosporidiose humana 7, 8.

Os gatos são uma fonte de criptosporidiose para humanos, independentemente de serem imunocomprometidos ou não, no entanto, apenas um caso humano foi descrito, no qual C. felis foi identificada pelo método molecular 9.

Em porcos, a prevalência de Cryptosporidium parvum foi investigado em todo o mundo, variando de 1 a 33% 10, e as seguintes taxas foram encontradas: Alemanha (1,4%), Espanha (21,9%), Japão (33,2%) Canadá (11%), Estados Unidos (7,1%) 11, 12. Diarreia pré-desmame, causada por um complexo de organismos protozoários, incluindo Isospora suis e Cryptosporidium spp., continua a ser um grande problema em suínos em todo o mundo 13. No entanto, devido às inadequações dos diagnósticos convencionais, pouco se sabe sobre a prevalência e o significado de Cryptosporidium em porcos 14.

É uma das principais causas de diarreia em ruminantes recém-nascidos, em bovinos, ovinos, veados 15 e caprinos 16, 17. Cryptosporidium a infecção no gado pode causar um impacto econômico importante para os agricultores devido à sua alta morbidade e às vezes altas taxas de mortalidade entre os animais de fazenda 18, e a doença está bem documentada. Comparativamente, há menos informações sobre a ocorrência de criptosporidiose em ovinos e caprinos, embora a infecção seja comum nesses animais com taxas de prevalência que variam de país para país, muitas vezes causando morte em cordeiros 12,17,19-21.

Poucos estudos foram realizados em cães e uma taxa de prevalência de 9,7% para criptosporidiose entre cães coreanos enquanto eles monitoravam fontes de contaminação ambiental 22 e uma taxa de 9,3% entre cães foi demonstrada em Osaka, Japão 8. Usando um método molecular, os autores identificaram todos os isolados como C. canis. Estudo realizado em São Paulo, Brasil, revelou prevalência de 6,8% para criptosporidiose em cães de rua 23 e de 2,41% no Rio de Janeiro 24.

O presente estudo foi realizado para investigar o estado da criptosporidiose em bovinos de corte, ovinos, suínos e cães nas regiões rural e urbana de Lages, estado de Santa Catarina, sul do Brasil, por meio de dois métodos diagnósticos.

Entre 331 amostras fecais, 81 foram coletadas de bovinos de corte de manejo extensivo, 50 de ovelhas de pastejo livre, 100 de porcos de criação intensiva e 100 de cães de criação em Lages, estado de Santa Catarina, Brasil. Entre os bovinos de corte, 32 tinham menos de 12 meses (17 fêmeas e 15 machos) e 49 fêmeas tinham até 12 meses. Dos cães, 40 eram fêmeas e 60 machos, jovens ou adultos, e todos residiam na periferia da zona urbana. Entre os porcos, havia 80 porcas e 12 marrãs, um macho com mais de 12 meses e 7 machos com até 12 meses. Entre as ovelhas, havia 49 ovelhas e um carneiro, todos com mais de 12 meses.

As amostras foram coletadas do reto de cada animal por meio de luvas descartáveis ​​de látex. As amostras foram submetidas à sedimentação dos oocistos por centrifugação, na qual o sedimento foi fixado com metanol por 5 minutos e posteriormente utilizado para o procedimento de esfregaço. Os espécimes foram esfregados em lâminas de vidro e corados pelas técnicas modificadas de Ziehl Neelsen e auramina 25,26.

As amostras coradas pela técnica de Ziehl Neelsen foram examinadas em microscopia de luz (1.000 X). Os esfregaços corados com auramina foram analisados ​​por microscopia de fluorescência, após triagem prévia (100 X) e posterior confirmação (400 X).

O teste exato de Fisher (Graphpad Software, v2.04) foi usado para a comparação entre os dois métodos de diagnóstico. Uma probabilidade de erro alfa inferior a 5% (p & lt 0,05) foi considerada estatisticamente significativa.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A taxa geral de positividade foi de 7,5% entre 331 amostras fecais examinadas para Cryptosporidium sp. A comparação entre as duas técnicas demonstrou que 25 (7,5%) e 22 (5,7%) amostras foram positivas para os métodos auramina e Ziehl-Neelsen, respectivamente.

De 100 amostras fecais coletadas de cães, 10 (10%) foram positivas, cinco em animais fêmeas e cinco em machos. Quando esses animais foram avaliados de acordo com a idade, Cryptosporidium sp. foi encontrado em 4 (40%) cães com menos de 12 meses e em 6 (60%) cães adultos. A taxa de infecção de 10% observada está de acordo com outros autores 8,23.

Das 15 amostras fecais de bovinos com resultado positivo para criptosporidiose, 7 (46,6%) pertenciam a bois e 8 (53,3%) a vacas. Em termos de idade, foram observados resultados positivos em 12 (80%) bovinos com menos de 12 meses e em 3 (20%) bovinos com mais de 12 meses.

A Auramine detectou 25 (100%) amostras positivas, enquanto o método Ziehl-Neelsen detectou 22 (80%) amostras positivas, sem diferença estatisticamente significativa.

As amostras fecais coletadas de ovelhas e porcos foram negativas para Cryptosporidium oocistos.

Vários métodos, incluindo flotação e sedimentação, são usados ​​para a detecção de Cryptosporidium oocistos no entanto, nenhum dos métodos mostra qualquer diferença 2. Auramine tem uma afinidade maior com o Cryptosporidium parede do oocisto do que fucsina, um corante vermelho usado na técnica de coloração de Ziehl Neelsen 25. Oocistos corados com auramina resistem à descoloração por 5 minutos, mas os oocistos corados pela técnica de Ziehl Neelsen exibem descoloração completa dentro do mesmo período. A coloração com auramina tem mais vantagens sobre o método de Ziehl Neelsen, ou seja, é mais rápida de realizar e ler e ideal para estudos de base populacional. As lâminas coradas, se protegidas da luz, podem durar meses e, posteriormente, podem ser coradas pela técnica de Ziehl Neelsen.

Os resultados da distribuição por idade neste estudo possivelmente refletiram um viés devido ao desvio da estrutura populacional em relação aos animais idosos nas áreas rurais e urbanas de nossa cidade. O contato direto com animais infectados é sugerido como um importante modo de transmissão de Cryptosporidium, que possivelmente está presente em todos os rebanhos bovinos domésticos do mundo com infecções assintomáticas e excreção prolongada de oocistos por bovinos reconhecidos como uma importante e contínua fonte de contaminação ambiental 27,3.

Pelo menos 13 Cryptosporidium espécies são atualmente reconhecidas, isto é baseado na genotipagem e em um número limitado de experimentos de transmissão. C. parvum foi recentemente conhecido por ter vários genótipos diferentes, como o genótipo 1, encontrado exclusivamente em humanos e alguns outros primatas, e o genótipo 2, encontrado na maioria dos mamíferos, incluindo humanos 27 embora C. hominis, encontrada exclusivamente em humanos, foi bem descrita 5,28.

A presente pesquisa demonstrou que Cryptosporidium A infecção de bezerros é importante e mais estudos são necessários para mostrar sua importância relativa, principalmente na síndrome diarreica neonatal.

Não avaliamos o genótipo de C. parvum nos animais deste estudo. Futuros estudos serão necessários para verificar o estado de infecção desses animais. A taxa positiva em bovinos de corte e cães sugere que esses animais podem ser uma fonte de infecção humana. Porque C. parvum é um importante patógeno protozoário transmitido pela água, a contaminação da água deve ser investigada para proteger a saúde pública do risco de transmissão do patógeno.

Além disso, esses resultados também destacam a importância de investigar a possibilidade de que outros animais também atuem como hospedeiros reservatórios para Cryptosporidium.

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Autor correspondente:

Sandra M.T. Marques. Email: [email protected]
Faculdade de Medicina Veterin & aacuteria da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Av. Bento Gon & ccedilalves 9090, CEP: 91540-000 Porto Alegre, RS, Brasil. Faxe: +55 51 33167305.

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Uma coloração de Ziehl-Neelsen altamente eficiente: identificação De novo Mycobacterium tuberculosis intracelular e melhoria da detecção de M. tuberculosis extracelular no líquido cefalorraquidiano

Fig 1 Comparação da coloração de Ziehl-Neelsen (ZN) convencional e modificada para amostras de LCR de pacientes com meningite tuberculosa. (A e B) A coloração convencional mostra estrutura celular danificada (A) e agregações celulares (B). Nenhum bacilo ácido-resistente intracelular (BAAR) é observado com o método convencional. (C) O método modificado pode concentrar AFB no CSF. AFB intracelular são frequentemente observados em neutrófilos (D), monócitos (E) e linfócitos (F). As setas mostram AFB ácido-resistente-corante-positivo. As inserções mostram visualizações de maior ampliação de AFB ou células indicadas por setas. Barras de escala, 20 (A a F) e 5 μm (inserções). Fig. 2 Distribuição intracelular de AFB em neutrófilos e monócitos na coloração de Ziehl-Neelsen modificada. A marcação dupla de AO (A e E, verde) com CD11b (B, vermelho) e ED1 (F, vermelho) mostra a localização intracelular de AFB em neutrófilos (A a D) e monócitos (E a ​​H). AO, CD11b e ED1 marcam AFB, neutrófilos e monócitos, respectivamente. Os núcleos são corados por Hoechst 33342 (azul). Os painéis D ′, D ″, H ′ e H ″ mostram visualizações de maior ampliação dos painéis D e H em z projeções do eixo. Barras de escala, 20 (A a H) e 5 μm (D ′, D ″, H ′ e H ″). Fig. 3 Distribuição intracelular de AFB em linfócitos na coloração de Ziehl-Neelsen modificada. A marcação dupla de AO (A e D, verde) com CD3 (B, vermelho) e CD20 (E, vermelho) mostra a localização intracelular de BAAR nos linfócitos (C e F). Os núcleos são corados por Hoechst 33342 (azul). Barra de escala, 5 μm.
Grupo ABF (n) % Taxa positiva (nº de amostras positivas) de cada técnica
Mancha ZNMancha ZN modificada
Extracelular (48)16.7 (8)100 (48)
Intracelular (48)0 (0)93.8 (45)
Fig 4 Comparação de campos AFB-positivos pela coloração de Ziehl-Neelsen convencional (CZN) e modificada (MZN). Foram observados trezentos campos em cada lâmina de 48 espécimes de LCR. Em comparação com a coloração de ZN, que não revela campos positivos para AFB intracelulares, a coloração de ZN modificada identifica definitivamente AFB dentro das células imunes. Além disso, a coloração modificada revela mais campos extracelulares AFB-positivos do que a coloração ZN convencional.

Colorações ácido-resistentes

A coloração ácido-resistente é outra técnica de coloração diferencial comumente usada que pode ser uma importante ferramenta de diagnóstico. Um mancha ácido-resistente é capaz de diferenciar dois tipos de células gram-positivas: aquelas que possuem ácidos micólicos cerosos em suas paredes celulares e aquelas que não possuem. Dois métodos diferentes para a coloração ácido-resistente são os Técnica Ziehl-Neelsen e a Técnica Kinyoun. Ambos usam carbolfuchsin como a mancha primária. As células cerosas e ácido-resistentes retêm a carbolfucsina mesmo após a aplicação de um agente descolorante (uma solução ácido-álcool). Um contra-corante secundário, azul de metileno, é então aplicado, o que torna as células não ácido-resistentes azuis.

A diferença fundamental entre os dois métodos baseados em carbolfuchsina é se o calor é usado durante o processo de coloração primária. O método Ziehl-Neelsen usa calor para infundir a carbolfucsina nas células álcool-ácido resistentes, enquanto o método Kinyoun não usa calor. Ambas as técnicas são importantes ferramentas de diagnóstico porque uma série de doenças específicas são causadas por bactéria ácido-resistente (AFB). Se AFB estiver presente em uma amostra de tecido, sua cor vermelha ou rosa pode ser vista claramente contra o fundo azul das células do tecido circundante (Figura 5).

Usando Microscopia para Diagnosticar Tuberculose

Figura 5. A coloração de Ziehl-Neelsen tornou essas células Mycobacterium tuberculosis vermelhas e o meio indicador de crescimento circundante azul. (crédito: modificação do trabalho pela American Society for Microbiology)

Mycobacterium tuberculosis, a bactéria que causa tuberculose, podem ser detectados em amostras com base na presença de bacilos álcool-ácido resistentes. Muitas vezes, um esfregaço é preparado a partir de uma amostra do escarro do paciente e, em seguida, corado usando a técnica de Ziehl-Neelsen (Figura 5). Se as bactérias álcool-ácido resistentes forem confirmadas, geralmente elas são cultivadas para fazer uma identificação positiva. Variações desta abordagem podem ser usadas como uma primeira etapa para determinar se M. tuberculosis ou outras bactérias ácido-resistentes estão presentes, embora as amostras de outras partes do corpo (como a urina) possam conter outras Mycobacterium espécies.

Uma abordagem alternativa para determinar a presença de M. tuberculosis é imunofluorescência. Nesta técnica, os anticorpos marcados com fluorocromo se ligam a M. tuberculosis, se presente. Corantes fluorescentes específicos para anticorpos podem ser usados ​​para visualizar as micobactérias com um microscópio de fluorescência.

Pense nisso


Bloqueando

Figura 3. O uso de agentes bloqueadores à base de proteínas reduz a coloração inespecífica.

Se você for usar anticorpos para rotular estruturas em suas células fixas e permeabilizadas, usar uma solução de bloqueio antes da etapa de anticorpo primário pode ser útil. O bloqueio geralmente é realizado com uma solução contendo um excesso de proteína que serve para reduzir a quantidade de ligações inespecíficas em sua amostra. Isso pode ser importante se o seu anticorpo primário ou secundário tiver tendência a interagir com moléculas na amostra que não são o seu alvo. A redução da coloração de “fundo” não específica, provavelmente devido a interações hidrofóbicas entre o anticorpo e as moléculas não-alvo, tornará mais fácil para você identificar um sinal positivo e fornecerá um resultado final mais limpo.

Os tipos mais comuns de soluções de bloqueio para ICC são albumina de soro bovino a 3% (p / v) em PBS e / ou uma solução de 10% (v / v) de soro específico de espécie inativado por calor em PBS, onde a espécie de soro corresponde as espécies do anticorpo secundário. Por exemplo, se você estiver usando um anticorpo secundário IgG anti-coelho de camundongo, escolha soro normal de camundongo inativado pelo calor para fazer o seu reagente de bloqueio.

Figura 4. Os agentes bloqueadores à base de proteínas ajudam a reduzir a coloração não específica. Os anticorpos são capazes de deslocar as proteínas de bloqueio para formar uma ligação de alta afinidade com seus epítopos, enquanto as proteínas de bloqueio evitam interações de anticorpos de baixa afinidade em outras partes da amostra.

Você vai querer incubar sua amostra em solução de bloqueio por pelo menos 60 minutos, mas também pode ser deixada durante a noite em temperatura ambiente ou na geladeira. Depois de concluir a etapa de bloqueio, se não for rotular com anticorpos, é importante remover o excesso de solução de bloqueio lavando com PBS.

Pode ser difícil descobrir onde algo deu errado em um processo de várias etapas, e a imunofluorescência não é exceção. As causas mais prováveis ​​de um resultado insatisfatório na imunofluorescência são o anticorpo primário (seja tipo e / ou concentração) ou anticorpo secundário (concentração). Consulte a rotulagem de anticorpos para obter sugestões sobre controles experimentais para ajudá-lo a otimizar seus resultados.


Soluções de microscopia para histologia e histopatologia

Patologia, histopatologia ou histologia tem como objetivo estudar a manifestação da doença pelo exame microscópico da morfologia do tecido. Na patologia, a amostra a ser examinada ao microscópio geralmente é o resultado de uma cirurgia, biópsia ou autópsia após a fixação, limpeza / inclusão e corte da amostra de tecido. Alternativamente, o processamento da seção congelada com um criostato é feito quando resultados rápidos são necessários (por exemplo, durante a cirurgia) ou a fixação seria prejudicial para as estruturas alvo, como lipídios ou certos antígenos. As seções de tecido após a fixação e incorporação de cera são normalmente cortadas em fatias de dois a cinco mícrons de espessura com um micrótomo antes da coloração e transferidas para uma lâmina de vidro para exame com um microscópio de luz. Os espécimes típicos em patologia são cólon, rim, pâncreas, colo do útero, pulmão, mama, próstata ou tecido conjuntivo.

Embora vários procedimentos de coloração para tecidos humanos / animais e vegetais tenham sido desenvolvidos já no século 17, foi o médico alemão Rudolf Virchow quem está sendo considerado o pai da histopatologia moderna. Virchow percebeu o potencial das novas técnicas emergentes de microscópio do século 19 para sua pesquisa inovadora, publicou uma vasta quantidade de escritos científicos e criou uma coleção impressionante de milhares de lâminas de amostras histopatológicas, construindo assim a base da histologia moderna e da pesquisa do câncer.

A preparação da lâmina para histologia começa com a fixação da amostra de tecido. Esta é uma etapa crucial na preparação do tecido e seu objetivo é evitar a autólise e a putrefação do tecido. Para melhores resultados, as amostras de tecido biológico devem ser transferidas para o fixador imediatamente após a coleta, geralmente em formalina tamponada neutra a 10% por 24 a 48 horas. Após a fixação, as amostras são aparadas com um bisturi para permitir que se encaixem em um cassete de tecido devidamente rotulado que é armazenado em formalina até o início do processamento.

A primeira etapa do processamento é a desidratação, que envolve a imersão da amostra em concentrações crescentes de álcool para remover a água e a formalina do tecido. A limpeza é a próxima etapa, na qual um solvente orgânico como o xileno é usado para remover o álcool e permitir a infiltração com cera de parafina. A incorporação é a etapa final, onde as amostras são infiltradas com o agente de incorporação - geralmente cera de parafina, que fornece uma matriz de suporte que permite cortes muito finos. Um micrótomo é usado para cortar seções de tecido extremamente finas do bloco na forma de uma fita, após a coloração histoquímica (normalmente hematoxilina e eosina - "coloração HE") para fornecer contraste às seções de tecido, tornando as estruturas de tecido mais visíveis e mais fáceis de avaliar . Em certos casos, as colorações imunohistoquímicas (IHC), como HER2 ou Ki-67, são necessárias para análises posteriores.


Protocolo de coloração IHC para amostras inteiras de montagem

A coloração de montagem inteira é a coloração de pequenos pedaços de tecido - geralmente embriões - sem cortes.

A coloração de montagem inteira é muito semelhante à imunocitoquímica (ICC) ou coloração de criosseções. Se um anticorpo foi usado com sucesso em criosseções (isso não inclui seções embebidas em parafina), então o anticorpo deve funcionar para um embrião de montagem inteira.

A diferença é que a amostra que está sendo tingida é muito maior e mais espessa do que uma seção normal de uma lâmina. Portanto, as incubações para fixador, tampão de bloqueio, anticorpo, tampão de lavagem, permeabilização e desenvolvimento de cor do substrato precisarão ser muito mais longas para permitir a permeabilização bem no centro da amostra.

O tempo dessas etapas precisará ser otimizado para seus experimentos, mas os detalhes nesses protocolos fornecem uma diretriz.

Fixação

Qualquer fixador que você usou com sucesso em IHC-Fr com seu anticorpo também deve ser adequado para montagem inteira. No entanto, a maioria dos pesquisadores usa paraformaldeído a 4% (PFA).

Embora esta concentração de PFA seja muito baixa, ela deve ser deixada ligada por um longo período de tempo em amostras de toda a montagem para permitir a permeabilização para o centro da amostra. Portanto, isso não será adequado para todos os anticorpos, pois a reticulação da proteína formada pelo fixador pode bloquear o acesso do anticorpo ao epítopo.

Normalmente, no IHC-P você pode realizar a recuperação do antígeno. Isso não é possível em amostras de embriões, pois o procedimento de aquecimento destruiria a amostra. Se a fixação de PFA não funcionar para todo o tecido da montagem, existe a possibilidade de o anticorpo ser sensível à reticulação da proteína e você precisará de outro fixador. O metanol é uma segunda escolha popular de fixador ao otimizar procedimentos de montagem inteira.

A fixação e preparação de embriões de peixe-zebra requerem etapas extras para garantir que a membrana do ovo seja permeabilizada.

Obtenção de imagens

Alguns pesquisadores veem e obtêm imagens de embriões como eles são. O embrião inteiro pode ser fotografado enquanto flutuando em tampão de glicerol em uma placa de Petri, antes da montagem. Se for pequeno o suficiente, o embrião inteiro pode ser montado em glicerol antes de ser colocado em uma lamínula. Nesse caso, a graxa deve ser usada ao redor do canto da lamínula para ajudar a mantê-la no lugar.

Os embriões também podem ser fixados em gelatina e seccionados se for difícil obter uma visão clara da coloração em todo o embrião (particularmente em estágios embrionários tardios maiores ou amostras de tecido maiores).

Se a marcação imunofluoresente for usada, a microscopia confocal pode ser uma ferramenta útil para escanear o embrião, em vez de seccionar todo o embrião em lâminas separadas após a coloração.

Escolhendo a idade do embrião

As the embryo grows, it will become too large to stain. The various reagents, including fixative, antibody and developing solution will not be able to permeate to the center of the sample, and the number of stained cells will make obtaining a clear image very difficult. However, larger and older embryos can be dissected into segments before staining if necessary.


Pathogenesis:

M. leprae replicates intracellularly, typically within skin histiocytes, endothelial cells, and the schwann cells of nerves. Cell mediated immunity (CMI) plays major part in determining the response of the host to leprosy.

  1. Tuberculoid leprosy: very few acid-fast bacilli in skin smear (paucibacillary disease): Cell-mediated immune (CMI) response is adequate and lepromin test is positive.
  2. Lepromatous leprosy: large numbers of Mycobacterium leprae chiefly in masses within the lepra cells, often grouped together like bundles of cigars or arranged in a palisade (multibacillary disease).The cell-mediated immune (CMI) response to organism is poor and the lepromin test is negative.

Ridley and Jopling (1966) have introduced a scale for classifying the spectrum of leprosy into five groups:

  1. Tuberculoid (TT)
  2. Borderline Tuberculoid (BT)
  3. Borderline (BB)
  4. Borderline Lepromatous (BL)
  5. Lepromatous (LL)

According to World Health Organization (WHO), leprosy is divided into two groups, paucibacillary and multibacillary.

Comparison of tuberculoid and lepromatous leprosy

Lepromin Skin Test:

The lepromin skin test is not used to diagnose leprosy but to determine what type of leprosy a person has. Lepromin skin test is similar to tuberculin test. An extract of M.leprae is injected intradermally and induration is observed 48 hours later in those whom a cell-mediated immune response against organism exists.

Lepromin test is employed mostly for the following two purposes.

1. To classify the lesions of leprosy patients.

2. To assess the prognosis and response to treatment.


Microbiology Interview Questions And Answers

  • Simple stain: where only one stain is used and all bacteria are stained similarly. Eg: F1ethylene blue, dilute carbol fuchsin
  • Differential staining: where different bacteria stain differently to a common staining technique depending on their physiological properties. Eg: Gram&rsquos stain and Acid fast staining
  • Special stain: where structures of bacteria like spores. granules. capsule etc are demonstrated. Eg: silver impregnation technique for demonstration of spirochetes. Feulgen stain for demonstration of nucleus. Sudan black stain for demonstration of lipid vacuoles. Ryu&rsquos stain for demonstration of flagella. Albert&rsquos stain for demonstration of metachromatic granules.
  • Negative staining: where the background is stained with an acidic dye such as India ink or Nigrosin. Used for demonstration of capsules.

Stains are classified based on the pH of their chromophore (color bearing ion) into acidic, basic and neutral. Acidic dyes have anionic chromophore

eg.. sodium+ eosinate-. Basic dyes have cationic chromophore eg.. metFiylene blue+ chloride-. Acidic dyes combine more strongly with cytoplasmic components of bacteria, especially the nucleus that is basic in nature. Neutral dyes have both acidic and basic component that nullity each other.

They are Romanowsky&rsquos stain and are used in staining parasitic forms. Stains can be either natural (eg: carmine and hematoxylin) or coal-tar derivatives /aniline stains (eg: methylene blue. crystal violet). Supravital (cells removed from the body) and intravital (cells still a part of the body).

LoetTler&rsquos methylene blue solution treated with Potassium hydroxide turns into Polychrome methylene blue after prolonged storage with shaking. Used in McFadyean&rsquos reaction for Bacillus anthracis in blood films and demonstration of metachromatic granules of Corynebacterium diphtheriae.

Hans Christian Gram invented this stain in 1884. The original formulation was Aniline Gentian violet. Lugol&rsquos iodine, absolute alcohol and Bismark brown.

Cell wall theory: Cell wall of Gram positive bacteria are 40 times thicker than those of Gram negative cells, hence they are thought to help retain the dye-iodine complex.
Lipid Content Theory: Cell envelope of Gram negative bacteria contains an additional membrane (outer membrane). hence containing more lipids than Gram positive bacteria. Acetone or alcohol dissolves the lipid thus forming large pores in Gram negative bacteria through which the dye-iodine complex leaks out. Alcohol/acetone dehydrates Gram positive bacteria shrinking the cell wall and the closing the pores.
Magnesium Ribonucleate Theory: A compound of magnesium ribonucleate and basic protein concentrated at the cell membrane helps Gram positive bacteria retain the primary dye. Gram negative bacteria do not possess this substance.
Cytoplasmic pH Theory: The cytoplasm of Gram positive bacteria are said to be more acidic (2) than those of Gram negative ones (3). Hence the dye is said to bind with more affinity to Gram positive cells.

It is the cytoplasm (especially the nucleic acid) that gets stained and not the cell wall. Presence of an intact cell wall is important for retaining Gram positivity. Cell wall deficient forms such as Mycoplasma and L forms are Gram negative.

  • Extremely slender bacteria such as Treponema
  • Cells containing waxy substances impermeable to stain such as Mycobacteria
  • Minute intracellular bacteria such as Chlamydia and Rickettsia
  • Cell organelles such as capsule. spore. flagella etc
  • Primary stain: Crystal violet. Methyl violet and Gentian violet
  • Mordant: Grams iodine, rarely Lugols iodine
  • Decolorizer: Alcohol, acetone. acteone-alcohol mixture (1:1)
  • Counterstain: Dilute carbol fuchsin. safranin, neutral red. (Sandiford stain ror Gonococcj
  • When over-decolourized by either prolonged exposure to decolourizer or using acetone alone.
  • When cell wall gets damaged by exposure to lysozyme or cell wall acting antibiotics such as Penicillin.
  • Old cultures, where cell wall is weakened or action of autolytic enzymes
  • Those bacteria that are phagocytosed. where cell wall is acted upon by lysosomal contents

Decolourization is the most important step as this step differentiates between Gram positive and Gram negative bacteria. Over-decolourization can result in Gram positive bacteria appearing Gram negative and under-decolourization can result in Gram negative bacteria appearing Gram positive.

  • Rapid presumptive diagnosis of diseases such as bacterial meningitis
  • Selection of empirical antibiotics based on Gram stain finding
  • Selection of suitable culture media based on Gram stain finding
  • Screening of quality of clinical specimens. such as sputum that should contain many pus cells and few epithelial cells
  • Counting of bacteria
  • Appreciation of morphology and types of bacteria in a clinical specimen
  • Kopeloll&rsquo and Beerman&rsquos (Primary stain: Methyl violet. decolourizer: acetone or alcohol-acetone mixture 1:1)
  • Jensen&rsquos (Primary stain: Methyl violet, decolourizer: absolute alcohol. counterstain: Neutral red)
  • Preston and Morrell&rsquos (Primary stain: crystal violet. decolourizer: iodine-acetone)
  • A.igert&rsquos (Primary stain: Carbol gentian violet. decolourizer: Aniline-xylol). This is used to stain tissue sections.

Certain bacteria or their structures have the ability to retain the primary dye (strong carbol fuchsin) and resist clecolourization by weak mineral acids such as H2S04. HCI. Such bacteria or their structure are termed acid fast and this property is termed acid fastness. There are two types of acid fast staining, the hot method and the cold method. The hot method (Ziehl-Neelsen) involves heating the slide while the cold methods such as Kinyoun&rsquos and Gabbett&rsquos do not involve heating the slide.

Ehrlich in 1882 discovered acid fastness. The original method involved staining with aniline-gentian violet and decolourization with strong nitric acid.

It was later improved by Ziehl and Neelsen.

The cell walls of Mycobacterla are made up of waxy substance, Mycolic acid that Is relatively Impermeable to ordinary stainIng techniques. But, by apphcation of heat and a mordant (phenol), the cell can be stained The purpose of heating is to soften the waxy material of the cell wall and allow the stain to enter the cell. Basic fuchsin is more soluble in phenol and phenol is a better solvent for lipids and waxes.

  • Primary stain: Strong Carbol Fuchsin (contain Basic fuchsin and Phenol)
  • Decolourizer 20% sulphuric acid
  • Counterstain LoelTler&rsquos Methylene blue or 1% Malachite green, Picric acid for color-blind workers

3% HCI in 95% alcohol (methylated spirit). This is useful in dilrerentiating saprophytic Mycobacteria from pathogenic Mycobacteria Pathogenic Mycobacteria are both acid and alcohol fast but saprophytic Mycobacterla are only acid-fast Saprophytic Mycobacterla can get declourized by alcohol. 95% alcohol can be used as a secondary decolorizer after decolourizing with acid Especially used in staining smears prepared from urine that may contain Mycobacterium smegmatis.

  • Mycobacterlum leprae - 5% H2S04
  • Oocysts of Cryptosporidium. Isospora - 1 % H2S04
  • Tissue sections containing Actinomyctes. Nocardia - 1 % H2S04
  • Cultures of Nocardia - 0.5% H2S04
  • Bacterial spores - 0.25-0.5% H2S04

The two methods namely Kinyoun&rsquos and Gabbetts dont involve heating of slides, hence called cold methods. Heating is substituted by increased concentration of phenol and prolonging the duration of staining. Kinyoun&rsquos method is favoured for detection of Cryptosporidium oocysts in fecal samples. Gabbetts method has decolourizer and counterstain in one solution.

For uniform distribution of heat, or else the slide may break.

  • A new slide must be used for every specimen. because scratch marks may give false positive.
  • A uniform smear from thick portion of the sputum must be made.
  • Staining jars should not be used to staining smear as there is risk to cross contamination
  • Fresh blotting paper must be used for each smear for drying the slide to prevent transfer from one slide to another.

At least 100 oIl Immersion fields must be viewed before declaring the smear as negative The sensitivity of smear Is low because It requires the presence of 104 bacillilml to be smear positive. If the number of bacilli is less than this, the chances of detecting them are less In such a case, the sample should be subjected to concentration techniques such as Petroff s method If the smear Es positive for AFB. it should be counted/graded Failure to detect any AFB does not rule tuberculosis Grading of smears has prognostic value.

Smears are graded depending on the number of bacilli seen

  • 3-9 bacilli/entire smear: +
  • 10 bacilli/entire smear ++
  • 10 bacilli/in most oil Immersion fields: +++

Sputum smears for Mycobacterla can be stained by fluorescent dyes such as Auramine and Rhodamlne as they have affinity for mycolic acid In their cell walIs The fluorescent microscopy is useful in screening large number of specimens. Large area of smear can be quickly observed that too under high power dry objective.

Beaded appearance is used to describe the appearance of Mycobacterla when the cell doesn&rsquot stain uniformly. showing stained and unstained regions. These forms are common in Mycobacterium tuberculosis while Mycobacterium bovis stains uniformly. Most saprophytic Mycobacteria stain uniformly.

Metachromatic granules are pol&rsquoymetaphosphate reserves produced by Corynebacterium diphtheriae in nutritious medium. These granules are also known as Babes Ernst granules. &lsquoblutin granules. Polar bodies etc. They are called metachromatic granules because of they exhibit metachromasia.

a property where the granules appear in a colour different from that of the dye used When stained with polychrome methylene blue, they appear purple They are produced In abundance In serum containing medium such as Loeffler&rsquos serum slope.

Albert&rsquos stain. Neissers stain, Ponder&rsquos stain and Pugh&rsquos stain They can be demonstrated as retractile bodies in wet mount or slightly more gram positive structures in Gram stain.

The bacdh are arranged at angles to each other resembling English letter V or L or Chinese letter (cuneiform) pattern because the daughter cells doWt separate completely after cell dMslon (binary rission).

Solution A(1) contains Toluidine blue, Malachite green, Glacial acetic acid and Alcohol while solution 8(2) contains iodine and potassium iodide In distilled water.

The process of kdling all hying forms including spores is called sterilization and the process of killing of only the vegetative form of pathogenic bacteria as well as other microbes is disinfection

121°C for 15 minutes at 15 pounds per square inch of pressure

Glassware&rsquos, metallic instruments like scissors and forceps, swabs. powder. oils and grease.

Culture media, gloVes. cotton and clothes.

By High Elliciency Particulate Air (HEPA) filters.

Phenol. Lysol, Formaldehyde. Sodium hypochlorite.

Antiseptics are mild disinfectants that can be safely used on skin and mucous membranes.

Quaternary ammonium compounds are positively charged polyatomic ions, which concentrate at the cell surface and alter the physical and chemical properties of the membrane, thus killing the cefl. Examples inlcude Benzalkonium chloride and Cetrimonium bromide.

The active ingredient of Dettol is chloroxylenol whereas Savlon contains a combination of Cetrimide and Chiorhexidine.

The active ingredients include Chlorhexidine. Triclosan. Thymol. Cetylpyridinium Chloride, and alcohol. The composition varies across brands.

These are the chemicals used for sterilization. They are 2% Gluteraldehyde (cidex). Ethylene Oxide (EO). Formaldehyde + steam and Beta &mdash Propiolactone (BPL).

  • Tincture Iodine - 2% of Iodine in 70% alcohol - lodophore - Povidone Iodine.
  • Name some antiseptics.
  • Chlorhexidine. Chloroxylenol. spirit (70% alcohol), tincture of Iodine. H202.

Sodium hypochlorite or Calcium hypochlorite

By treating them with disinfectant, boiling or autoclaving and finally by incineration

Gamma rays. Electron beams and Ethylene oxide

Glutaraldehyde or a combination of peracetic acid and hydrogen peroxide can be used.

Alkylation (hydrogen atom is replaced with an alkyl group) of protein. DNA. and RNA afFects bacterial metabolism and replication. EQ gas (8.5%) is often mixed with stabilizers such as CO2 (91 5%) or hydrochlorofluorocarbons (HCFC). This requires high humidity (40-80%) and long exposure times (1-6 hrs).

Ducking Is a process of inactivation of Anthrax spores in animal products such as wool, hairs or bristles. It was introduced by Elmhirst Duckering, an enginer at wool factory. This is a live-step process. each lasting for 10 minutes and carried out at 40.5°c.

  • immersion in 0.25-0.3% alkali
  • immersion in soapy water
  • immersion in 2% formaldehyde
  • secondimmersion in 2% formaldehyde
  • rinsinq in water

Porcelain filters. Seitz (asbestos) filters. Sintered glass filters. Membrane filters and HEP filters.

It disinfects and solidifies egg and serum containing media such as U medium and LoelTiers serum slope.


Assista o vídeo: Coileta de Amostras Microbiológicas (Janeiro 2022).