Em formação

2.3A: A Parede Celular Gram-Positiva - Biologia


objetivos de aprendizado

  1. Indique a cor que as bactérias Gram-positivas coram após o procedimento de coloração de Gram.
  2. Descreva a composição de uma parede celular Gram-positiva e indique as possíveis funções benéficas para a bactéria do peptidoglicano, ácidos teicóicos e proteínas de superfície.
  3. Descreva resumidamente como os PAMPs da parede celular Gram-positiva podem promover a inflamação.
  4. Declare a função das adesinas bacterianas, sistemas de secreção e invasinas.
  5. Defina antígeno e epítopo.

Bactéria Destacada

  1. Leia a descrição de Enterococcuse compare a bactéria com a descrição do organismo e a infecção que causa.

Conforme mencionado na seção anterior sobre peptidoglicano, as bactérias Gram-positivas são aquelas que retêm o corante violeta de cristal inicial durante o procedimento de coloração de Gram e aparecem roxas quando observadas ao microscópio. Como aprenderemos em laboratório, isso é resultado da estrutura e função da parede celular Gram-positiva.

Figura ( PageIndex {2} ) A.1: Coloração de Gram de Vcocos Gram-positivos corados com iolet e bactérias em forma de bastonete Gram-negativas coradas de rosa. da Wikipedia (Y tambe).

Para obter mais informações: Visualização da coloração de Gram do Laboratório 6.

Animação em flash ilustrando a interação dos reagentes de coloração de Gram em nível molecular
© Daniel Cavanaugh, Mark Keen, autores, Licenciado para uso, ASM MicrobeLibrary.

Bactérias Gram-positivas comuns de importância médica incluem Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, e Clostridium espécies.

Bactéria em destaque: Enterococcus espécies

Clique neste link, leia a descrição de Enterococcus, e ser capaz de comparar a bactéria com sua descrição em um exame.

Estrutura e composição da parede celular gram-positiva

1. Em micrografias eletrônicas, a parede celular Gram-positiva aparece como uma parede larga e densa de 20-80 nm de espessura e consistindo de várias camadas interconectadas de peptidoglicano (ver Figs. 1A e 1B). Quimicamente, 60 a 90% da parede celular Gram-positiva é peptidoglicano. Em bactérias Gram-positivas, pensa-se que o peptidoglicano é colocado em cabos de várias cadeias de glicano reticuladas com aproximadamente 50 nm de largura. Esses cabos então se tornam reticulados para maior resistência da parede celular.

2. Entrelaçados na parede celular dos Gram-positivos estão os ácidos teicóico e os ácidos lipoteicóicos. Os ácidos teicóicos se estendem através e além do resto da parede celular e são poliálcoois compostos de polímeros de glicerol, fosfatos e o álcool de açúcar ribitol e são covalentemente ligados ao peptidoglicano. Os ácidos teicóicos ligados covalentemente aos lipídios da membrana citoplasmática são chamados de ácidos lipoteicóicos (ver Figura ( PageIndex {1} ) B).

3. A superfície externa do peptidoglicano é cravejada de proteínas de superfície que diferem com a cepa e espécie da bactéria (ver Figura ( PageIndex {1} ) B).

4. O periplasma é o material gelatinoso entre o peptidoglicano e a membrana citoplasmática.

Para ver uma micrografia eletrônica de Estreptococo mostrando uma parede celular Gram-positiva, consulte a página da Web da Universidade Rockefeller.

Funções dos componentes da parede celular Gram-positiva

1. O peptidoglicano na parede celular Gram-positiva evita a lise osmótica.

2. Os ácidos teicóicos provavelmente ajudam a tornar a parede celular mais forte (ver Figura ( PageIndex {1} ) B).

3. As proteínas de superfície (ver Figura ( PageIndex {1} ) B) no peptidoglicano bacteriano, dependendo da cepa e da espécie, realizam uma variedade de atividades.

uma. Algumas proteínas de superfície funcionam como enzimas.

b. Outras proteínas atuam como adesinas. As adesinas permitem que a bactéria adira intimamente às chamadas do hospedeiro e outras superfícies, a fim de colonizar essas células e resistir ao enxágue (veja a Figura ( PageIndex {2} )).

c. Muitas bactérias envolvidas na infecção têm a capacidade de cooptar as funções das células hospedeiras para o benefício da própria bactéria. Isso é feito por meio de sistemas de secreção bacteriana que permitem à bactéria injetar moléculas efetoras bacterianas diretamente no citoplasma da célula hospedeira, a fim de alterar sua maquinaria celular ou comunicação celular em benefício da bactéria. Eles fazem isso produzindo sistemas de secreção, como o sistema de secreção tipo 3, que produz tubos ocos em forma de agulha chamados injetisomos. Certas bactérias, por exemplo, injetam invasinas no citoplasma da célula hospedeira que permitem que a bactéria entre nessa célula.

O papel dessas proteínas de superfície da parede celular será discutido em maiores detalhes posteriormente na Unidade 3 sob Patogenicidade bacteriana.

4. O periplasma contém enzimas para decomposição de nutrientes.

Significado dos componentes da parede celular gram-positivos para o início das defesas corporais

O corpo possui dois sistemas imunológicos: o sistema imunológico inato e o sistema imunológico adaptativo.

1. A imunidade inata é um mecanismo de defesa não específico para o antígeno que um hospedeiro usa imediatamente ou dentro de várias horas após a exposição a quase qualquer micróbio. Essa é a imunidade com a qual a pessoa nasce e é a resposta inicial do corpo para eliminar os micróbios e prevenir a infecção.

2. A imunidade adaptativa (adquirida) refere-se a mecanismos de defesa específicos do antígeno que levam vários dias para se tornarem protetores e são projetados para reagir e remover um antígeno específico. Esta é a imunidade que se desenvolve ao longo da vida.

Iniciação da imunidade inata

Para se proteger contra infecções, uma das coisas que o corpo deve fazer inicialmente é detectar a presença de microorganismos. O corpo faz isso reconhecendo moléculas exclusivas de microrganismos que não estão associadas a células humanas. Essas moléculas exclusivas são chamadas de padrões moleculares associados a patógenos ou PAMPs. (Como todos os micróbios, não apenas micróbios patogênicos, possuem PAMPs, os padrões moleculares associados a patógenos são às vezes chamados de padrões moleculares associados a micróbios ou MAMPs.)

Fragmentos de peptidoglicanos e ácidos teicóicos são PAMPS associados à parede celular de bactérias Gram-positivas. Além disso, as bactérias e outros microrganismos também possuem glicanos ricos em manose (cadeias curtas de carboidratos com o açúcar manose ou frutose como açúcar terminal) que funcionam como PAMPs. Esses glicanos ricos em manose são comuns em glicoproteínas e glicolipídeos microbianos, mas raros em humanos (ver Figura ( PageIndex {3} )).

Esses PAMPS se ligam a receptores de reconhecimento de padrões ou PRRs em uma variedade de células de defesa do corpo e desencadeiam defesas imunológicas inatas, como inflamação, febre e fagocitose.

A inflamação é a primeira resposta à infecção e lesão e é crítica para a defesa do corpo. Basicamente, a resposta inflamatória é uma tentativa do corpo de restaurar e manter a homeostase após a lesão. A maioria dos elementos de defesa do corpo está localizada no sangue, e a inflamação é o meio pelo qual as células de defesa e os produtos químicos de defesa do corpo deixam o sangue e entram no tecido ao redor de um local ferido ou infectado.

As células de defesa corporal, como macrófagos e células dendríticas, têm receptores de reconhecimento de padrão, como receptores toll-like em sua superfície que são específicos para os fragmentos de peptidoglicano e ácidos lipoteicoicos na parede celular Gram-positiva e / ou para NODs em seu citoplasma que são específico para fragmentos de peptidoglicano.

A ligação desses componentes da parede celular aos seus receptores de reconhecimento de padrão correspondentes aciona os macrófagos para liberar vários produtos químicos reguladores de defesa chamados citocinas, incluindo IL-1, IL-6, IL-8, TNF-alfa e PAF. As citocinas então se ligam aos receptores de citocinas nas células-alvo, iniciam a inflamação e ativam as vias do complemento e da coagulação (ver Figura ( PageIndex {4} )).

Os ácidos peptidoglicano e teicóico também ativam a via alternativa do complemento e a via da lectina, vias de defesa imune inata que desempenham uma variedade de papéis na defesa do corpo.

A imunidade inata será discutida em mais detalhes na Unidade 5.

Iniciação da imunidade adaptativa

Proteínas e polissacarídeos associados à parede celular Gram-positiva funcionam como antígenos e iniciam a imunidade adaptativa. Um antígeno é definido como uma forma molecular que reage com moléculas de anticorpos e com receptores de antígenos nos linfócitos. Reconhecemos essas formas moleculares como estranhas ou diferentes das formas moleculares de nosso corpo porque elas se encaixam em receptores de antígenos específicos em nossos linfócitos B e linfócitos T, as células que realizam a imunidade adaptativa.

As porções ou fragmentos reais de um antígeno que reagem com anticorpos e com receptores em linfócitos B e linfócitos T são chamados de epítopos. Um epítopo é tipicamente um grupo de 5-15 aminoácidos com uma forma única que constitui uma porção de um antígeno de proteína, ou 3-4 resíduos de açúcar ramificando-se de um antígeno polissacarídeo. Um único microrganismo tem muitas centenas de epítopos de formatos diferentes que nossos linfócitos podem reconhecer como estranhos e contra eles montar uma resposta imune adaptativa.

O corpo reconhece um antígeno como estranho quando epítopos desse antígeno se ligam a linfócitos B e linfócitos T por meio de moléculas receptoras específicas de epítopo tendo uma forma complementar à do epítopo. O receptor de epítopo na superfície de um linfócito B é chamado de receptor de célula B e é, na verdade, uma molécula de anticorpo. O receptor em um linfócito T é chamado de receptor de célula T (TCR).

Existem dois ramos principais das respostas imunes adaptativas: imunidade humoral e imunidade mediada por células.

1. Imunidade humoral: a imunidade humoral envolve a produção de moléculas de anticorpos em resposta a um antígeno e é mediada por linfócitos B. Por meio de uma variedade de mecanismos, esses anticorpos são capazes de remover ou neutralizar microorganismos e suas toxinas após se ligarem a seus epítopos. Por exemplo, os anticorpos feitos contra os antígenos da parede celular podem prender as bactérias aos fagócitos, um processo denominado opsonização. Os anticorpos feitos contra as adesinas da parede celular podem impedir que as bactérias adiram e colonizem as células hospedeiras.

2. Imunidade mediada por células: a imunidade mediada por células envolve a produção de linfócitos T citotóxicos, macrófagos ativados, células NK ativadas e citocinas em resposta a um antígeno e é mediada por linfócitos T. Essas células de defesa ajudam a remover células infectadas e células cancerosas que exibem epítopos estranhos.

A imunidade adaptativa será discutida em mais detalhes na Unidade 6.

Significado dos componentes da parede celular gram-positivos para a patogenicidade bacteriana

Durante infecções sistêmicas graves com grande número de bactérias presentes, no entanto, altos níveis de PAMPs Gram-positivos são liberados resultando na produção excessiva de citocinas pelos macrófagos e outras células e isso, por sua vez, pode prejudicar o corpo (ver Figura ( PageIndex {5} )).

Resumo

  1. Devido à natureza de sua parede celular, as bactérias Gram-positivas coram de roxo após a coloração de Gram.
  2. A parede celular Gram-positiva consiste em muitas camadas interconectadas de peptidoglicano e não possui membrana externa.
  3. O peptidoglicano evita a lise osmótica no ambiente hipotônico em que vive a maioria das bactérias.
  4. Os ácidos teicóico e lipoteicóico estão entrelaçados nas camadas de peptidoglicano.
  5. As proteínas de superfície embutidas na parede celular podem funcionar como adesinas, sistemas de secreção e enzimas.
  6. A parede celular Gram-positiva ativa as defesas imunológicas inatas do corpo e suas defesas imunológicas adaptativas.
  7. O corpo ativa a imunidade inata ao reconhecer moléculas exclusivas de microrganismos que não estão associadas a células humanas, chamadas de padrões moleculares associados a patógenos ou PAMPs. Os PAMPs ligam-se aos receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) nas células de defesa para desencadear a produção de citocinas inflamatórias.
  8. A inflamação é o meio pelo qual o corpo entrega células e moléculas de defesa a um local de infecção; no entanto, a inflamação excessiva pode ser prejudicial e até mortal para o corpo.
  9. Os PAMPs associados à parede celular Gram-positiva incluem monômeros de peptidoglicano, ácidos teicóicos, ácidos lipoteicóicos e cadeias de açúcar ricas em manose.
  10. Um antígeno é uma forma molecular que reage com os receptores de antígeno nos linfócitos para iniciar uma resposta imune adaptativa.
  11. As moléculas da parede celular também podem desencadear imunidade adaptativa, como a produção de moléculas de anticorpos contra antígenos da parede celular bacteriana.

Perguntas

Estude o material desta seção e, a seguir, escreva as respostas a essas perguntas. Não basta clicar nas respostas e escrevê-las. Isso não testará sua compreensão deste tutorial.

  1. Indique a cor que as bactérias Gram-positivas aparecem após o procedimento de coloração de Gram. (ans)
  2. Descreva a estrutura e a aparência de uma parede celular Gram-positiva. (ans)
  3. Declare a função benéfica para a bactéria dos seguintes componentes da parede celular gram-positiva:
    1. peptidoglicano (ans)
    2. ácidos teicóicos (ans)
    3. adesinas (ans)
    4. invasinas (ans)
  4. Descreva resumidamente como os PAMPs da parede celular Gram-positiva podem promover a inflamação. (ans)
  5. Defina antígeno. (ans)

Gram-positivo vs. Gram-negativo

‘Gram-positivo’ e ‘Gram-negativo’ são termos usados ​​para categorizar de forma ampla dois tipos diferentes de bactérias. Essa distinção é feita com base na estrutura de suas paredes celulares e na reação à coloração de Gram.

As bactérias Gram-positivas têm paredes celulares feitas de uma espessa camada de peptidoglicano. As paredes celulares das bactérias gram-negativas contêm apenas uma fina camada de peptidoglicano, mas também têm uma membrana externa ausente nas bactérias gram-positivas.

A coloração de Gram é uma técnica que usa corante violeta para distinguir entre bactérias gram-positivas e gram-negativas. Se as bactérias forem Gram-positivas, a camada espessa de peptidoglicano em suas paredes celulares reterá o corante e eles ficarão manchados de violeta. Se a bactéria for Gram-negativa, o corante vazará da fina camada de peptidoglicano e a bactéria ficará vermelha.


Diferença entre a parede celular de bactérias Gram positivas e Gram negativas

A maioria das células bacterianas é cercada por uma parede celular espessa e rígida. A parede celular dá forma à célula e protege as bactérias de mudanças na pressão osmótica. Peptidoglicano (mureína) é o principal componente da parede celular bacteriana e é responsável pela forma e pela natureza extremamente resistente da parede celular.

Com base nas características da parede celular, as células bacterianas são classificadas em Gram positivo e Gram negativo, principalmente com base na reação de coloração clássica chamada coloração de Gram. No post anterior, discutimos sobre o Semelhanças e diferenças entre bactérias Gram positivas e Gram negativas. Tanto as bactérias Gram positivas quanto as Gram negativas possuem parede celular, porém sua organização estrutural, propriedades químicas e físicas variam. Em geral, a parede celular das bactérias Gram positivas tem estruturas químicas mais simples em comparação com as bactérias Gram negativas.

O presente post discute as diferenças entre a parede celular de bactérias Gram positivas e Gram negativas com uma tabela de comparação.

Comparação da parede celular de bactérias Gram positivas e Gram negativas
Diferença entre a parede celular de bactérias Gram positivas e Gram negativas


Paredes celulares Gram-positivas:

As paredes celulares das bactérias gram-positivas são compostas principalmente por peptidoglicano. Na verdade, o peptidoglicano pode transportar até 90% da parede celular, com camada após camada se construindo ao redor da membrana celular. Os tetrapeptídeos NAM são geralmente reticulados com uma ponte intermediária de peptídeo, e a reticulação completa é comum. Tudo isso se combina e cria uma parede celular incrivelmente forte.

Crédito da imagem: www.open.oregnostate.education

O componente adicional em uma parede celular gram-positiva é ácido teicóico, um glicopolímero de glicerol ou ribitol unidos por grupos fosfato, que são incorporados às camadas de peptidoglicano. Os ácidos teicóicos podem ser covalentemente conectados ao peptidoglicano (ácidos teicóicos de parede ou WTA) ou ligados à membrana celular por meio de uma âncora lipídica, caso em que é mencionado como ácido lipoteicóico. Acredita-se que o ácido teicóico desempenhe vários papéis importantes para a célula, como a geração de carga de internet da célula, que é importante para o desenvolvimento de uma força motriz de prótons. O ácido teicóico contribui para a rigidez geral da membrana celular, que é vital para a manutenção da forma celular, particularmente em organismos em forma de bastonete. Também há evidências de que os ácidos teicóicos participam da divisão celular interagindo com a maquinaria de biossíntese do peptidoglicano. Por último, os ácidos teicóicos parecem desempenhar uma função na resistência a condições adversas, como altas temperaturas e altas concentrações de sal, também em antibióticos β-lactâmicos. Além disso, alguns ácidos teicóicos podem estar envolvidos na ligação de espécies patogênicas aos tecidos do hospedeiro, iniciando assim o processo de doença infecciosa.

O espaço periplasmático fica entre a membrana plasmática e a parede celular e é tão estreito que muitas vezes não é visível. O periplasma tem relativamente poucas proteínas porque o sáculo do peptidoglicano é poroso e muitas proteínas translocadas através da membrana plasmática passam através do sáculo. Algumas proteínas secretadas são enzimas chamadas exoenzimas. Essas enzimas extracelulares são formadas dentro do citoplasma da célula e, em seguida, secretadas além da membrana celular, através da parede celular, onde funcionam fora da célula para quebrar grandes macromoléculas em componentes menores.

Além disso, para os polímeros embutidos no sacculus do peptidoglicano, muitas vezes existem proteínas relacionadas à sua superfície. Essas proteínas estão envolvidas nas interações da célula com seu ambiente. Alguns são não covalentemente seguros para ácidos teicóicos ou outros polímeros da parede celular. Outras proteínas de superfície estão covalentemente ligadas ao peptidoglicano. Enzimas ligadas à membrana chamadas sortases catalisam a formação das ligações covalentes que adicionam essas proteínas ao peptidoglicano. Muitas proteínas ligadas covalentemente têm papéis na virulência. Por exemplo, a proteína M de estreptococos patogênicos auxilia na adesão aos tecidos do hospedeiro e interfere nas defesas do hospedeiro.


Parede celular bacteriana: uma visão geral

A membrana celular da célula procariótica por si só não é suficiente para fornecer a rigidez que um organismo de vida livre requer. Nas bactérias Gram-positivas, a forma e a integridade da célula são mantidas por uma única camada espessa de peptidoglicano. No entanto, a parede celular Gram-negativa evoluiu para um nível maior de complexidade, com uma segunda membrana fora da membrana celular para formar um periplasma, no qual uma camada de peptidoglicano quimicamente semelhante, porém mais fina, aparece. A membrana externa é composta principalmente de lipopolissacarídeo (LPS). Ambas as paredes celulares Gram-negativas e Gram-positivas têm muitas proteínas embutidas nelas, penetrando ou aderidas às suas superfícies. Alguns deles servem na detecção de sinais ambientais.

Substratos de crescimento, metabólitos e proteínas secretadas também podem passar através da camada externa espessa por meio de portas de proteína específicas. As principais diferenças entre as paredes das células bacterianas Gram-positivas e Gram-negativas são mostradas na Tabela

▶ Peptidoglicano

Peptidoglicano ou mureína é composto por dois derivados de açúcar, Nacetilglucosamina (NAG) e Nacetilmurâmico ácido (NAM) com uma ligação β (1–4). Cadeias de NAM e NAG alternadas são reticuladas por aminoácidos, como l-alanina e ácido d-glutâmico, bem como ácido diaminopimélico (DAP). A forma como as ligações cruzadas são formadas difere nas bactérias Gram negativas e Gram-positivas. Na maioria das bactérias Gram-negativas, há uma ligação direta interbridge entre cadeias laterais de polipeptídeo emergindo de polímeros NAG / NAM adjacentes, enquanto na maioria das bactérias Gram-positivas a interligação que liga as cadeias laterais é um pentapeptídeo de glicina. A estrutura do peptidoglicano é altamente conservada entre as bactérias como um todo, sendo as únicas variações ligeiras alterações na interligação. O peptidoglicano é resistente a muitos desafios químicos, mas é facilmente decomposto por lisozima, que quebra os laços entre NAG e NAM. Sem o polímero de restrição, o potencial osmótico é muito grande para a membrana celular conter e a célula se rompe. A lisozima está presente em muitas secreções do corpo humano como a primeira forma de defesa contra a invasão bacteriana. As células sem peptidoglicano (particularmente Mycoplasma) evitam esta lise.

As bactérias Gram-positivas têm substâncias chamadas teicóico e ácidos teicurônicos intercalado com o polímero de peptidoglicano. ‘Teichoic’ é um termo amplo que cobre polímeros contendo glicerofosfato ou ribitol fosfato e a função primária desses compostos parece ser ligar cátions divalentes essenciais, como Mg 2+, mantendo o ambiente iônico local da célula. O efeito bruto da presença de ácidos teicóicos na membrana é dar à célula uma carga ligeiramente negativa.

É extremamente difícil generalizar na estrutura da parede celular de Archaeal, pois a diversidade é muito maior do que a das bactérias. Embora nosso conhecimento da parede celular das arquéias não seja tão desenvolvido quanto o das bactérias, sabemos que algumas arquéias possuem um composto muito semelhante à mureína, denominado pseudopeptidoglicano. Este tem um esqueleto contendo NAG, mas NAM alternado é substituído por ácido N-acetiltalosaminurônico e é β (1-3) ligado em vez de β (1-4). No entanto, muitos Archaea mantêm a rigidez com o uso de uma mistura de polissacarídeo, proteína e glicoproteína.

▶ A coloração de Gram

O principal método de distinção entre os dois grupos principais de bactérias continua a ser a coloração de Gram. Gram-positivos e Gram-negativos são usados ​​na identificação, classificação e taxonomia imediatamente após o estudo morfológico. Este importante método baseia-se na capacidade da parede celular de reter ou perder certos produtos químicos. O procedimento de coloração foi desenvolvido em 1884 por Christian Gram. Desde então, provou ter primeiro um significado bioquímico e depois filogenético nas bactérias. As células são primeiro fixadas a uma lâmina de microscópio de vidro (normalmente por aquecimento suave sobre uma chama de Bunsen) e violeta de cristal é usado para manchar a preparação. A fim de complexar o cristal violeta com a parede celular, uma solução de iodo é então adicionado. Se a lâmina agora for lavada com álcool, a mancha violeta de cristal será removida das células Gram-negativas de parede fina, mas não poderá passar pela parede Gram-positiva mais espessa.

Uma contracoloração de carbol fucsina em seguida, cora todas as células Gram-negativas com um rosa claro, enquanto as células Gram-positivas retêm sua cor violeta profunda. Essas diferenças de cor podem ser vistas claramente em um microscópio de luz. A maioria das bactérias reage fielmente à sua filogenia com essa coloração, com apenas algumas espécies, como Paracoccus, se comportando de maneira anormal. Algumas tentativas foram feitas para classificar as Archaea com a coloração de Gram, mas infelizmente neste reino a variabilidade na coloração começa no nível do subgênero.

▶ A membrana externa Gram-negativa

Em contraste com as bactérias Gram-positivas, o modelo Bacterium E. coli não apresenta uma capa de peptidoglicano para o mundo exterior. Em vez disso, a mureína é suspensa no espaço periplasmático e há uma segunda membrana externa de LPS. A membrana externa Gram-negativa tem algumas características em comum com a membrana citoplasmática por ser uma bicamada lipídica e é considerada um mosaico fluido. No entanto, em vez de serem compostos apenas de fosfolipídios, existem muitos lipídios com polissacarídeos anexados. Isso altera as propriedades químicas e físicas da membrana, por ser muito mais porosa a moléculas muito maiores. Esta porosidade é aumentada pela presença de muitos Porin e proteínas de transporte.

A estrutura da membrana externa de bactérias Gram-negativas foi impulsionada pelas propriedades antigênicas de LPS, então os detalhes que pretendem representar Gram-negativos são na realidade mais relevantes para bactérias entéricas patogênicas, como E. coli, Salmonella e assim por diante. A presença de LPS pode provocar uma forte resposta imune em mamíferos, portanto, em gêneros como Escherichia, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Neisseria e Haemophilus, o termo LPS tornou-se intercambiável com ‘endotoxina. 'A química desta membrana externa LPS é complexa e variável entre as espécies. Na Salmonella, a parte lipídica da molécula (lipídio A) é a glucosamina fosforilada ligada a longas cadeias de carbono que, em contraste com os lipídios da membrana, podem ser ramificadas. O lipídeo A de bactérias Gram-negativas está covalentemente ligado ao polissacarídeo central mas mesmo se separado do resto da molécula, é freqüentemente tóxico para os mamíferos, mesmo se a bactéria de origem não for patogênica. O lipídio A serve para ancorar o LPS ao resto da membrana externa.

O polissacarídeo central (ou antígeno R ou polissacarídeo R) é o mesmo em todos os membros de um gênero particular e é composto de açúcares heptose e hexose mais cetodesoxioctonato (KDO). Finalmente, o Antígeno O (ou antígeno somático ou polissacarídeo O) é composto de três a cinco açúcares repetidos. A composição da repetição varia de espécie para espécie e pode ser repetida de 1 a 40 vezes. Este é o principal determinante antigênico das células patogênicas.


Parede celular Gram negativa:

As bactérias Gram-negativas têm uma camada mais fina de peptidoglicano (10% da parede celular) e perdem o complexo cristal violeta-iodo durante a descoloração com o enxágue com álcool, mas retêm a contra-coloração Safranina, ficando avermelhada ou rosada. Eles também têm uma membrana externa adicional que contém lipídios, que é separada da parede celular por meio do espaço periplasmático.

Relevância Médica da Parede Celular Gram Negativa:

A parede celular das bactérias Gram-negativas costuma ser um fator de virulência que permite que as bactérias patogênicas causem doenças. A virulência das bactérias Gram-negativas está freqüentemente associada a certos componentes da parede celular, em particular, o lipopolissacarídeo (também conhecido como LPS ou endotoxina). Em humanos, o LPS induz uma resposta imune inata caracterizada pela produção de citocinas e ativação do sistema imune. A inflamação ocorre como resultado da produção de citocinas, que também pode produzir toxicidade no hospedeiro.


Composição da parede celular de bactérias gram positivas e gram negativas

A parede celular forma uma camada bastante rígida fora da membrana plasmática na maioria dos procariotos. A parede celular é responsável por 10 a 40% da massa seca celular, dependendo das condições de crescimento. Ele fornece o suporte da célula e proteção contra estresse mecânico ou danos causados ​​por osmótico ruptura e lise. O principal componente da parede celular bacteriana é o peptidoglicano ou mureína. Estrutura rígida do peplidoglicano, específica apenas para procariotos. dá forma à célula e envolve a membrana citoplasmática.

Estrutura geral da parede celular

1]. O exame microscópico de luz de bactérias não permite a observação de diferenças entre as paredes celulares de bactérias gram-positivas e gram-negativas. Isso só é possível quando as paredes das células são examinadas ao microscópio eletrônico de transmissão.

2]. A parede de bactéria gram - positiva consiste em uma única camada homogênea de peptidoglicano para mureína). que permanecem fora da membrana plasmática. Tem uma espessura de 20 a 80 nm.

3]. A parede celular de bactérias gram - negativas consiste em uma camada de membrana externa (7 a 8 nm de espessura) e uma camada de peptidoglicano (2 a 7 nm de espessura)

4]. Um espaço é observado entre a membrana plasmática e a membrana externa da parede celular. É chamado periplasma. O periplasma de bactérias gram-negativas contém enzimas de hidrólise. Eles facilitam o movimento das moléculas através da membrana.

5]. A parede celular da bactéria gram - positiva contém peptidoglicano e ácido telcólico como os principais constituintes, enquanto a das bactérias gram - negativas possui peptidoglicano. lipopolissacarídeo, lipoproteínas e fosfolipídeos.

1]. Peptidoglicano (também chamado mureína ) é o constituinte mais importante da parede celular procariótica. É relativamente poroso, elástico e um tanto elástico. É um polímero semelhante a uma malha complexa de subunidades repetidas. A variação ocorre de espécie para espécie em sua composição química e estrutura. No entanto, a estrutura básica é a mesma em todos

2]. Peptidoglicano. um heteropolissacarídeo, consiste em unidades de dissacarídeo repetidas, às quais uma curta cadeia de peptídeo se liga e forma uma malha complexa (rede). A parte do dissacarídeo é formada por dois amino açúcares acetilados, N - acetil glicose amina (NAC) e Ácido N - acetil murâmico (NAM, o éter lactílico da N - acetil glicose amina), que são unidos alternadamente por uma ligação glicosídica b-1, 4.

3]. NAG e NAM se unem linearmente para formar uma linha de 10 - 65 açúcares e forma o carboidrato espinha dorsal. Um curto peptídeo tetrapeptídeo - uma cadeia de quatro aminoácidos. consistindo de L - alanina, ácido D - glutâmico, ácido diaminoplmélico (DAP) ou L - lisina e D - alanina, anexa-se ao resíduo NAM da estrutura. O péptido Tetra contém um padrão alternado de aminoácidos D e L.

4]. Em bactérias gram-positivas, esses tetrapeptídeos são unidos por ligações cruzadas para formar um forte. malha como polímero. Normalmente, o grupo carboxil (-COOH) da D-alanina terminal se junta diretamente com DAP ou L lisina de outro tetreptídeo por um inter-ponte penta peptídeo. A maioria das bactérias gram-negativas não possui uma ponte peptídica. A interligação de peptídeos nem sempre existe entre todos os tetra peptídeos.

Componentes das paredes celulares gram-positivas

1]. As paredes celulares das bactérias gram-positivas são espessas e compostas por várias camadas de peptidoglicano (até 40). Além disso, eles possuem uma grande quantidade de outra macromolécula chamada ácido teicóico.

2]. Os ácidos teicóicos são polímeros de glicerol ou ribitol unidos por grupos fosfato. Aminoácidos como a D-alanina ou açúcares como a glicose são anexados aos grupos glicerol ou ribltol. Os ácidos teicóicos podem ser covalentemente ligados com peptidoglicano na parede ou lipídios na membrana plasmática. Eles são chamados respectivamente de parede ácido teicóico ou Ácido lipoteicóico.

3]. Os ácidos teicóicos têm carga negativa. assim, eles contribuem para a carga negativa da superfície da célula. Eles podem estar envolvidos em:
uma). Regulamento de entrada ou saída de
moléculas
b). Prevenção de lise celular
c). Antigenicidade
d). Anexo de
bacteriófagos

Componentes das paredes das células bacterianas gram-negativas

As paredes celulares das bactérias gram-negativas são relativamente mais complexas. Possui uma fina camada de peptidoglicálico, envolta por uma membrana externa, constituída de lipopolissacarídeo.

A membrana externa consiste em lipopolissacarídeos (LPS). É composto por lipídeo A, polissacarídeo central e cadeia lateral O. A membrana externa está ligada à camada interna de peptidoglicano por uma lipoproteína única, chamada lipoproteína de Braun.

uma). Lipid A não é um lípido de glicerol. Consiste em dois derivados de açúcar glucosamina, cada um ligado a três ácidos graxos e fosfatos ou pirofosfatos. Os ácidos graxos de cadeia longa, que podem ser ácido capróico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico ou ácido esteárico, unem-se aos fosfatos de glucosamina (GKN) por meio de esteramina ligação. Os dissacarídeos ligam-se ao polissacarídeo central e os ácidos graxos à membrana externa.

b). Polissacarídeo central consiste em uma unidade de oligossacarídeo ligada aos resíduos de glucosamina do lipídeo A. Consiste em ceto-desoxioctonato (KDO), açúcares de sete carbonos (heptose). glicose, galactose e N-acetil glucosamina.

c). O-polissacarídeo, também chamado Corrente do lado O ou Antígeno O, se estende do núcleo. Ele contém vários açúcares peculiares, por exemplo, galactose (Gal), glicose (Gui), ramnose (Rha) e manose (Man) Eles são conectados em sequências de quatro ou cinco membros, que geralmente são ramificadas. A repetição de sequências de açúcar forma um O-polissacarídeo longo.

LPS contém proteínas porinas. Tem a forma de um tubo. It permits the passage of molecules smaller than 600 to 700 Daltons.

Inner Membrane

1]. Inner membrane of gram - negative bacteria consists of a thin layer of peptidoglycan . The peptidoglycan layer is non - covalently anchored to lipoprotein molecules called Braun's lipoproteins through their hydrophobic head .

2]. Sandwiched between the outer membrane and the plasma membrane , a concentrated gel - like matrix ( the periplasm ) is found in the periplasmic space . This periplasmic space contains binding proteins for transport of nutrients in to the cell . The periplasm space can act as reservoir for virulence factors and a dynamic flux of macromolecules representing the cell's metabolic status and its response to environmental factors .


Identification of Two Phosphate Starvation-induced Wall Teichoic Acid Hydrolases Provides First Insights into the Degradative Pathway of a Key Bacterial Cell Wall Component

The cell wall of most Gram-positive bacteria contains equal amounts of peptidoglycan and the phosphate-rich glycopolymer wall teichoic acid (WTA). During phosphate-limited growth of the Gram-positive model organism Bacillus subtilis 168, WTA is lost from the cell wall in a response mediated by the PhoPR two-component system, which regulates genes involved in phosphate conservation and acquisition. It has been thought that WTA provides a phosphate source to sustain growth during starvation conditions however, WTA degradative pathways have not been described for this or any condition of bacterial growth. Here, we uncover roles for the Bacillus subtilis PhoP regulon genes glpQ and phoD as encoding secreted phosphodiesterases that function in WTA metabolism during phosphate starvation. Unlike the parent 168 strain, ΔglpQ or ΔphoD mutants retained WTA and ceased growth upon phosphate limitation. Characterization of GlpQ and PhoD enzymatic activities, in addition to X-ray crystal structures of GlpQ, revealed distinct mechanisms of WTA depolymerization for the two enzymes GlpQ catalyzes exolytic cleavage of individual monomer units, and PhoD catalyzes endo-hydrolysis at nonspecific sites throughout the polymer. The combination of these activities appears requisite for the utilization of WTA as a phosphate reserve. Phenotypic characterization of the ΔglpQ and ΔphoD mutants revealed altered cell morphologies and effects on autolytic activity and antibiotic susceptibilities that, unexpectedly, also occurred in phosphate-replete conditions. Our findings offer novel insight into the B. subtilis phosphate starvation response and implicate WTA hydrolase activity as a determinant of functional properties of the Gram-positive cell envelope.

Palavras-chave: Bacillus enzyme kinetics enzyme mechanism glpQ gram-positive bacteria hydrolase phoD phosphate starvation wall teichoic acid.

© 2016 by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.


2.3A: The Gram-Positive Cell Wall - Biology

After reading this section, students will.

  1. Be able to describe the function and location of the periplasm.
  2. Be able to describe the function of the cell wall and the two common cell wall structures.

The periplasm is between the cytoplasmic and outer membranes in Gram-negative bacteria

The periplasm is found in Gram-negative bacteria and is the space in between the cytoplasmic and outer membranes. (Some feel a periplasm-like compartment is also present in Gram-positive bacteria in between the cytoplasmic membrane and the peptidoglycan.) The periplasm is filled with water and proteins and is therefore somewhat reminiscent of the cytoplasm. However, pools of small molecules in the periplasm are not like those in the cytoplasm because the membrane prevents the free exchange between these two compartments. Also, the proteins found in the periplasm are distinct from those in the cytoplasm and are specifically guided to this site during translation through specific signal sequences typically near their N-termini. Table 3.2 lists some examples of these proteins.

The peptidoglycan shell that provides the strength to prokaryotic membranes is also found in the periplasmic space of Gram-negative bacteria, while in Gram-positive bacteria it provides the outside border to the periplasm.

Table 3.2 Different types of periplasmic enzymes and their role in the cell

Enzyme Type Exemplos Função
Hydrolytic enzymes phophatases Degrading phosphate-containing compounds.
proteases Degrading proteins and peptides.
endonucleases Degrading nucleic acids.
Binding proteins sugars, amino acids, norganic ions, vitamins Binding substrates and docking with transport protein in membrane.
Quimiorreceptores Chemotaxis, ermination Sensing the environment and changing cell behavior in response.
Detoxifying enzymes &beta-lactamase Degrading penicillin and related compounds before they get into the cell.

Periplasmic enzymes have several main functions, detecting nutrients in the environment, degradation of polymers, and protection from harmful compounds.

The cell wall surrounds and holds in the microbe

This section will restrict itself to the bacterial cell wall, but at the end of the chapter we will compare this to archaeal cell walls. The cell wall is essential to the survival of most microorganisms. Many microbes live in environments that are relatively dilute and the wall's most important function is to prevent the cell from bursting due to osmotic stress. The cell wall also determines the shape of the cell. Any cell that has lost its cell wall, either artificially or naturally, becomes roughly spherical and lyses due to osmotic pressure, unless placed in certain concentrated solutions. Finally, the cell wall helps to support any structure that penetrates from the cell out into the environment.

Figure 3.19. A gram-positive bacterium. Gram stain of the gram-positive bacterium Bacillus cereus

The structure and synthesis of prokaryotic cell walls is unique and many compounds found in the bacterial cell wall are found nowhere else in nature. It is true that plants also make cell walls, but they are chemically and structurally different. There are two basic types of bacterial cell wall structures that have been studied in detail: Gram-positive and Gram-negative. These two classes of bacterial cells look very different following staining with the Gram stain and this has been a standard test for for identification of bacterial species. Figures 2-19 and 2-20 show Gram stains of Gram-positive and Gram-negative bacteria, respectively.

Figure 3.20. A gram-negative bacterium. A Gram stain of the gram-negative bacterium Serratia marcescens

When the Gram stain was developed by Hans Christian Gram in 1884 the molecular basis of the stain was unknown. In fact very little was understood about bacteria in general. He just determined empirically that when bacterial smears were run through a four-step staining procedure using two different dyes, some cells retained the first dye and stained purple, while other only retained the second dye and stained pink. Years later it was discovered that the basis for this differential reaction relates to the cell wall as shown in Figure 3.21.

Figure 3.21. A comparison of the ultrastructure of gram-positive and gram-negative cells. The different Gram reactions occur because of structural differences between the bacterial cell walls. Gram-positive cells (Group B streptococci) appear smooth in a scanning electron micrograph (A) and are composed of a single layer of peptidoglycan (B). Gram-negative cells (E. coli) have an undulating surface and have three layers (C and D). (Sources: S. H. Pincus, et al.1992. J. Bacteriol 174:3739-3749 [panels A and B] M. E. Bayer and C. C. Remsen. 1970. J. Bacteriol. 101:304-313 [panel C] T. J. Beveridge. 1999. J. Bacteriol. 181:4725-4733 [panel D])

As shown in Figure 3.21, the Gram-negative cell has an additional layer and the outside of the cell appears convoluted when compared to the Gram-positive cell. The Gram-positive wall is much thicker than is the Gram-negative wall and its external appearance is smoother. Gram-positive and Gram-negative cells do share one thing in common that is unique to bacteria - peptidoglycan. We will talk about the structure of this and then move on to examine the various structures found in each cell wall type.

Peptidoglycan is a thick rigid layer composed of an overlapping lattice of two sugars, N-acetyl glucosamine (NAG) and N-acetyl muramic acid (NAM), that are cross-linked by amino acid bridges as shown in Figure 3.22. The exact molecular makeup of these cross-bridges is species-specific. NAM is only found in the cell walls of bacteria and nowhere else. Attached to NAM is a side chain generally composed of four amino acids. In the best-studied bacterial cell walls (E. coli) the cross-bridge is most commonly composed of L-alanine, D-alanine, D-glutamic acid and diaminopimelic acid (DPA).

Figure 3.22. The chemical structure of peptidoglycan. The generalized peptidoglycan monomer showing the two sugars that make up the backbone. The R group consists of four amino acids, with the best-studied cell walls containing L-alanine, D-alanine, D-glutamic acid and diaminopimelic acid.

Note that peptidoglycan contains D-amino acids, which are different than the L-amino acids found in proteins. D-amino acids have the identical composition as L-amino acids, but are their mirror images. The use of D-amino acids is unusual in biology and bacteria have enzymes called racemases to convert between D and L forms specifically for this use.

The NAM, NAG and amino acid side chain form a single peptidoglycan unit that can link with other units via covalent bonds to form a repeating polymer. The polymer is further strengthened by covalent bonds between cross-bridges and the degree of cross-linking determines the degree of rigidity. Figure 3.23 shows an artist's rendering of what the structure might look like. No E. coli, the penultimate D-alanine of one unit is linked to DPA of the next cross-bridge. In some Gram-positive microbes there is a peptide composed of various amino acids that serves as a link between the cross-bridges. For example, in Staphylococcus aureus strains, five glycines make up the linker between peptidoglycan monomers. The sequence of these linkers varies considerably between species. The completed peptidoglycan layer forms a strong mesh that can be thought of as a chain link fence. The complete cell wall contains one or more layers of peptidoglycan one atop the other, providing much of the strength of the cell wall.

Figure 3.23. A cartoon of the peptiodglycan mesh. The peptidoglycan polymers then crosslink with other peptidoglycan chains to form a complex mesh that wraps the cell in a structure a kin to chicken wire.

While both Gram-negative and Gram-positive bacteria have peptidoglycan, its physical arrangement in the cell wall is different. In Gram-positive cells the peptidoglycan is a heavily cross-linked woven structure that encircles the cell in many layers. It is very thick with peptidoglycan accounting for 50% of weight of cell and 90% of the weight of the cell wall. Electron micrographs show the peptidoglycan to be 20-80 nm thick. In Gram-negative bacteria the peptidoglycan is much thinner with only 15-20% of the cell wall being peptidoglycan. In both cases, peptidoglycan is not a barrier to solutes, as the openings in the mesh are large enough for most molecules including proteins to pass through. Figure 3.24 shows a depiction of the Gram-positive cell wall.

Figure 3.24. The Gram-positive cell wall. The cell wall is made mostly of peptidoglycan, interspersed with teichoic acid which knits the different layers together. The amount of crosslinking is higher and the wall is thicker than in gram-negative cell walls.

The Gram-positive cell wall

Gram-positive cells consist almost entirely peptidoglycan, but an important structure found in Gram-positive cell walls is teichoic acid. It is a phosphodiester polymer of glycerol or ribitol joined by phosphate groups. Amino acids such as D-alanine are attached. Teichoic acid is covalently linked to muramic acid and stitches various layers of the peptidoglycan mesh together. Teichoic acid stabilizes the cell wall and makes it stronger. The chemical formula of teichoic acid is shown in Figure 3.25

Figure 3.25. Teichoic acid. Teichoic acid is a long, thin molecule that weaves through the peptidoglycan.

Gram-negative cell structure

Gram-negative cell walls have a more complicated structure than do those of Gram-positive organisms. Outside the cytoplasmic membrane is the periplasm, which contains the thin layer of peptidoglycan. The peptidoglycan in Gram-negative cells contains less cross-linking than in Gram-positive cells with no peptide linker. Covalently bound to the peptidoglycan is Braun's lipoprotein, which has a hydrophobic anchor that helps to strongly bind the peptidoglycan to the outer membrane. Figure 3.26 shows the arrangement of the Gram-negative cell wall.

Figure 3.26. The Gram-negative cell wall. The cell wall in Gram-negative bacteria contains much less peptidoglycan and is surrounded by an outer membrane. There is much less crosslinking between the peptidoglycan. LPS is also present in the outer membrane and penetrates into the surrounding environment.

The outer membrane of Gram-negative bacteria is another lipid bilayer similar to the cytoplasmic membrane, and contains lipids, proteins, and also lipopolysaccharides(LPS). It is a barrier to proteins and prevents enzymes secreted into the periplasm from floating away. The membrane has distinctive sides, with the side that faces the outside containing all the LPS. LPS is composed of two parts: Lipid A and the polysaccharide chain that reaches out into the environment. Lipid A is a derivative of two NAG units with up to 7 hydrophobic fatty acids connected to it that anchor the LPS in the membrane as shown in Figure 3.27. Attached to Lipid A is a conserved core polysaccharide that contains KDO, heptose, glucose and glucosamine sugars. The rest of the polysaccharide consists of repeating sugar units and this is called the O-antigen. The O-antigen varies among bacterial species and even among various isolates of the same species. Many bacterial pathogens vary the make-up of the O-antigen in an effort to avoid recognition by the host's immune system.

Figure 3.27. The structure of LPS. LPS is composed of three sections: the lipid A region, a conserved core polysaccharide, and a highly variable O-polysaccharide. (A) The chemical structure of LPS. (B) A molecular model of the outer membrane from Pseudomonas aeruginosa. Source (T. P. Straatsma, Pacific Northwest National Laboratory)

LPS confers a negative charge and also repels hydrophobic compounds including certain drugs and disinfectants that would otherwise kill the cell. Some Gram-negative species live in the gut of mammals and LPS repels fat-solubilizing molecules such as bile that the gal bladder secretes. This repulsion enables these bacteria to survive in this environment. The O-antigen and other molecules on the outer membrane are also used by certain viruses that infect bacteria, as a means to identify the correct hosts for infection.

LPS is medically important because when LPS is released from bacterial cells it is toxic to mammals and is therefore called endotoxin. It creates a wide spectrum of physiological reactions including the induction of a fever (endotoxins are said to be pyrogenic), changes in white blood cell counts, leakage from blood vessels, tumor necrosis and lowered blood pressure leading to vascular collapse and eventually shock. At high enough concentrations the LPS endotoxin is lethal.

There are fewer total proteins and fewer unique types of proteins in the outer membrane than in the cytoplasmic membrane. Porins are particularly important components because of their role in the permeability of the outer membrane to small molecules. Porins are proteins that form pores in the outer membrane large enough to allow passage of most small hydrophilic molecules. Figure 3.28 shows the structure of a porin at the molecular scale. All known porins have a similar structure, with the protein containing a central channel that allows the passage of molecules. This allows migration of these molecules into the periplasmic space for possible transport across the cytoplasmic membrane. Some porins in the outer membrane are general, doing simple discrimination on size and charge, but having little substrate specificity. Examples include OmpF that is selective for positively charged molecules and PhoE that is permeable to negatively charged molecules. Other porins are more specific. The best studied is LamB, which recognizes the sugar polymer maltooligosaccharide and transports it through the outer membrane. Very large or hydrophobic molecules cannot penetrate the outer membrane, so the outer membrane serves as a permeability barrier to at least some molecules.

Figure 3.28. The molecular structure of a porin. The view in (A) is from the outside of the cell looking at the membrane surface. The view in (B) is the perspective from the side (i.e. from the membrane). The porin has three protein subunits and the actual pore is the central triangular area in the top panel formed by the three subunits.

There are also other types of outer membrane proteins that are involved in various functions. OmpA in E. coli seems to connect the outer membrane to the peptidoglycan. Some pathogens contain outer membrane proteins that help them neutralize host defenses. Finally all Gram-negative bacteria contain high molecular weight proteins involved in the uptake of large substrates such as iron-complexes and vitamin B12.

The differences between the cell walls of Gram-positive and Gram-negative bacteria greatly influence the success of the microbes in their environments. The thick cell wall of Gram-positive cells allows them to do better in dry conditions because it reduces water loss. The outer membrane and its LPS helps Gram-negative cells excel in the intestines and other host environments. Table 3.3 summarizes the difference between Gram-negative and Gram-positive cell walls.

Table 3.3 Properties of cell walls

Propriedade Gram-positivo Gram-negative
Thickness of wall 20-80 nm 10 nm
Number of layers in wall 1 2
Peptidoglycan content >50% 10-20%
Teichoic acid in wall + -
Lipid and lipoprotein content 0-3% 58%
Protein content 0% 9%
Lipopolysaccharide 0 13%
Sensitive to penicillin sim Menos sensível
Digested by lysozyme sim Weakly

A summary of the differences between Gram-positive and Gram-negative cell walls.

Some bacteria lack cell walls

For most bacterial cells, the cell wall is critical to cell survival, yet there are some bacteria that do not have cell walls. Mycoplasma species are widespread examples and some can be intracellular pathogens that grow inside their hosts. Cell walls are unnecessary here because the cells only live in the controlled osmotic environment of other cells. It is likely they had the ability to form a cell wall at some point in the past, but as their lifestyle became one of existence inside other cells, they lost the ability to form walls. Consistent with this very limited lifestyle within other cells, these microbes also have very small genomes. They have no need for the genes for all sorts of biosynthetic enzymes, as they can steal the final components of these pathways from the host. Similarly, they have no need for genes encoding many different pathways for various carbon, nitrogen and energy sources, since their intracellular environment is completely predictable. Because of the absence of cell walls, Mycoplasma have a spherical shape and are quickly killed if placed in an environment with very high or very low salt concentrations. Contudo, Mycoplasma do have unusually tough membranes that are more resistant to rupture than other bacteria since this cellular membrane has to contend with the host cell factors. The presence of sterols in the membrane contributes to their durability by helping to increase the forces that hold the membrane together.


How Does Gram Staining Work?

Gram staining involves three processes: staining with a water-soluble dye called crystal violet, decolorization, and counterstaining, usually with safanin. Due to differences in the thickness of a peptidoglycan layer in the cell membrane between Gram positive and Gram negative bacteria, Gram positive bacteria (with a thicker peptidoglycan layer) retain crystal violet stain during the decolorization process, while Gram negative bacteria lose the crystal violet stain and are instead stained by the safranin in the final staining process. The process involves three steps:

  1. Cells are stained with crystal violet dye. Next, a Gram's iodine solution (iodine and potassium iodide) is added to form a complex between the crystal violet and iodine. This complex is a larger molecule than the original crystal violet stain and iodine and is insoluble in water.
  2. A decolorizer such as ethyl alcohol or acetone is added to the sample, which dehydrates the peptidoglycan layer, shrinking and tightening it. The large crystal violet-iodine complex is not able to penetrate this tightened peptidoglycan layer, and is thus trapped in the cell in Gram positive bacteria. Conversely, the the outer membrane of Gram negative bacteria is degraded and the thinner peptidoglycan layer of Gram negative cells is unable to retain the crystal violet-iodine complex and the color is lost.
  3. A counterstain, such as the weakly water soluble safranin, is added to the sample, staining it red. Since the safranin is lighter than crystal violet, it does not disrupt the purple coloration in Gram positive cells. However, the decolorized Gram negative cells are stained red.

Ao controle

Antibiotic Treatment

Penicillin remains the drug of choice for S pyogenes . It is safe, inexpensive, and of narrow spectrum, and there is no direct or indirect evidence of loss of efficacy. Prior to the 1990's, S pneumoniae was also uniformly sensitive to penicillin but a recent abrupt shift in the usefulness of penicillin has occurred. The group D enterococci are resistant to penicillins, including penicillinase-resistant penicillins such as methicillin, nafcillin, dicloxacillin, and oxacillin, and are becoming increasingly resistant to many other antibiotics. Group B streptococci are often resistant to tetracycline but remain sensitive to the clinically achievable blood levels of penicillin, even though they have penicillin minimal inhibitory concentrations (MIC) considerably higher than those of S pyogenes . Although the duration of penicillin therapy varies with the degree of invasiveness, streptococcal pharyngitis is generally adequately treated with 10 days of antibiotic therapy, and pneumococcal pneumonia with 7-14 days. If penicillin allergy occurs, an alternative drug for treating pharyngitis is erythromycin, although sporadic erythromycin and tetracycline resistance has been reported, leaving clindamycin or the newer macrolides as possible treatments. The most important goal of therapy in acute streptococcal pharyngitis is still to prevent rheumatic fever. However, therapy also hastens clinical recovery, avoids suppurative complications and renders the patient non-infectious for others. In addition to antibiotics, the patient with S pyogenes myositis or necrotizing fasciitis requires surgical debridement. Lifelong prophylaxis against recurrences of rheumatic fever is achieved with long-acting penicillin or erythromycin. Sulfonamides will not eradicate the streptococcus and thus are not acceptable therapy for streptococcal pharyngitis, but sulfadiazine is effective for preventing recurrent attacks of rheumatic fever. Additional prophylactic coverage before some dental and surgical procedures is necessary in the presence of rheumatic heart disease or prosthetic heart valves. Although streptococcal pharyngitis is usually a benign, self-limited disease, therapy is important to prevent rheumatic fever. There is no convincing evidence that antibiotic therapy prevents glomerulonephritis. Disconcertingly, some patients in recent outbreaks of acute rheumatic fever do not give a history of preceding pharyngitis.

Methods of treating the asymptomatic pharyngeal carrier of S pyogenes remain controversial. Recent evidence suggests that up to 20% of children and young adults are carriers, the carrier state involves no risk to the carrier or to others, and it is frequently difficult to eradicate despite the exquisite sensitivity of the organism to penicillin in vitro. A similar failure of antibiotic therapy to eradicate nasopharyngeal carriage or to prevent reinfection with S pneumoniae also occurs.

Although antibiotic resistance in S pneumoniae is common in many parts of the world, in the United States such strains previously had a geographically limited focus. Recent widespread emergence of S pneumoniae resistant to penicillin and other antibiotics has become a microbial threat in the United States as well. Even cefotaxime and ceftriaxone resistance has been documented. Isolates must be carefully screened for susceptibility by oxacillin disc testing, with definitive MIC determination by the E test (A B Biodisk NA, Piscataway, NJ), a convenient and reliable method for detection of resistance to penicillin and extended spectrum cephalosporins.

It is inappropriate to universally treat of pregnant women who are carriers of group B streptococci, or their colonized neonates, for several reasons: the high carrier rate cost the associated high risk of penicillin hypersensitivity the potential increase in infections with penicillin-resistant organisms the difficulty in altering colonization of women (even when their sexual partners were also treated) and the low risk of neonatal disease. The controversy continues despite recent recommendations for universal screening of preg nant women and selective intrapartum chemoprophylaxis for screen-positive mothers with preterm labor, premature or prolonged rupture of membranes, fever in labor, multiple births or previous infants with group B streptococcal disease.

Clearly, penicillin has reduced the severe morbidity and mortality associated with S pneumoniae . The emergence of resistance has now forced re-evaluation of empiric therapy. Clinicians must report clusters of S pneumoniae infection and be aware of local patterns of resistance. Penicillin susceptible organisms show MICs ≤ 0.06 mg/ml, intermediate strains 0.1-1.0 mg/ml and high level resistant strains ≥ 2 mg/ml. For nonmeningeal infection by intermediate strains, parenteral penicillin at high dose can probably be used since the mechanism of resistance involves alteration in penicillin binding proteins (PBP) and saturation. For meningeal infection with intermediate strains or any infection by high level resistant strains only ceftriaxone and cefotaxime retain sufficient activity. Resistance even to these extended spectrum cephalosporins was first reported for the US in 1991. At this writing only vancomycin remains uniformly effective but as discussed below, its use incurs potential for selection of vancomycin resistant enterococci (VRE) or risk of transferring vancomycin resistance from enterococci to S pneumoniae .

Currently, no single agent is reliably bactericidal against enterococci. Serious infections with group D enterococci often require a classic synergistic regime combining penicillin or ampicillin with an aminoglycoside, designed to weaken the cell wall with the β-lactam and facilitate entry of the bacteriocidal aminoglycoside. Other β-lactam drugs with good activity against enterococci include piperacillin and imipenem. An alternate drug of choice is vancomycin, but vancomycin-resistant strains of enterococci have been isolated. Nosocomial acquisition of these resistant organisms is of grave concern.

This antibiotic resistance among the streptococci/enterococci is an increasing problem. Studies show that em vitro exchange of resistant DNA can occur in conjugation via plasmids and transposons, or in transduction with bacteriophages. The mechanisms involved in the na Vivo genetic exchange are not clearly defined. Evidence is accumulating that other streptococci may be the important donors of resistance markers. Transposon transfer is thought to be the most likely mechanism in S pneumoniae , although point mutations also occur. In the setting of heavy β-lactam use, selective pressure is important in emergence of resistant strains. The first penicillin-resistant S pneumoniae were reported in 1967 in Australia and in 1974 in North America. In New Guinea, where the first penicillin-resistant strains were reported in 1971, one-third of S pneumoniae isolates from patients with severe pneumococcal disease were resistant by 1978. In Hungary in 1992, 69% of S pneumoniae isolates were penicillin resistant. This resistance is not β-lactamase mediated but due to alteration in PBP which results in decreased binding of penicillin by the organism, rendering the drug less effective and requiring higher concentrations for saturation. Some strains resistant to erythromycin or tetracycline also have been reported, as well as some multiply resistant strains. In South Africa, outbreaks of infection with strains of S pneumoniae resistant to β-lactam antibiotics (penicillins and cephalosporins) as well as to tetracycline, chloramphenicol, erythromycin, streptomycin, clindamycin, sulfonamides, and rifampin were reported in 1977. Although antibiotic resistance among S pneumoniae was infrequent in the United States, a major shift occurred from 1988 to 1990, resulting in the present situation of 15-25% of S pneumoniae intermediately or completely resistant to penicillin. Communities with “low prevalence” have 5-10% resistance. Single or multiply resistant strains are transmitted person to person, especially in settings of frequent salivary exchange, antibiotic use and hand-to-hand transmission (as in day care centers) or of crowding (corrections facilities, homeless shelters, nursing homes, military training groups). Control of the problem of emerging, antibiotic-resistant S pneumoniae is multifactorial: 1) surveillance for clusters of invasive disease, resistance and prevalent serotypes 2) education of physicians and the public about antibiotic use (decrease unnecessary antibiotic use for obviously viral infections and decrease antibiotic prophylaxis for otitis by use of intermittent or expectant dosing or of non β-lactam based prophylaxissulfa. Use topical treatment for impetigo, and short course therapies and narrow spectrum antibiotics) 3) adherence to infection control strategies in day care centers 4) aggressive promotion of the current 23-valent S pneumoniae vaccine and support of efforts to design a new vaccine effective in those ς years of age, analogous to the eminently successful Haemophilus influenzae type B vaccine (see Ch. 30) where bacterial polysaccharide is conjugated to protein to elicit a T cell-dependent response.

Among the enterococci, resistance to a wide variety of common antibiotics has emerged, with some strains resistant to all currently available antibiotics. There is no clinically proven treatment effective against enterococci multiply resistant to lactams, aminoglycosides, and vancomycin. The emergence of such organisms poses a stunning management dilemma. Resistance among the enterococci can be either intrinsic or acquired (by de novo genetic mutation or acquisition of DNA from resistant organisms). Enterococcal resistance to lactams is also mediated by altered PBP as in pneumococci, allowing cell wall synthesis even in the presence of antibiotic, or much less commonly by β-lactamase. Resistance to aminoglycosides is mediated by decreased uptake or aminoglycoside modifying enzymes, and to vancomycin by decreased cell wall affinity for glycopeptide antibiotics. Further research into the mechanisms of resistance and new class(es) of antibiotics is essential.

A final concern about emerging resistance among the enterococci is the potential for genetic transfer of resistance genes to more virulent pathogens: Staph aureus , S pneumoniae and even Gram-negative organisms. So significant is this threat of emerging enterococcal resistance that the Centers for Disease Control and Prevention has issued a document addressing national guidelines. These include recommendations for 1) education of physicians and the public about the impact of vancomycin resistant enterococci (VRE), 2) vigilant surveillance for and detection of VRE, 3) strict enforcement of infection control strategies in hospitals, and 4) prudent vancomycin use or monotherapeutic use of extended spectrum cephalosporins. In a recent study of vancomycin use in US hospitals, use was about equally divided for treatment of a specific isolate, for prophylaxis, and for empiric coverage. The recommendations discourage vancomycin use for routine surgical prophylaxis, empiric prophylaxis in the patient with febrile neutropenia, the low birth weight infant or patients with vascular or peritoneal catheters, treatment of a single blood culture positive for coagulase-negative staphylococci, primary treatment of antibiotic-associated colitis, attempted eradication of colonization by methicillin-resistant Staph aureus (MRSA), or selective decontamination of the gastrointestinal tract.

Vacinação

As chemotherapeutic management becomes more difficult because of the threat of resistance, prevention becomes more important. With the introduction of antibiotics, previously successful pneumococcal vaccines fell into disuse. However, although prompt treatment with antibiotics has reduced the serious consequences of S pneumoniae infections (pre-antibiotic mortality rate of 30%), the disease incidence remains unchanged, and attention has been redirected to vaccines for S pneumoniae as well as for other streptococci. Pneumococcal vaccines (containing the pneumococcal polysaccharides of the most prevalent serotypes) have been licensed in several countries, including the United States. Initial use shows them to be useful and safe, but they remain under-utilized. The spectre of multidrug resistant S pneumoniae may provide a new incentive for their use. In 1983, the United States Food and Drug Administration licensed a vaccine containing 23 serotypes, representing coverage against nearly 89% of the pneumococcal isolates submitted to the CDC in the 1987-1988 National Surveillance Study. The population target of pneumococcal vaccines includes those at high risk for serious pneumococcal disease: the elderly (65 and older) and children (2 years of age and older) with sickle cell anemia, with an immunocompromised state (lymphoma, asplenia, myeloma, acquired immunodeficiency syndrome), with nephrotic syndrome, or with chronic cardiopulmonary disease. Vaccines for the other streptococci remain experimental.

Vaccine production for the streptococci presents several formidable problems. For both S pyogenes e S pneumoniae , a large number of serotypes must be included in effective vaccines since successful selection of a common epitope remains elusive. Continuing surveillance to determine prevalent serotypes is necessary to insure that the vaccine formulations remain appropriate. Para S pyogenes , it is critical to determine rheumatogenic and nephritogenic strains to limit the required multivalency of the vaccines. Alternatively a newly described conserved portion of M protein is a distant goal. Toxicity has been associated with M protein preparations, but lack of immunogenicity in highly purified preparations of antigens is still a problem. With streptococcal vaccines, the potential risk of antigenic cross-reactivity with cardiac tissue and an associated increased risk of acute rheumatic fever must be appreciated.

In group B neonatal disease chemoprophylaxis does not appear as practical as vaccine control. Passive immunity in group B streptococcal neonatal infection appears protective. Polyvalent hyperimmune gamma globulin and human monoclonal IgM antibody which reacts with multiple serotypes are undergoing efficacy studies. Active immunization of pregnant women with undegraded sialic acid-containing polysaccharide group B antigens is another important aspect of control.

The streptococci are ubiquitous, and their significance in medicine is remarkable. Exciting advances are being made in diagnosis and in understanding the mechanisms of pathogenesis, as well as in control of these well-known organisms. Problems with antibiotic resistance must preclude complacency in dealing with these common pathogens.